Nature.com saytiga tashrif buyurganingiz uchun tashakkur. Siz foydalanayotgan brauzer versiyasi cheklangan CSS-ni qo'llab-quvvatlaydi. Eng yaxshi tajriba uchun yangilangan brauzerdan foydalanishni tavsiya qilamiz (yoki Internet Explorer-da Moslik rejimini o'chirib qo'ying). Shu bilan birga, doimiy qo'llab-quvvatlashni ta'minlash uchun biz saytni uslublarsiz va JavaScript-ni ishlatmasdan taqdim etamiz.
Dori sinovlari uchun yurakning fiziologik muhitini aniq takrorlay oladigan ishonchli in vitro tizimiga ehtiyoj bor. Insonning yurak to'qimalari madaniyati tizimlarining cheklangan mavjudligi yurak dori ta'sirining noto'g'ri talqin qilinishiga olib keldi. Bu erda biz yurak bo'laklarini elektromexanik ravishda rag'batlantiradigan va yurak siklining sistolik va diastolik fazalarida fiziologik cho'zilishdan o'tadigan yurak to'qimalari madaniyati modelini (CTCM) ishlab chiqdik. 12 kunlik madaniyatdan so'ng, bu yondashuv yurak bo'limlarining hayotiyligini qisman yaxshiladi, ammo ularning strukturaviy yaxlitligini to'liq saqlamadi. Shuning uchun, kichik molekulalarni skriningdan so'ng, biz muhitga 100 nM triiodotironin (T3) va 1 mkM deksametazon (Dex) qo'shilishi 12 kun davomida bo'limlarning mikro tuzilishini saqlab qolganligini aniqladik. T3/Dex davolash bilan birgalikda CTCM tizimi 12 kun davomida yangi yurak to'qimalari bilan bir xil darajada transkripsiya profillarini, hayotiyligini, metabolik faolligini va tizimli yaxlitligini saqlab qoldi. Bundan tashqari, madaniyatda yurak to'qimalarining haddan tashqari cho'zilishi gipertrofik yurak signalizatsiyasini keltirib chiqaradi, bu CTCMning yurak cho'zilishi natijasida kelib chiqqan gipertrofik sharoitlarni taqlid qilish qobiliyatiga dalil beradi. Xulosa qilib aytganda, CTCM uzoq vaqt davomida madaniyatda yurak fiziologiyasi va patofiziologiyasini modellashtirishi mumkin, bu esa ishonchli dori skriningini ta'minlaydi.
Klinik tadqiqotlardan oldin inson qalbining fiziologik muhitini aniq takrorlay oladigan ishonchli in vitro tizimlar kerak. Bunday tizimlar o'zgartirilgan mexanik streç, yurak urish tezligi va elektrofizyologik xususiyatlarga taqlid qilishi kerak. Hayvon modellari odatda yurak fiziologiyasi uchun skrining platformasi sifatida foydalaniladi, bunda inson yuragiga dori ta'sirini aks ettirishda ishonchliligi cheklangan1,2. Oxir oqibat, ideal yurak to‘qimalari madaniyati eksperimental modeli (CTCM) inson yuragi fiziologiyasi va patofiziologiyasini to‘g‘ri aks ettiruvchi, turli terapevtik va farmakologik aralashuvlar uchun juda sezgir va o‘ziga xos modeldir3. Bunday tizimning yo'qligi yurak etishmovchiligini davolashning yangi usullarini kashf qilishni cheklaydi4,5 va bozordan chiqishning asosiy sababi sifatida dori kardiotoksikligiga olib keldi6.
So'nggi o'n yil ichida sakkizta yurak-qon tomir bo'lmagan dori klinik foydalanishdan olib tashlandi, chunki ular qorincha aritmiyalari va to'satdan o'limga olib keladigan QT intervalining uzayishiga olib keladi7. Shunday qilib, yurak-qon tomir tizimining samaradorligi va toksikligini baholash uchun ishonchli preklinik skrining strategiyalariga ehtiyoj ortib bormoqda. Yaqinda inson tomonidan ishlab chiqarilgan pluripotent ildiz hujayralaridan olingan kardiomiotsitlardan (hiPS-CM) dori skriningi va toksikligini tekshirishda foydalanish ushbu muammoni qisman hal qiladi. Biroq, hiPS-CMlarning etuk bo'lmagan tabiati va yurak to'qimalarining ko'p hujayrali murakkabligi yo'qligi bu usulning asosiy cheklovlaridir. So'nggi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, o'z-o'zidan qisqarish boshlanganidan ko'p o'tmay yurak to'qimalarining gidrogellarini hosil qilish uchun erta hiPS-CM dan foydalanish va vaqt o'tishi bilan asta-sekin elektr stimulyatsiyasini oshirish orqali bu cheklovni qisman bartaraf etish mumkin. Biroq, bu hiPS-CM mikroto'qimalari kattalar miokardining etuk elektrofiziologik va kontraktil xususiyatlariga ega emas. Bundan tashqari, inson yurak to'qimasi hujayradan tashqari matritsa oqsillarining o'ziga xos to'plamlari bilan o'zaro bog'langan endotelial hujayralar, neyronlar va stromal fibroblastlarni o'z ichiga olgan turli xil hujayra turlarining geterogen aralashmasidan iborat bo'lgan murakkabroq tuzilishga ega. Voyaga etgan sutemizuvchilarning yuragidagi kardiomiotsit bo'lmagan populyatsiyalarning bu heterojenligi11,12,13 alohida hujayra turlaridan foydalangan holda yurak to'qimasini modellashtirish uchun asosiy to'siqdir. Ushbu asosiy cheklovlar fiziologik va patologik sharoitlarda buzilmagan miokard to'qimalarini etishtirish usullarini ishlab chiqish muhimligini ta'kidlaydi.
Inson qalbining o'stirilgan yupqa (300 mkm) bo'laklari buzilmagan inson miyokardining istiqbolli modeli ekanligi isbotlangan. Bu usul insonning yurak to'qimalariga o'xshash to'liq 3D ko'p hujayrali tizimga kirishni ta'minlaydi. Biroq, 2019 yilgacha madaniyatli yurak bo'limlaridan foydalanish qisqa (24 soat) madaniyatning omon qolish muddati bilan cheklangan. Bu jismoniy-mexanik cho'zilishning yo'qligi, havo-suyuqlik interfeysi va yurak to'qimalarining ehtiyojlarini qo'llab-quvvatlamaydigan oddiy vositalardan foydalanish kabi bir qator omillarga bog'liq. 2019-yilda bir nechta tadqiqot guruhlari yurak toʻqimalari madaniyati tizimlariga mexanik omillarni kiritish madaniyat umrini uzaytirish, yurak ekspressiyasini yaxshilash va yurak patologiyasini taqlid qilish mumkinligini koʻrsatdi. 17 va 18-sonli ikkita oqlangan tadqiqotlar shuni ko'rsatadiki, bir eksenli mexanik yuklama madaniyat paytida yurak fenotipiga ijobiy ta'sir ko'rsatadi. Biroq, bu tadqiqotlar yurak siklining dinamik uch o'lchovli fizik-mexanik yuklanishidan foydalanmadi, chunki yurak bo'limlari izometrik kuchlanish kuchlari 17 yoki chiziqli auksotonik yuk 18 bilan yuklangan. To'qimalarni cho'zishning bu usullari ko'plab yurak genlarini bostirishga yoki g'ayritabiiy cho'zilish reaktsiyalari bilan bog'liq genlarning haddan tashqari ko'payishiga olib keldi. Ayniqsa, Pitoulis va boshqalar. 19 kuch o'zgartiruvchi qayta aloqa va kuchlanish drayverlari yordamida yurak siklini qayta tiklash uchun dinamik yurak tilim madaniyat vannasini ishlab chiqdi. Garchi ushbu tizim in vitro yurak siklini aniqroq modellashtirishga imkon beradi, ammo usulning murakkabligi va past o'tkazuvchanligi ushbu tizimni qo'llashni cheklaydi. Laboratoriyamiz yaqinda cho'chqa go'shti va inson yurak to'qimalari bo'limlarining hayotiyligini 6 kungacha saqlab turish uchun elektr stimulyatsiyasi va optimallashtirilgan vositadan foydalangan holda soddalashtirilgan madaniyat tizimini ishlab chiqdi20,21.
Joriy qo'lyozmada biz yurak tsikli davomida uch o'lchovli yurak fiziologiyasi va patofiziologik distenziyani takrorlash uchun gumoral signallarni o'z ichiga olgan cho'chqa yurak qismlaridan foydalangan holda yurak to'qimalari madaniyati modelini (CTCM) tasvirlaymiz. Ushbu CTCM klinikadan oldingi dori-darmonlarni tekshirish uchun sutemizuvchilar yuragi fiziologiyasi/patofiziologiyasini taqlid qiluvchi, tejamkor, o'rta o'tkazuvchan yurak tizimini ta'minlash orqali klinikagacha dori prognozining aniqligini hech qachon erishilmagan darajaga oshirishi mumkin.
Gemodinamik mexanik signallar in vitro 22,23,24 kardiyomiyositlar funktsiyasini saqlab turishda muhim rol o'ynaydi. Hozirgi qo'lyozmada biz fiziologik chastotalarda (1,2 Gts, daqiqada 72 zarba) elektr va mexanik stimulyatsiyani qo'zg'atish orqali kattalar yurak muhitini taqlid qila oladigan CTCM (1a-rasm) ishlab chiqdik. Diastol paytida to'qimalarning haddan tashqari cho'zilishining oldini olish uchun to'qimalar hajmini 25% ga oshirish uchun 3D bosib chiqarish moslamasi ishlatilgan (1b-rasm). C-PACE tizimi tomonidan qo'zg'atilgan elektr tezligi yurak siklini to'liq takrorlash uchun ma'lumotlarni yig'ish tizimidan foydalangan holda sistoladan 100 ms oldin boshlash uchun vaqtga to'g'ri keldi. To'qimalarni madaniyati tizimi yuqori kamerada yurak bo'laklarining kengayishiga olib keladigan moslashuvchan silikon membranani davriy ravishda kengaytirish uchun dasturlashtiriladigan pnevmatik aktuatordan (LB Engineering, Germaniya) foydalanadi. Tizim tashqi havo liniyasiga bosim o'tkazgich orqali ulangan, bu bosimni (± 1 mmHg) va vaqtni (± 1 ms) aniq sozlash imkonini berdi (1c-rasm).
a To'qima bo'lagini ko'k rangda ko'rsatilgan 7 mm qo'llab-quvvatlovchi halqaga qurilmaning madaniyat kamerasi ichidagi mahkamlang. Madaniyat xonasi havo kamerasidan nozik moslashuvchan silikon membrana bilan ajratilgan. Oqishning oldini olish uchun har bir kamera orasiga qistirmani joylashtiring. Qurilmaning qopqog'ida elektr stimulyatsiyasini ta'minlaydigan grafit elektrodlari mavjud. b Katta to'qima qurilmasi, hidoyat halqasi va tayanch halqasining sxematik tasviri. To'qimalarining bo'laklari (jigarrang) qurilmaning tashqi chetidagi yivga joylashtirilgan hidoyat halqasi bilan katta o'lchamli qurilmaga joylashtiriladi. Qo'llanmadan foydalanib, yurak to'qimalarining bo'limiga to'qima akril yopishtiruvchi bilan qoplangan qo'llab-quvvatlash halqasini ehtiyotkorlik bilan joylashtiring. c Dasturlashtiriladigan pnevmatik aktuator (PPD) tomonidan boshqariladigan havo kamerasi bosimi funktsiyasi sifatida elektr stimulyatsiyasi vaqtini ko'rsatadigan grafik. Bosim sensorlari yordamida elektr stimulyatsiyasini sinxronlashtirish uchun ma'lumotlarni yig'ish qurilmasi ishlatilgan. Madaniyat kamerasidagi bosim belgilangan chegaraga yetganda, C-PACE-EM ga elektr stimulyatsiyasini boshlash uchun impuls signali yuboriladi. d Inkubator tokchasiga joylashtirilgan to'rtta CTCM tasviri. To'rtta qurilma bitta PPDga pnevmatik sxema orqali ulanadi va pnevmatik kontaktlarning zanglashiga olib keladigan bosimni nazorat qilish uchun bosim sezgichlari gemostatik klapanga kiritiladi. Har bir qurilma oltita to'qima bo'limini o'z ichiga oladi.
Bitta pnevmatik aktuator yordamida biz 4 ta CTCM qurilmasini boshqarishga muvaffaq bo'ldik, ularning har biri 6 ta to'qima bo'limini ushlab turishi mumkin edi (1d-rasm). CTCMda havo kamerasidagi havo bosimi suyuqlik kamerasidagi sinxron bosimga aylanadi va yurak bo'lagining fiziologik kengayishini keltirib chiqaradi (2a-rasm va 1-qo'shimcha film). 80 mm Hg da to'qimalarning cho'zilishini baholash. Art. to'qima bo'limlarining 25% ga cho'zilishini ko'rsatdi (2b-rasm). Ushbu foiz cho'zilishi yurak bo'limining normal kontraktilligi uchun 2,2-2,3 mkm bo'lgan fiziologik sarkomer uzunligiga to'g'ri kelishi ko'rsatilgan17,19,25. To'qimalarning harakati maxsus kamera sozlamalari yordamida baholandi (qo'shimcha 1-rasm). To'qimalar harakatining amplitudasi va tezligi (2c, d-rasm) yurak siklidagi cho'zilish va sistola va diastola vaqtidagi vaqtga to'g'ri keldi (2b-rasm). Yurak to'qimalarining qisqarish va bo'shashish vaqtida cho'zilishi va tezligi madaniyatda 12 kun davomida doimiy bo'lib qoldi (2f-rasm). Madaniyat paytida elektr stimulyatsiyasining kontraktillikka ta'sirini baholash uchun biz soyali algoritm yordamida faol deformatsiyani aniqlash usulini ishlab chiqdik (Qo'shimcha rasm 2a, b) va elektr stimulyatsiyasi bilan va bo'lmagan deformatsiyalarni ajrata oldik. Yurakning bir xil bo'limi (2f-rasm). Kesimning harakatlanuvchi hududida (R6-9) elektr stimulyatsiyasi paytida kuchlanish elektr stimulyatsiyasi bo'lmagan vaqtga qaraganda 20% yuqori edi, bu elektr stimulyatsiyasining qisqarish funktsiyasiga qo'shgan hissasini ko'rsatadi.
Havo kamerasi bosimi, suyuqlik kamerasi bosimi va to'qimalar harakati o'lchovlarining vakili izlari kamera bosimi suyuqlik kamerasi bosimini o'zgartirib, to'qima bo'lagining mos keladigan harakatiga sabab bo'lishini tasdiqlaydi. b foiz cho'zilishi (ko'k) foiz cho'zilishi (to'q sariq) ga mos keladigan to'qimalar bo'limlarining vakili izlari. c Kardiyak tilimning o'lchangan harakati o'lchangan harakat tezligiga mos keladi. (d) yurak bo'lagidagi tsiklik harakatning (ko'k chiziq) va tezlikning (to'q sariq nuqta chiziq) vakili traektoriyalari. e Tsikl vaqtining miqdori (n = 19 ta bo'lak, turli xil cho'chqalardan), qisqarish vaqti (n = 19 ta bo'lak), gevşeme vaqti (n = 19 ta bo'lak, turli xil cho'chqalardan), to'qimalar harakati (n = 25). tilim) / turli cho'chqalardan guruh), tepalik sistolik tezlik (n = 24 (D0), 25 (D12) tilim / turli xil cho'chqalardan guruh) va eng yuqori gevşeme tezligi (n = 24 (D0), 25 (D12) tilim / turli cho'chqalardan). Ikki dumli Studentning t-testi hech qanday parametrda sezilarli farqni ko'rsatmadi. f (qizil) va (ko'k) elektr rag'batlantirish holda to'qima bo'limlari vakili kibirli tahlil izlari, bir xil bo'limdan to'qima bo'limlari o'n mintaqaviy sohalarda. Pastki panellar turli bo'limlardan o'nta sohada elektr stimulyatsiyasi bo'lgan va bo'lmagan to'qimalar bo'limlaridagi kuchlanishdagi foiz farqining miqdorini ko'rsatadi. (Turli cho'chqalardan n = 8 bo'lak / guruh, Ikki dumli Student t-testi amalga oshiriladi; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (Turli cho'chqalardan n = 8 bo'lak / guruh, Ikki dumli Student t-testi amalga oshiriladi; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 srezov/gruppu ot raznyx sviney, provoditsya dvustoronniy t-kriteriy Styudenta; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = turli xil cho'chqalardan 8 bo'lim / guruh, ikki dumli Studentning t-testi; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 dín/lín，mēngčičičičičičiičičičičiičičičiičičiičičiiičiičiiiičnīnīn ；****p <0.0001，**p <0.01，**p <0.01，*5. （n = 8 dín/lín，mēngčičičičičičiičičičičiičičičiičičiičičiiičiičiiiičnīnīn ；****p <0.0001，**p <0.01，**p <0.01，*5. (n = 8 srezov/gruppu, ot raznyx sviney, dvustoronniy mezon Styudenta; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 bo'lim / guruh, turli xil cho'chqalardan, ikki dumli Student t-testi; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Xato satrlari o'rtacha ± standart og'ishni ifodalaydi.
Oldingi statik biomimetik yurak tilim madaniyati tizimimizda [20, 21] biz elektr stimulyatsiyasini qo'llash va vosita tarkibini optimallashtirish orqali yurak bo'laklarining hayotiyligini, funktsiyasini va strukturaviy yaxlitligini 6 kun davomida saqlab qoldik. Biroq, 10 kundan keyin bu ko'rsatkichlar keskin kamaydi. Biz avvalgi statik biomimetik madaniyat tizimimiz 20, 21 nazorat shartlarida (Ctrl) ekilgan bo'limlarga murojaat qilamiz va biz bir vaqtning o'zida mexanik va elektr stimulyatsiyasi (CTCM) ostida MC sharoitlari va madaniyat sifatida avval optimallashtirilgan vositamizdan foydalanamiz. chaqirdi. Birinchidan, biz elektr stimulyatsiyasisiz mexanik stimulyatsiya 6 kun davomida to'qimalarning hayotiyligini saqlab qolish uchun etarli emasligini aniqladik (Qo'shimcha rasm 3a, b). Qizig'i shundaki, STCM yordamida fizio-mexanik va elektr stimulyatsiyasining joriy etilishi bilan 12 kunlik yurak bo'limlarining hayotiyligi MTT tahlilida ko'rsatilganidek, MS sharoitida yangi yurak bo'limlaridagi kabi bir xil bo'lib qoldi, lekin Ctrl sharoitida emas (1-rasm). 3a). Bu shuni ko'rsatadiki, yurak siklini mexanik stimulyatsiya qilish va simulyatsiya qilish to'qimalarning bo'limlarini avvalgi statik madaniyat tizimimizda qayd etilganidan ikki baravar ko'proq vaqt davomida hayotiyligini saqlab turishi mumkin. Shu bilan birga, yurak troponin T va konneksin 43 ni immunobelinglash orqali to'qimalar bo'limlarining strukturaviy yaxlitligini baholash shuni ko'rsatdiki, konneksin 43 ifodasi MC to'qimalarida 12-kuni xuddi shu kundagi nazoratlarga qaraganda ancha yuqori edi. Biroq, bir xil konneksin 43 ifodasi va Z-disk shakllanishi to'liq saqlanmadi (3b-rasm). Biz to'qimalarning strukturaviy yaxlitligini aniqlash uchun sun'iy intellekt (AI) ramkasidan foydalanamiz26, troponin-T va konneksin bilan bo'yashga asoslangan tasvirga asoslangan chuqur o'rganish quvuri43, yurak bo'laklarining strukturaviy yaxlitligi va floresansini lokalizatsiya kuchi nuqtai nazaridan avtomatik ravishda aniqlash uchun. Ushbu usul ma'lumotnomada ta'riflanganidek, yurak to'qimalarining tizimli yaxlitligini avtomatlashtirilgan va xolis tarzda ishonchli aniqlash uchun Konvolyutsion Neyron Tarmoq (CNN) va chuqur o'rganish tizimidan foydalanadi. 26. MC to'qimasi statik nazorat bo'limlari bilan solishtirganda 0-kunga nisbatan yaxshilangan strukturaviy o'xshashlikni ko'rsatdi. Bundan tashqari, Massonning trikromli bo'yalishi, madaniyatning 12-kunidagi nazorat sharoitlariga nisbatan MS sharoitida fibrozning sezilarli darajada past foizini aniqladi (3c-rasm). CTCM yurak to'qimalari bo'limlarining yashovchanligini 12-kuni yangi yurak to'qimalariga o'xshash darajaga oshirgan bo'lsa-da, yurak bo'limlarining strukturaviy yaxlitligini sezilarli darajada yaxshilamadi.
Chiziqli grafikda yangi yurak tilimlari (D0) yoki yurak tilimlari madaniyatining 12 kun davomida statik kulturada (D12 Ctrl) yoki CTCMda (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC/gro) sinovi ANOVAg dan bir xilda farqlanadi; ####p <0,0001 D0 bilan solishtirganda va **p<0,01 D12 Ctrl bilan solishtirganda). Chiziqli grafik yangi yurak tilimlari (D0) yoki yurak tilimlari madaniyatining 12 kun davomida statik kulturada (D12 Ctrl) yoki CTCMda (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl ), 12 (D12 pi/MCgro) sinovidan farq qiladi; ####p <0,0001 D0 bilan solishtirganda va **p<0,01 D12 Ctrl bilan solishtirganda).gistogramma MTT yangi yurak bo'limlari (D0) yoki yurak bo'limlari madaniyatining 12 kun davomida statik madaniyatda (D12 nazorati) yoki CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 nazorati). ) ), 12 (D12 MC) bo'limlari / NOVA bo'limlari turli xil sinovlardan o'tkaziladi;####p < 0,0001 po sravneniyu s D0 va **p < 0,01 po sravneniyu s D12 Ctrl). ####p <0,0001 D0 bilan solishtirganda va **p<0,01 D12 Ctrl bilan solishtirganda). a língíngíngíngíníngínínín (D12 Ctrl) líCTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) yíngíngín (D0) 或心脏切片培养 12 天的 MTT 活力的量化), 来自不同猪的 12 (D12 MC) 切片 / 组, 进行单向 Anova mēngčičiD0 dēngči，####p < 0,0001， d12 Ctrl yēi，**p < 0,01)。 a língíngíngíngíníngínínín (D12 Ctrl) líCTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) yíngíngín (D0) ，mēngčičiči12 (D12 MC) dēngči/lín，lēngčičičANOVA língčičiči D0 língínčii, ####p CI 211D ， míi，**p。)12 kun davomida statik madaniyatda (D12 nazorati) yoki CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 nazorati)), 12 (D12 MC) bo'limlari/guruhlari, turli ANOVA testlarida 12 kun davomida yetishtirilgan yurakning yangi qismlarida (D0) yoki yurak bo'limlarida MTT yashovchanligi miqdorini ko'rsatadigan gistogramma;####p < 0,0001 po sravneniyu s D0, **p < 0,01 po sravneniyu s D12 Ctrl). ####p < 0,0001 D0 ga nisbatan, **p < 0,01 D12 Ctrl ga nisbatan).b Troponin-T (yashil), konneksin 43 (qizil) va DAPI (ko'k) yurakning yangi ajratilgan qismlarida (D0) yoki statik sharoitlarda (Ctrl) yoki CTCM sharoitida (MC) 12 kun davomida ekilgan yurak bo'limlari) vakili immunofluoresans tasvirlari (bo'sh shkala = 100 mkm). Yurak to'qimalarining strukturaviy yaxlitligini sun'iy intellekt bilan aniqlash (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) tilim / guruhning har biri turli xil cho'chqalardan, bir tomonlama ANOVA testi o'tkaziladi; D0 va D0 va ****0 C1 ga nisbatan ####p < 0,0001. ****p <1.0). Yurak to'qimalarining strukturaviy yaxlitligini sun'iy intellekt miqdoriy aniqlash (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) tilim / guruh har xil cho'chqalardan, bir tomonlama ANOVA testi o'tkaziladi; ####p <0,0001, D0 va D 0,0 ****p <1 ga nisbatan). Kolichestvennaya otsenka strukturnoy selostnosti serdechnoy tkani iskusstvennym intellektom (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) srezov/grupp ot raznyx sviney, provoditsya odnofaktornyy test ANOVA provoditsya odnofaktornyy test ANOVA < s#0#0; ##0#0 ****p < 0,0001 po sravneniyu s D12 Ctrl). Yurak to'qimalarining strukturaviy yaxlitligini sun'iy intellekt (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) turli xil cho'chqalardan olingan bo'limlar/guruhlar, bir tomonlama ANOVA testi o'tkazildi; ####p <0,0001 va D0 va D0,0 ****0 bilan solishtirganda) miqdoriy aniqlash.n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) boʻlaklari/guruhlari har xil choʻchqalar, bir tomonlama ANOVA testi #0#0; líí，****p < 0,0001 d12 Ctrl líní）。n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) boʻlaklari/guruhlari har xil choʻchqalar, bir tomonlama ANOVA testi #0#0;#0. yD0jíí，****p < 0,0001 yD12 Ctrl míní）。 Iskusstvennyy intellekt uchun kolichestvennoy otsenki strukturnoy celostnosti serdechnoy tkani (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) srezov/gruppu kajdoy iz raznyx sviney, odnostorniy test ANOVA va boshqalar D##0#01; ##0#01 < 0,0001 po sravneniyu s D12 Ctrl). Yurak to'qimalarining strukturaviy yaxlitligini aniqlash uchun sun'iy intellekt (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) bo'limlari/guruhlari har xil cho'chqalar, bir tomonlama ANOVA testi; ####p<0,0001 va .D0 bilan solishtirish uchun D0120). c Masson trixromli dog'i bilan bo'yalgan yurak bo'laklari uchun vakillik tasvirlari (chapda) va miqdoriy aniqlash (o'ngda) (O'lchov yalang'och = 500 mkm) (n = 10 tilim/guruh har xil cho'chqalardan, bir tomonlama ANOVA testi o'tkaziladi; ####p < 0,0001 bilan solishtirganda D0 va ***0 bilan solishtirganda D1 <0. Ctrl). c Masson trixromli dog'i bilan bo'yalgan yurak bo'laklari uchun vakillik tasvirlari (chapda) va miqdorini aniqlash (o'ngda) (O'lchov yalang'och = 500 mkm) (n = 10 ta bo'lak/guruh har xil cho'chqalardan, bir tomonlama ANOVA testi o'tkaziladi; #### p < 0,0000 va D ***1 bilan solishtirganda. Ctrl). c Reprezentativnye izbrajeniya (sleva) va kolichestvennaya otsenka (sprava) srezov serdtsa, okrashennyx trixromnym krasitelem Massona (mashtab bez pokrytiya = 500 mkm) (n = 10 srezov/gruppu ot raznyx sviney, vypolniy test <#VA#; 0,0001 po sravneniyu s D0 i ***p < 0,001 po sravneniyu s D12 Ctrl). c Massonning trixrom bo'yog'i bilan bo'yalgan yurak bo'limlarining vakillik tasvirlari (chapda) va miqdorini aniqlash (o'ngda) (qoplanmagan shkala = 500 mikron) (n = 10 ta bo'lim / turli xil cho'chqalardan olingan, bir tomonlama ANOVA testi o'tkazildi; D0 va ***1 bilan solishtirganda #### p <0 .0001 C <0.10). c ljjjnjīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngīn（n（n（n（n（n（n（n（n（n（0µn 10 yjín/yín，míčičičičičičiičičičičičičiičičiičiičičičičičičang ANOVA yēngčii；#### p < 0,0001 yjnjjín 0.0001 yīd0 （0.01 djī*p Ctrl mímí）. C i masson y i l i l i l i l i l i l i 裸尺度 = 500 mkm) (N = 10 切片 切片 每 猪 猪 猪 猪 单向 单向 单向 单向 单向 单向测试; #### p < 0,0001 yD0 míi，***p < 0,001 y D12 Ctrl míní）。 c Reprezentativnye izobrajeniya (sleva) va kolichestvennyy analiz (sprava) srezov serdtsa, okrashennyx trixromnym krasitelem Massona (chistaya shkala = 500 mkm) (n = 10 srezov/gruppa, kajdir ot drugoy srezov/gruppa, proteschno srezov, protessochno proteschno) analiza ;### #p < 0,0001 po sravneniyu s D0, ***p < 0,001 po sravneniyu s D12 Ctrl). c Masson trikromli dog'i bilan bo'yalgan yurak bo'limlarining vakillik tasvirlari (chapda) va miqdoriy (o'ngda) (bo'sh = 500 mkm) (n = 10 ta bo'lim/guruh, har biri boshqa cho'chqadan, bir tomonlama dispersiya tahlili bilan sinovdan o'tgan ;### # p < 0,0001 ga nisbatan Dl0 ga nisbatan D1.0, ***p).Xato satrlari o'rtacha ± standart og'ishni ifodalaydi.
Biz madaniyat muhitiga kichik molekulalarni qo'shish orqali kardiyomiyositlar yaxlitligini yaxshilash va CTCM madaniyatida fibroz rivojlanishini kamaytirish mumkinligini taxmin qildik. Shuning uchun biz statik nazorat madaniyatlarimizdan foydalangan holda kichik molekulalarni skrining qildik20,21 kam sonli chalkash omillar tufayli. Ushbu ekran uchun deksametazon (Dex), triiodotironin (T3) va SB431542 (SB) tanlangan. Ushbu kichik molekulalar ilgari sarkomer uzunligi, T-naychalari va o'tkazuvchanlik tezligini oshirish orqali kardiyomiyositlarning kamolotini qo'zg'atish uchun hiPSC-CM madaniyatlarida ishlatilgan. Bundan tashqari, Dex (glyukokortikoid) va SB yallig'lanishni bostirishi ma'lum29,30. Shuning uchun biz ushbu kichik molekulalarning bir yoki kombinatsiyasining kiritilishi yurak bo'limlarining strukturaviy yaxlitligini yaxshilaydimi yoki yo'qligini sinab ko'rdik. Dastlabki skrining uchun har bir birikmaning dozasi odatda hujayra madaniyati modellarida (1 mkM Dex27, 100 nM T327 va 2,5 mkM SB31) qo'llaniladigan kontsentratsiyalar asosida tanlangan. 12 kunlik madaniyatdan so'ng, T3 va Dex kombinatsiyasi optimal kardiomiotsit strukturaviy yaxlitligiga va minimal tolali qayta qurishga olib keldi (Qo'shimcha 4 va 5-rasmlar). Bundan tashqari, T3 va Dex ning ikki yoki ikki baravar konsentratsiyasidan foydalanish normal konsentratsiyalarga nisbatan zararli ta'sir ko'rsatdi (Qo'shimcha rasm. 6a, b).
Dastlabki skriningdan so'ng biz 4 ta madaniyat sharoitini boshdan-oyoq taqqoslashni amalga oshirdik (4a-rasm): Ctrl: optimallashtirilgan vositamizdan foydalangan holda ilgari tasvirlangan statik madaniyatimizda o'stirilgan yurak bo'limlari; 20.21 TD: Chorshanba kuni T3 va Ctrl s qo'shilgan Dex; MC: ilgari optimallashtirilgan vositamizdan foydalangan holda CTCMda o'stirilgan yurak bo'limlari; va MT: vositaga qo'shilgan T3 va Dex bilan CTCM. 12 kunlik kultivatsiyadan so'ng, MS va MT to'qimalarining hayotiyligi MTT tahlili bilan baholangan yangi to'qimalarda bo'lgani kabi saqlanib qoldi (4b-rasm). Qizig'i shundaki, transwell madaniyatiga (TD) T3 va Dex qo'shilishi Ctrl sharoitlariga nisbatan hayotiylikning sezilarli yaxshilanishiga olib kelmadi, bu yurak bo'limlarining hayotiyligini saqlashda mexanik stimulyatsiyaning muhim rolini ko'rsatadi.
Mexanik stimulyatsiya va T3/Dex qo'shimchasining muhitga 12 kun davomida ta'sirini baholash uchun ishlatiladigan to'rtta madaniyat sharoitini tasvirlaydigan eksperimental dizayn diagrammasi. b Chiziqli grafikda barcha 4 madaniyat sharoitida (Ctrl, TD, MC va MT) yangi yurak bo'laklari (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD va D12 MT), 12 (D12 MC) sinovdan o'tkazilgan ANOVAg bo'laklari bilan solishtirganda, madaniyatdan keyingi 12 kun davomida yashovchanlik miqdori ko'rsatilgan; ####p <0,0001, ###p<0,001 D0 ga nisbatan va **p<0,01 D12 Ctrl ga nisbatan). b Chiziqli grafikda barcha 4 madaniyat sharoitida (Ctrl, TD, MC va MT) yangi yurak bo'laklari (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD va D12 MT), 12 (D12 MC) sinovdan o'tkazilgan ANOVAg bo'laklari bilan solishtirganda, madaniyatdan keyingi 12 kun davomida yashovchanlik miqdori ko'rsatilgan; ####p <0,0001, ###p<0,001 D0 bilan solishtirganda va **p<0,01 D12 ctrl bilan solishtirganda). b Gistogramma pokazyvaet kolichestvennuyu otsenku jiznesposobnosti cherez 12 dney posle kultivirovaniya vo vseh 4 usloviyax madaniyati (nazorat, TD, MC i MT) po sravneniyu so svejimi srezami serdtsa (D0) (n = 18) (D0, D12), TD i D12 MT), 12 (D12 MC) srezov/gruppu ot raznyx sviney, provoditsya odnostorniy test ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 po sravneniyu s D0 i **p sravneyul po < 0,01 str2). b Shtrixli grafikda barcha 4 madaniyat sharoitida (nazorat, TD, MC va MT) yangi yurak kesmalari (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD va D12 MT), 12 (D12 TD va D12 MT), 12 (D12 MC) bir xil ANOVA bo'limlari bilan solishtirganda (nazorat, TD, MC va MT) madaniyatdan keyingi 12 kunlik yashovchanlik miqdori ko'rsatilgan; D12 Ctrl bilan solishtirganda ####p <0,0001, ###p<0,001 va D0 va **p <0,01). b língjíngíngíní4 língíngínín（Ctrl、TD、MC MT） mēngjīngī(D0) (n = 18 (n = 18 (D12 Dl) 12Dl) TD d12 MT), mēngčičiči12 (D12 MC) yēngči/lín, lēngčičang ANOVA mínjčičijčijčičaNOVA；####p < 0.0001；####p < 0.0001（#0#0.0. líí，**p < 0.01 d12mínjín）。b 4 12 (D12 MC) b Gistogramma, pokazyvayushchaya vse 4 usloviya kultivirovaniya (kontrol, TD, MC i MT) po sravneniyu so svejimi srezami serdtsa (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD va D12 MT), ot raz12 vin srezy/gruppa, odnostorniy test ANOVA ####p <0,0001, ###p <0,001 po sravneniyu s D0, **p <0,01 po sravneniyu s kontrolem D12). b Yangi yurak bo'limlari (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD va D12 MT), turli cho'chqalardan 12 (D12 TD va D12 MT) bilan solishtirganda, barcha 4 madaniyat holatini (nazorat, TD, MC va MT) ko'rsatadigan gistogramma / guruh, bir tomonlama ANOVA testi #0 #0, #0; ###p<0,001 D0ga qarshi, **p<0,01 nazorat D12ga qarshi). c Chiziqli grafikda barcha 4 madaniyat sharoitida (Ctrl, TD, MC va MT) yangi yurak bo'laklari (D0) bilan solishtirganda madaniyatdan 12 kun o'tgach glyukoza oqimining miqdori ko'rsatilgan (n = 6 bo'lak / turli xil cho'chqalardan olingan guruh, bir tomonlama ANOVA testi o'tkaziladi; ###p < 0,001 va ***p <1, D0 bilan taqqoslaganda. Ctrl). c Chiziqli grafikda barcha 4 madaniyat sharoitida (Ctrl, TD, MC va MT) yangi yurak bo'laklari (D0) bilan solishtirganda madaniyatdan 12 kun o'tgach glyukoza oqimining miqdori ko'rsatilgan (n = 6 bo'lak / turli xil cho'chqalardan olingan guruh, bir tomonlama ANOVA testi o'tkaziladi; ###p < 0,001 va ***p <1, D0 bilan taqqoslaganda. Ctrl). c Gistogramma pokazyvaet kolichestvennuyu otsenku potoka glyukozy cherez 12 dney posle kultivirovaniya vo vsex 4 usloviyax kultivirovaniya (nazorat, TD, MC i MT) po sravneniyu so svejimi srezami serdtsa (D0) (n = 6 sm) Vypolnyaetsya test ANOVA; ###p < 0,001 po sravneniyu s D0 va ***p < 0,001 po sravneniyu s D12 Ctrl). c Gistogramma yangi yurak bo'limlari (D0) bilan solishtirganda barcha 4 madaniyat sharoitida (nazorat, TD, MC va MT) madaniyatdan keyingi 12 kun davomida glyukoza oqimining miqdorini ko'rsatadi (n = 6 bo'lim / turli xil cho'chqalardan olingan guruh, bir tomonlama ANOVA testi o'tkazildi; ###p < 0,001 D0 va ***0 C1 ga nisbatan D1. ***p
Yog 'kislotalarining oksidlanishidan glikolizga o'tishga metabolik bog'liqlik kardiomiotsitlar deferentsiyasining o'ziga xos belgisidir. Yetilmagan kardiomiotsitlar birinchi navbatda ATP ishlab chiqarish uchun glyukozadan foydalanadilar va bir nechta kristalli gipoplastik mitoxondriyalarga ega5,32. Glyukozadan foydalanish tahlillari shuni ko'rsatdiki, MC va MT sharoitida glyukozadan foydalanish 0 kunlik to'qimalarga o'xshash edi (4c-rasm). Biroq, Ctrl namunalari yangi to'qimalarga nisbatan glyukozadan foydalanishning sezilarli o'sishini ko'rsatdi. Bu shuni ko'rsatadiki, CTCM va T3 / Dex kombinatsiyasi to'qimalarning hayotiyligini oshiradi va 12 kunlik madaniyatli yurak bo'limlarining metabolik fenotipini saqlaydi. Bundan tashqari, kuchlanish tahlili shuni ko'rsatdiki, kuchlanish darajasi MT va MS sharoitida 12 kun davomida yangi yurak to'qimalarida bo'lgani kabi saqlanib qolgan (4d-rasm).
CTCM va T3 / Dex ning yurak tilim to'qimalarining global transkripsiyaviy landshaftiga umumiy ta'sirini tahlil qilish uchun biz barcha to'rt xil madaniyat sharoitidan yurak bo'laklarida RNAseqni o'tkazdik (Qo'shimcha ma'lumotlar 1). Qizig'i shundaki, MT bo'limlari yangi yurak to'qimalariga yuqori transkripsiyaviy o'xshashlikni ko'rsatdi, 13,642 gendan faqat 16 tasi differentsial tarzda ifodalangan. Biroq, avvalroq ko'rsatganimizdek, Ctrl tilimlari madaniyatda 10-12 kundan keyin 1229 ta differentsial tarzda ifodalangan genlarni ko'rsatdi (4e-rasm). Ushbu ma'lumotlar yurak va fibroblast genlarining qRT-PCR tomonidan tasdiqlangan (Qo'shimcha rasm 7a-c). Qizig'i shundaki, Ctrl bo'limlari yurak va hujayra sikli genlarining pastga regulyatsiyasini va yallig'lanish genlari dasturlarini faollashtirishni ko'rsatdi. Ushbu ma'lumotlar shuni ko'rsatadiki, odatda uzoq muddatli kultivatsiyadan keyin sodir bo'ladigan dedifferentsiya MT sharoitida to'liq zaiflashadi (Qo'shimcha rasm 8a, b). Sarkomer genlarini sinchkovlik bilan o'rganish shuni ko'rsatdiki, faqat MT sharoitida sarkomerni (4f-rasm) va ion kanalini (qo'shimcha 9-rasm) kodlovchi genlar saqlanib, ularni Ctrl, TD va MC sharoitida bostirishdan himoya qiladi. Ushbu ma'lumotlar shuni ko'rsatadiki, mexanik va gumoral stimulyatsiya (T3/Dex) kombinatsiyasi bilan yurak tilim transkriptomasi madaniyatda 12 kundan keyin yangi yurak bo'laklariga o'xshash bo'lib qolishi mumkin.
Ushbu transkripsiyaviy topilmalar yurak bo'limlaridagi kardiyomiyositlarning strukturaviy yaxlitligi MT sharoitida eng yaxshi 12 kun davomida saqlanib qolishi bilan qo'llab-quvvatlanadi, bu buzilmagan va lokalizatsiya qilingan konneksin 43 tomonidan ko'rsatilgan (5a-rasm). Bundan tashqari, MT sharoitida yurak bo'limlarida fibroz Ctrl bilan solishtirganda sezilarli darajada kamaydi va yurakning yangi qismlariga o'xshash (5b-rasm). Ushbu ma'lumotlar shuni ko'rsatadiki, mexanik stimulyatsiya va T3 / Dex bilan davolashning kombinatsiyasi madaniyatdagi yurak bo'limlarida yurak tuzilishini samarali saqlab qoladi.
a Troponin-T (yashil), konneksin 43 (qizil) va DAPI (ko'k) ning yangi ajratilgan yurak bo'limlarida (D0) yoki 12 kun davomida barcha to'rtta yurak bo'limi madaniyati sharoitida (shkala chizig'i = 100 mkm) ekilgan immunofluoresans tasvirlari. ). Yurak to'qimalarining strukturaviy yaxlitligini sun'iy intellekt bilan aniqlash (n = 7 (D0 va D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC va D12 MT) turli xil cho'chqalardan olingan bo'laklar / guruh, bir tomonlama ANOVA testi o'tkaziladi; ####p < 0,000 va *0 ga nisbatan D) <0,0****p < yoki D12 Ctrl bilan solishtirganda 0,0001). Yurak to'qimalarining strukturaviy yaxlitligini sun'iy intellekt yordamida aniqlash (n = 7 (D0 va D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC va D12 MT) turli xil cho'chqalardan olingan bo'laklar / guruh, bir tomonlama ANOVA testi o'tkaziladi; #### p < 0,000 va *0 ga nisbatan D) <0,0****p < yoki D12 Ctrl bilan solishtirganda 0,0001). Kolichestvennaya otsenka strukturnoy celostnosti tkani serdtsa s pomoshchyu iskusstvennogo intellekta (n = 7 (D0 va D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC va D12 MT) srezov/gruppu ot fakultet sviney, proveden A# # # testi; 0,0001 po sravneniyu s D0 i *p < 0,05 yoki ****p < 0,0001 po sravneniyu s D12 Ctrl). Sun'iy intellekt (n = 7 (D0 va D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC va D12 MT) bo'limlari / turli xil cho'chqalar guruhidan foydalangan holda yurak to'qimalarining strukturaviy yaxlitligini miqdoriy aniqlash, bir tomonlama ANOVA testi o'tkazildi; #### p <0.0001 bilan solishtirganda D****0 va *p <0. D12 Ctrl bilan solishtirganda 0,0001).díngíngííííííníínínínín = 7（D0（D12 Ctrl））,5（D12 TD, D12 MC d12 MT）jēngči/līngčičičičičičičičnīnīnčičičnčičanoVA līngčičiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiangANOVA #### p < 0.0001 yn D0 línglínjín 0****p <0. 0.0001 d12 Ctrl míní）。y y y y y y y y y y y y y y y n （n = 7 （d0 （ d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc ） 12 mc míngíííííí ííííílíníníííííníínínínínínínínínínínjíníní ； ######### p < 0,0001 yn D0 lílí*p < 0,05p 0.0001 d12 Ctrl míní）。Bir tomonlama ANOVA testi bilan turli xil cho'chqalarda (n = 7 (D0 va D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC va D12 MT) bo'limlari / guruhi) sun'iy intellekt yordamida yurak to'qimalarining strukturaviy yaxlitligini miqdoriy aniqlash;#### p < 0,0001 po sravneniyu s D0 i *p < 0,05 yoki ****p < 0,0001 po sravneniyu s D12 Ctrl). #### D0 bilan solishtirganda p <0,0001 va D12 Ctrl bilan solishtirganda *p <0,05 yoki ****p <0,0001). b Masson trixrom dog'i bilan bo'yalgan yurak bo'laklari uchun vakillik tasvirlari va miqdorini aniqlash (O'lchov chizig'i = 500 mkm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD va D12 MC), 9 (D12 MT) bo'lak/guruh turli cho'chqalardan #NOVA, bir yo'lda sinovdan o'tkazildi. D0 bilan solishtirganda 0,0001 va ***p <0,001 yoki D12 Ctrl bilan solishtirganda ****p <0,0001). b Masson trixrom dog'i bilan bo'yalgan yurak bo'laklari uchun vakillik tasvirlari va miqdorini aniqlash (O'lchov chizig'i = 500 mkm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD va D12 MC), 9 (D12 MT) bo'lak/guruh turli cho'chqalardan #NOVA, bir yo'lda sinovdan o'tkazildi. D0 bilan solishtirganda 0,0001 va ***p <0,001 yoki D12 Ctrl bilan solishtirganda ****p <0,0001). b Reprezentativnye izbrajeniya va kolichestvennaya otsenka srezov serdtsa, okrashennyx trixromnym krasitelem Massona (mashtabnaya lineyka = 500 mkm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD va D12 MTrazpu2 MC), 9 (srupxny) sviney, vypolnyaetsya odnostorniy test ANOVA ####p < 0,0001 po sravneniyu s D0 va ***p < 0,001 yoki ****p < 0,0001 po sravneniyu s D12 Ctrl). b Masson trixromli dog 'bilan bo'yalgan yurak bo'limlarining vakillik tasvirlari va miqdorini aniqlash (shkala chizig'i = 500 mkm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD va D12 MC), turli cho'chqalardan olingan 9 (D12 MT) bo'limlar/guruh, bir tomonlama ANOVA va ##00 va ##00 bilan bo'yalgan; ***p <0,001 yoki ****p<0,0001 va D12 Ctrl). b yjjjnjīngīngīngīngīngīngīngīngčičičičičičičičičičičičičičnčižnčičnčičnčižnčižnčičn = 500 µm）1（D1（D1） Ctrl、D12 TD d12 MC）， mēngčičnčičičn9 yī（ (D12 MT） mēngči/lín， lēngčičičnf#0#0#0. yD0 líí，***p < 0.001，mí****p < 0.0001 d12 Ctrl míi）。 b 用 Rasmon 三 色 色 色 色 色 色 色 色 色 色 色 色 色 色 色 色 色 色 色量化 色 色 (↓ ↑) (500 mkm) (n = 10 (D0, d12 ctrl 、 d12 td td d12 mc） mēngčičiči 9 d12 mt d12 mt chēngčičn ① ② ③ ④ 切片 切片 / 组, 进行单因素方差分析; #### p < 0,0001 yD0 míi，***p < 0,001，mí****p < 0,0001 yD12 Ctrl mínì）。 b Reprezentativnye izbrajeniya i kolichestvennaya otsenka srezov serdtsa, okrashennyh trixromom Massona (masshtabnaya lineyka = 500 mkm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD va D12 MC), 9 (D12 otsenka srezov serdtsa), 9 (D12 otsenka srezov) srazyx, sposob ANOVA; ####p < 0,0001 po sravneniyu s D0, ***p < 0,001 yoki ****p < 0,0001 po sravneniyu s D12 Ctrl). b Masson trikromi bilan bo'yalgan yurak bo'limlarining vakillik tasvirlari va miqdorini aniqlash (shkala chizig'i = 500 mkm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD va D12 MC), turli cho'chqalar/guruhlardan 9 (D12 MT) bo'limlari, bitta ANOVA usuli; ###0 bilan solishtirganda; ###0 ga ***1. D12 Ctrl bilan solishtirganda 0,001 yoki ****p < 0,0001).Xato satrlari o'rtacha ± standart og'ishni ifodalaydi.
Nihoyat, CTCM ning yurak gipertrofiyasini taqlid qilish qobiliyati yurak to'qimalarining cho'zilishini oshirish orqali baholandi. CTCMda havo kamerasining eng yuqori bosimi 80 mmHg dan 80 mmHg gacha ko'tarildi. Art. (oddiy streç) 140 mmHg gacha Art. (6a-rasm). Bu cho'zilishning 32% ga o'sishiga to'g'ri keladi (6b-rasm), u ilgari gipertrofiyada ko'rinadigan sarkomer uzunligiga erishish uchun yurak bo'limlari uchun zarur bo'lgan mos keladigan foiz cho'zilishi sifatida ko'rsatilgan. Kardiyak to'qimalarning qisqarishi va bo'shashishi paytida cho'zilishi va tezligi olti kunlik madaniyat davomida doimiy bo'lib qoldi (6c-rasm). MT sharoitidan yurak to'qimalari olti kun davomida normal streç (MT (Oddiy)) yoki haddan tashqari kuchlanish (MT (OS)) sharoitlariga duchor bo'ldi. Madaniyatda to'rt kun o'tgach, gipertrofik biomarker NT-ProBNP muhitda MT (OS) sharoitida MT (normal) sharoitlarga nisbatan sezilarli darajada ko'tarildi (7a-rasm). Bundan tashqari, olti kunlik kultivatsiyadan so'ng, MT (OS) dagi hujayra hajmi (7b-rasm) MT yurak (normal) bo'limlari bilan solishtirganda sezilarli darajada oshdi. Bundan tashqari, NFATC4 yadro translokatsiyasi haddan tashqari cho'zilgan to'qimalarda sezilarli darajada oshdi (7c-rasm). Ushbu natijalar giperdistenziyadan keyin patologik qayta qurishning progressiv rivojlanishini ko'rsatadi va CTCM qurilmasi cho'zilgan yurak gipertrofiyasi signalini o'rganish uchun platforma sifatida ishlatilishi mumkinligi haqidagi kontseptsiyani qo'llab-quvvatlaydi.
Havo kamerasi bosimi, suyuqlik kamerasi bosimi va to'qimalar harakati o'lchovlarining vakili izlari kamera bosimi suyuqlik kamerasi bosimini o'zgartirib, to'qima bo'lagining mos keladigan harakatiga sabab bo'lishini tasdiqlaydi. b Odatda cho'zilgan (to'q sariq) va haddan tashqari cho'zilgan (ko'k) to'qimalar bo'limlari uchun vakillik cho'zilish foizi va cho'zish tezligi egri chiziqlari. c Tsikl vaqtini ko'rsatadigan chiziqli grafik (n = 19 ta bo'lak, har xil cho'chqalar), qisqarish vaqti (n = 18-19 ta bo'lak, har xil cho'chqalar), gevşeme vaqti (n = 19 ta bo'lak, har bir guruh, turli cho'chqalar) ), to'qimalar harakati amplitudasi (n = 14, turli xil cho'chqalar), (n = 14 tilim / guruh, turli xil cho'chqalardan) va eng yuqori gevşeme tezligi (n = 14 (D0), 15 (D6)) bo'limlar / guruhlar) turli cho'chqalardan), ikki dumli Studentning t-testi hech qanday parametrda sezilarli farqni ko'rsatmadi, bu parametrlar 6 kunlik madaniyat davomida doimiy ravishda saqlanib qolganligini ko'rsatadi. Xato satrlari o'rtacha ± standart og'ishni ifodalaydi.
a MT normal cho'zilgan (Norm) yoki haddan tashqari cho'zilgan (OS) sharoitida (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm va D4 MTOS) bo'laklar/guruhlar bo'laklari ostida yetishtirilgan yurak bo'laklaridan olingan madaniyat muhitida NT-ProBNP kontsentratsiyasining shtrixli diagrammada miqdoriy ko'rsatkichi turli xil ANO01 bo'laklaridan amalga oshirildi. oddiy streç bilan solishtirganda). a MT normal cho'zilgan (Norm) yoki haddan tashqari cho'zilgan (OS) sharoitida (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm va D4 MTOS) bo'laklar/guruhlarda yetishtirilgan yurak tilimlaridan olingan madaniyat muhitidagi NT-ProBNP kontsentratsiyasining shtrixli diagrammada miqdoriy ko'rsatkichi, ikki yo'l bilan bajarilgan
Tarjima yurak-qon tomir tadqiqotlari yurak muhitini aniq takrorlaydigan uyali modellarni talab qiladi. Ushbu tadqiqotda yurakning ultra yupqa qismlarini rag'batlantirishi mumkin bo'lgan CTCM qurilmasi ishlab chiqilgan va tavsiflangan. CTCM tizimi fiziologik sinxronlashtirilgan elektromexanik stimulyatsiyani va T3 va Dex suyuqliklarini boyitishni o'z ichiga oladi. Cho'chqa yurak bo'limlari ushbu omillarga ta'sir qilganda, ularning hayotiyligi, strukturaviy yaxlitligi, metabolik faolligi va transkripsiya ifodasi 12 kunlik madaniyatdan keyin yangi yurak to'qimalarida bo'lgani kabi saqlanib qoldi. Bundan tashqari, yurak to'qimalarining haddan tashqari cho'zilishi giperekstantsiyadan kelib chiqqan yurakning gipertrofiyasiga olib kelishi mumkin. Umuman olganda, bu natijalar normal yurak fenotipini saqlashda fiziologik madaniyat sharoitlarining muhim rolini qo'llab-quvvatlaydi va dori skriningi uchun platforma yaratadi.
Ko'pgina omillar kardiyomiyositlarning ishlashi va omon qolishi uchun maqbul muhitni yaratishga yordam beradi. Ushbu omillarning eng aniqlari (1) hujayralararo o'zaro ta'sirlar, (2) elektromexanik stimulyatsiya, (3) gumoral omillar va (4) metabolik substratlar bilan bog'liq. Hujayra-hujayra o'rtasidagi fiziologik o'zaro ta'sir hujayradan tashqari matritsa tomonidan qo'llab-quvvatlanadigan bir nechta hujayra turlarining murakkab uch o'lchovli tarmoqlarini talab qiladi. Bunday murakkab hujayrali o'zaro ta'sirlarni alohida hujayra turlarini birgalikda etishtirish orqali in vitroda qayta tiklash qiyin, ammo yurak bo'limlarining organotipik tabiati yordamida osonlik bilan erishish mumkin.
Kardiyomiyositlarning mexanik cho'zilishi va elektr stimulyatsiyasi yurak fenotipini saqlash uchun juda muhimdir33,34,35. Mexanik stimulyatsiya hiPSC-CM konditsionerligi va etukligi uchun keng qo'llanilgan bo'lsa-da, yaqinda bir nechta oqlangan tadqiqotlar bir o'qli yuklash yordamida madaniyatda yurak bo'laklarini mexanik stimulyatsiya qilishga harakat qildi. Ushbu tadqiqotlar shuni ko'rsatadiki, 2D bir o'qli mexanik yuklama madaniyat paytida yurakning fenotipiga ijobiy ta'sir ko'rsatadi. Ushbu tadqiqotlarda yurak bo'limlari yo izometrik kuchlanish kuchlari17, chiziqli auksotonik yuklash18 bilan yuklangan yoki yurak sikli kuch o'zgartiruvchi qayta aloqa va kuchlanish drayverlari yordamida qayta yaratilgan. Biroq, bu usullar atrof-muhitni optimallashtirmasdan bir o'qli to'qimalarning cho'zilishidan foydalanadi, natijada ko'plab yurak genlarini bostiradi yoki g'ayritabiiy streç reaktsiyalari bilan bog'liq genlarning haddan tashqari ifodalanishiga olib keladi. Bu erda tasvirlangan CTCM tsikl vaqti va fiziologik cho'zilish (25% cho'zish, 40% sistola, 60% diastola va daqiqada 72 zarba) bo'yicha tabiiy yurak siklini taqlid qiluvchi 3D elektromexanik stimulyatorni ta'minlaydi. Ushbu uch o'lchovli mexanik stimulyatsiyaning o'zi to'qimalarning yaxlitligini saqlab qolish uchun etarli bo'lmasa-da, to'qimalarning hayotiyligi, funktsiyasi va yaxlitligini etarli darajada saqlab turish uchun T3/Dex yordamida gumoral va mexanik stimulyatsiyaning kombinatsiyasi talab qilinadi.
Humoral omillar kattalar yurak fenotipini modulyatsiya qilishda muhim rol o'ynaydi. Bu hujayra kamolotini tezlashtirish uchun madaniyat muhitiga T3 va Dex qo'shilgan HiPS-CM tadqiqotlarida ta'kidlangan. T3 aminokislotalar, shakar va kaltsiyni hujayra membranalari orqali tashishga ta'sir qilishi mumkin36. Bundan tashqari, T3 MHC-a ifodasini va MHC-b pastga regulyatsiyasini rag'batlantiradi, homila CMdagi sekin burish miofibrillari bilan solishtirganda etuk kardiyomiyositlarda tez burish miofibrillalarining shakllanishiga yordam beradi. Hipotiroid bilan og'rigan bemorlarda T3 etishmovchiligi miyofibrilyar bantlarning yo'qolishiga va ohang rivojlanishining pasayishiga olib keladi37. Dex glyukokortikoid retseptorlariga ta'sir qiladi va izolyatsiya qilingan perfuziyalangan yuraklarda miyokard kontraktiliyasini oshirishi ko'rsatilgan; 38, bu yaxshilanish kaltsiy konlariga asoslangan kirish (SOCE) 39,40 ta'siri bilan bog'liq deb hisoblanadi. Bundan tashqari, Dex o'z retseptorlari bilan bog'lanib, immun funktsiyasini va yallig'lanishni bostiradigan keng hujayra ichidagi javobni keltirib chiqaradi30.
Bizning natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, jismoniy mexanik stimulyatsiya (MS) Ctrl bilan solishtirganda umumiy madaniyat ko'rsatkichlarini yaxshilagan, ammo madaniyatda 12 kun davomida yashovchanlik, tizimli yaxlitlik va yurak ifodasini saqlab qolmagan. Ctrl bilan solishtirganda, CTCM (MT) madaniyatlariga T3 va Dex qo'shilishi yashovchanlikni oshirdi va 12 kun davomida yangi yurak to'qimalari bilan o'xshash transkripsiya profillarini, strukturaviy yaxlitlikni va metabolik faollikni saqlab qoldi. Bundan tashqari, to'qimalarning cho'zilish darajasini nazorat qilish orqali, STCM tizimining ko'p qirraliligini ko'rsatadigan STCM yordamida giperekstantsiyadan kelib chiqqan yurak gipertrofiyasi modeli yaratildi. Shuni ta'kidlash kerakki, yurakni qayta qurish va fibroz odatda aylanma hujayralari tegishli sitokinlarni, shuningdek, fagotsitoz va boshqa qayta qurish omillarini ta'minlay oladigan buzilmagan organlarni o'z ichiga olsa ham, yurakning bo'limlari stress va jarohatlarga javoban fibrotik jarayonni taqlid qilishi mumkin. miofibroblastlarga aylanadi. Bu ilgari ushbu yurak tilim modelida baholangan. Shuni ta'kidlash kerakki, CTCM parametrlari taxikardiya, bradikardiya va mexanik qon aylanishini qo'llab-quvvatlash (mexanik yuklanmagan yurak) kabi ko'plab sharoitlarni simulyatsiya qilish uchun bosim / elektr amplitudasi va chastotasini o'zgartirish orqali modulyatsiya qilinishi mumkin. Bu tizimni dori sinovlari uchun o'rtacha o'tkazuvchanlikka aylantiradi. CTCM ning haddan tashqari kuchlanish natijasida kelib chiqqan yurak gipertrofiyasini modellashtirish qobiliyati ushbu tizimni shaxsiylashtirilgan terapiya uchun sinab ko'rish uchun yo'l ochadi. Xulosa qilib aytadigan bo'lsak, ushbu tadqiqot shuni ko'rsatadiki, mexanik cho'zish va gumoral stimulyatsiya yurak to'qimalarining bo'limlari madaniyatini saqlab qolish uchun juda muhimdir.
Bu erda keltirilgan ma'lumotlar CTCM buzilmagan miyokardni modellashtirish uchun juda istiqbolli platforma ekanligini ko'rsatsa-da, bu madaniyat usuli ba'zi cheklovlarga ega. CTCM madaniyatining asosiy cheklovi shundaki, u dilimlarga uzluksiz dinamik mexanik stresslarni keltirib chiqaradi, bu esa har bir tsikl davomida yurak tilimlarining qisqarishini faol kuzatish imkoniyatini istisno qiladi. Bundan tashqari, yurak bo'limlarining kichik o'lchamlari (7 mm) tufayli an'anaviy kuch sezgichlari yordamida madaniyat tizimlaridan tashqarida sistolik funktsiyani baholash imkoniyati cheklangan. Joriy qo'lyozmada biz kontraktil funktsiyaning ko'rsatkichi sifatida optik kuchlanishni baholash orqali ushbu cheklovni qisman engib o'tamiz. Biroq, bu cheklov qo'shimcha ishni talab qiladi va kelajakda yurak bo'laklari funktsiyasini madaniyatda optik monitoring qilish usullarini joriy etish orqali hal qilinishi mumkin, masalan, kaltsiy va kuchlanishga sezgir bo'yoqlardan foydalangan holda optik xaritalash. CTCM ning yana bir cheklovi shundaki, ishchi model fiziologik stressni (oldindan va keyingi yuk) manipulyatsiya qilmaydi. CTCMda bosim juda katta to'qimalarda diastolada (to'liq cho'zilish) va sistolada (elektr stimulyatsiyasi paytida qisqarish uzunligi) 25% fiziologik cho'zilishni ko'paytirish uchun qarama-qarshi yo'nalishda bosim o'tkazildi. Kelgusi CTCM dizaynlarida ushbu cheklovni yurak to'qimalariga ikkala tomondan etarli bosim o'tkazish va yurak kameralarida yuzaga keladigan aniq bosim-hajm munosabatlarini qo'llash orqali olib tashlash kerak.
Ushbu qo'lyozmada xabar qilingan haddan tashqari kuchlanish tufayli qayta qurish gipertrofik giperstreç signallarini taqlid qilish bilan cheklangan. Shunday qilib, ushbu model gumoral yoki asab omillariga (bu tizimda mavjud bo'lmagan) ehtiyoj sezmasdan, cho'zilgan gipertrofik signalizatsiyani o'rganishda yordam berishi mumkin. CTCM ko'pligini oshirish uchun qo'shimcha tadqiqotlar talab etiladi, masalan, immun hujayralar bilan birgalikda etishtirish, aylanma plazmadagi gumoral omillar va neyron hujayralari bilan birgalikda etishtirishda innervatsiya CTCM bilan kasalliklarni modellashtirish imkoniyatlarini yaxshilaydi.
Ushbu tadqiqotda o'n uchta cho'chqa ishlatilgan. Hayvonlarning barcha protseduralari institutsional ko'rsatmalarga muvofiq amalga oshirildi va Louisville universiteti hayvonlarni parvarish qilish va foydalanish qo'mitasi tomonidan tasdiqlangan. Aorta yoyi klemplangan va yurak 1 L steril kardioplegiya bilan perfuziya qilingan (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/ml geparin, pH 7.7 gacha); yuraklar odatda <10 minut bo'lgan muz ustida laboratoriyaga olib ketilgunga qadar muzli kardioplegik eritmada saqlangan. yuraklar odatda <10 minut bo'lgan muz ustida laboratoriyaga olib ketilgunga qadar muzli kardioplegik eritmada saqlangan. serdtsa hranili v ledyanom kardioplegicheskom rastvore do transportirovki v laboratoriyayu na ldu, chto obychno zanimaet <10 min. yuraklar muzli kardioplegik eritmada muz ustida laboratoriyaga yetkazilgunga qadar saqlanadi, bu odatda <10 daqiqa davom etadi.língíngíngíngíngíngíngíníngínííníníníníníníníngíníníníngíníníngíngíníngíníníníníngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíng<10dínlíngíngíngíngíngíngíngíníngínííníníníníníníníngíníníníngíníníngíngíníngíníníníníngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíng<10dín Derjite serdtsa v ledyanoy kardioplegii do transportirovki v laboratoriyayu na ldu, obychno <10 min. Muz ustida laboratoriyaga olib borilgunga qadar yuraklarni muz kardioplegiyasida saqlang, odatda <10 min.
CTCM qurilmasi SolidWorks kompyuter quvvatli dizayn (SAPR) dasturida ishlab chiqilgan. Madaniyat kameralari, ajratgichlar va havo kameralari CNC shaffof akril plastmassadan tayyorlangan. 7 mm diametrli zaxira halqa markazda yuqori zichlikdagi polietilendan (HDPE) yasalgan va ostidagi muhitni muhrlash uchun ishlatiladigan silikon o-ringni joylashtirish uchun o-ring trubasiga ega. Yupqa silika membranasi madaniyat kamerasini ajratish plitasidan ajratib turadi. Silikon membrana 0,02 ″ qalinlikdagi silikon qatlamdan lazer bilan kesilgan va qattiqligi 35A ni tashkil qiladi. Pastki va yuqori silikon qistirmalari 1/16 ″ qalinlikdagi silikon qatlamdan lazer bilan kesilgan va qattiqligi 50A. Blokni mahkamlash va havo o'tkazmaydigan muhr yaratish uchun 316L zanglamaydigan po'latdan yasalgan vintlardek va qanotli yong'oqlar ishlatiladi.
Maxsus bosilgan elektron plata (PCB) C-PACE-EM tizimi bilan integratsiya qilish uchun mo'ljallangan. Shveytsariya mashinasi konnektorining PCBdagi rozetkalari grafit elektrodlariga kumush bilan qoplangan mis simlar va elektrodlarga vidalanadigan bronza 0-60 vintlar bilan ulanadi. Bosilgan elektron plata 3D printer qopqog'iga joylashtirilgan.
CTCM qurilmasi yurak aylanishiga o'xshash boshqariladigan qon aylanish bosimini yaratadigan dasturlashtiriladigan pnevmatik aktuator (PPD) tomonidan boshqariladi. Havo kamerasi ichidagi bosim oshgani sayin, moslashuvchan silikon membrana yuqoriga qarab kengayib, muhitni to'qima joyi ostida majburlaydi. Keyin to'qimalarning maydoni diastol paytida yurakning fiziologik kengayishiga taqlid qilib, suyuqlikni chiqarib yuborish orqali cho'ziladi. Gevşeme cho'qqisida grafit elektrodlari orqali elektr stimulyatsiyasi qo'llanildi, bu havo kamerasidagi bosimni pasaytirdi va to'qima bo'limlarining qisqarishiga olib keldi. Quvurning ichida havo tizimidagi bosimni aniqlash uchun bosim sensori bo'lgan gemostatik valf mavjud. Bosim sensori tomonidan sezilgan bosim noutbukga ulangan ma'lumot yig'uvchiga qo'llaniladi. Bu gaz kamerasi ichidagi bosimni doimiy ravishda kuzatib borish imkonini beradi. Kameraning maksimal bosimiga (standart 80 mmHg, 140 mmHg OS) erishilganda, ma'lumotlarni yig'ish qurilmasiga 4 V ga o'rnatilgan 2 ms uchun ikki fazali kuchlanish signalini yaratish uchun C-PACE-EM tizimiga signal yuborish buyurildi.
Yurak kesmalari olindi va 6 quduqda madaniyat sharoitlari quyidagicha amalga oshirildi: Yig'ilgan yuraklarni ko'chirish idishidan sovuq (4 ° C) kardioplegiya bo'lgan patnisga o'tkazing. Chap qorincha steril pichoq bilan ajratilgan va 1-2 sm3 bo'laklarga bo'lingan. Ushbu to'qima bloklari to'qimalarga yopishtiruvchi bilan biriktirilgan va Tyrode eritmasi va doimiy kislorodli (3 g / L 2,3-butandion monooksim (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g) . ), (6 mM 4 M 4 m), 6 mM 4 M Cl ni o'z ichiga olgan tebranish mikrotomli to'qimalar vannasiga joylashtirilgan. D-glyukoza (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M eritma), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml 1 M eritma), 1 L ddH2O gacha). Vibratsiyali mikrotom 80 Gts chastotada, gorizontal tebranish amplitudasi 2 mm va avans tezligi 0,03 mm/s bo'lgan 300 mkm qalinlikdagi bo'laklarni kesish uchun o'rnatildi. Eritmani salqin saqlash uchun to'qimalar hammomi muz bilan o'ralgan va harorat 4 ° C darajasida ushlab turilgan. Mikrotomli vannadan to'qimalarning bo'laklarini muz ustida doimiy kislorodli Tyrode eritmasi bo'lgan inkubatsiya vannasiga bitta kultura plitasi uchun etarli bo'lak olinmaguncha o'tkazing. Transwell kulturalari uchun to'qima bo'laklari steril 6 mm kenglikdagi poliuretan tayanchlarga biriktirildi va 6 ml optimallashtirilgan muhitga joylashtirildi (199 ta muhit, 1x ITS qo'shimchasi, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-ishqoriy va 2X antibiotik-antifungal). C-Pace orqali to'qima bo'limlariga elektr stimulyatsiyasi (10 V, chastotasi 1,2 Gts) qo'llanildi. TD sharoitlari uchun har bir muhit o'zgarishida 100 nM va 1 mkM da yangi T3 va Dex qo'shildi. O'rta kuniga 3 marta almashtirishdan oldin kislorod bilan to'yingan. To'qimalarning bo'laklari 37 ° C va 5% CO2 da inkubatorda o'stirildi.
CTCM madaniyatlari uchun to'qimalarning bo'limlari o'zgartirilgan Tyrode eritmasini o'z ichiga olgan Petri idishidagi maxsus tayyorlangan 3D printerga joylashtirildi. Qurilma yurak bo'lagi hajmini qo'llab-quvvatlash halqasi maydonining 25% ga oshirish uchun mo'ljallangan. Bu yurakning bo'limlari Tyrode eritmasidan muhitga o'tkazilgandan keyin va diastola vaqtida cho'zilmasligi uchun amalga oshiriladi. Histoakril elim yordamida 300 mkm qalinlikdagi qismlar diametri 7 mm bo'lgan qo'llab-quvvatlash halqasiga o'rnatildi. To'qima bo'laklarini qo'llab-quvvatlovchi halqaga biriktirgandan so'ng, ortiqcha to'qima bo'laklarini kesib oling va biriktirilgan to'qima qismlarini bitta qurilma uchun etarli bo'laklar tayyorlanmaguncha muz ustidagi Tyrode eritmasi hammomiga (4 ° C) joylashtiring. Barcha qurilmalar uchun umumiy ishlov berish vaqti 2 soatdan oshmasligi kerak. 6 ta to'qima bo'limi ularning qo'llab-quvvatlash halqalariga biriktirilgandan so'ng, CTCM qurilmasi yig'ildi. CTCM madaniyat xonasi 21 ml oldindan kislorodli muhit bilan oldindan to'ldirilgan. To'qima bo'laklarini madaniyat xonasiga o'tkazing va havo pufakchalarini pipetka bilan ehtiyotkorlik bilan olib tashlang. Keyin to'qima qismi teshikka yo'naltiriladi va muloyimlik bilan joyiga bosiladi. Nihoyat, elektrod qopqog'ini qurilmaga joylashtiring va qurilmani inkubatorga o'tkazing. Keyin CTCMni havo trubkasi va C-PACE-EM tizimiga ulang. Pnevmatik aktuator ochiladi va havo valfi CTCMni ochadi. C-PACE-EM tizimi 2 ms uchun ikki fazali pacing paytida 1,2 Gts chastotada 4 V kuchlanishni etkazib beradigan tarzda tuzilgan. Elektrodlarda grafit to'planishiga yo'l qo'ymaslik uchun vosita kuniga ikki marta almashtirildi va elektrodlar kuniga bir marta almashtirildi. Agar kerak bo'lsa, to'qimalarning bo'laklari ularning ostiga tushib qolgan havo pufakchalarini chiqarish uchun ularning madaniy quduqlaridan olib tashlanishi mumkin. MT davolash sharoitlari uchun T3/Dex 100 nM T3 va 1 mkM Dex bilan har bir vosita o'zgarishi bilan yangi qo'shildi. CTCM qurilmalari inkubatorda 37°C va 5% CO2 da yetishtirildi.
Yurak bo'laklarining cho'zilgan traektoriyalarini olish uchun maxsus kamera tizimi ishlab chiqilgan. SLR kamerasi (Canon Rebel T7i, Canon, Tokio, Yaponiya) Navitar Zoom 7000 18-108 mm makro linzalari (Navitar, San-Fransisko, Kaliforniya) bilan ishlatilgan. Vizualizatsiya muhitni yangi muhit bilan almashtirgandan so'ng xona haroratida amalga oshirildi. Kamera 51 ° burchak ostida joylashgan va video sekundiga 30 kadr tezlikda yozib olinadi. Birinchidan, ochiq kodli dasturiy ta'minot (MUSCLEMOTION43) yurak bo'laklarining harakatini aniqlash uchun Image-J bilan ishlatilgan. Niqob MATLAB (MathWorks, Natick, MA, AQSh) yordamida shovqindan qochish uchun yurak bo'laklarini urish uchun qiziqish hududlarini aniqlash uchun yaratilgan. Qo'lda segmentlangan niqoblar barcha tasvirlarga kadrlar ketma-ketligida qo'llaniladi va keyin MUSCLEMOTION plaginiga o'tkaziladi. Muscle Motion mos yozuvlar ramkasiga nisbatan harakatini miqdoriy baholash uchun har bir kadrdagi piksellarning o'rtacha intensivligidan foydalanadi. Ma'lumotlar yozib olingan, filtrlangan va sikl vaqtini hisoblash va yurak tsikli davomida to'qimalarning cho'zilishini baholash uchun ishlatilgan. Yozib olingan video birinchi darajali nol fazali raqamli filtr yordamida keyingi ishlov berildi. To'qimalarning cho'zilishi (cho'qqidan cho'qqigacha) miqdorini aniqlash uchun qayd etilgan signaldagi cho'qqilar va pastliklar o'rtasidagi farqni aniqlash uchun tepadan cho'qqigacha tahlil o'tkazildi. Bundan tashqari, signalning siljishini yo'q qilish uchun 6-tartibli polinom yordamida detrending amalga oshiriladi. Dastur kodi MATLAB-da global to'qimalar harakati, aylanish vaqti, bo'shashish vaqti va qisqarish vaqtini aniqlash uchun ishlab chiqilgan (Qo'shimcha dastur kodi 44).
Mexanik kuchlanishni baholash uchun yaratilgan bir xil videolardan foydalanib, kuchlanishni tahlil qilish uchun biz birinchi navbatda MUSCLEMOTION dasturiga muvofiq harakat cho'qqilarini (eng yuqori (yuqori) va eng past (pastki) harakat nuqtalari) ifodalovchi ikkita tasvirni kuzatdik. Keyin biz to'qima hududlarini segmentlarga ajratdik va segmentlangan to'qimalarga soyalash algoritmi shaklini qo'lladik (Qo'shimcha rasm 2a). Keyin segmentlangan to'qimalar o'nta er osti qatlamiga bo'lingan va har bir sirtdagi kuchlanish quyidagi tenglama yordamida hisoblangan: Strein = (Sup-Sdown)/Sdown, bu erda Sup va Sdown - mos ravishda matoning yuqori va pastki soyalaridan shaklning masofalari (Qo'shimcha rasm. .2b).
Yurak bo'limlari 48 soat davomida 4% paraformaldegidda o'rnatildi. Ruxsat etilgan to'qimalar 10% va 20% sukrozda 1 soat davomida, so'ngra 30% saxarozada bir kechada suvsizlandi. Keyin bo'limlar optimal kesish harorati aralashmasiga (OCT birikmasi) kiritildi va asta-sekin izopentan / quruq muz hammomida muzlatildi. OCT o'rnatish bloklarini ajratilgunga qadar -80 °C da saqlang. Slaydlar qalinligi 8 mkm bo'lgan qismlar sifatida tayyorlangan.
Yurak bo'limlaridan OKTni olib tashlash uchun slaydlarni isitish blokida 95 °C da 5 daqiqa qizdiring. Har bir slaydga 1 ml PBS qo'shing va xona haroratida 30 daqiqa davomida inkubatsiya qiling, so'ngra xona haroratida 15 daqiqa davomida PBSda 0,1% Triton-X ni o'rnatib, bo'limlarni o'tkazing. Spesifik bo'lmagan antikorlarning namunaga bog'lanishini oldini olish uchun slaydlarga 1 ml 3% BSA eritmasi qo'shing va xona haroratida 1 soat davomida inkubatsiya qiling. Keyin BSA olib tashlandi va slaydlar PBS bilan yuvildi. Har bir namunani qalam bilan belgilang. Birlamchi antikorlar (1% BSAda 1:200 nisbatda suyultirilgan) (konneksin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) va troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) 90 daqiqadan ko'proq vaqt davomida qo'shilgan (ikkinchi darajali antikorlar): 1% BSA) sichqonchaga qarshi Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079), quyonga qarshi Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) qo'shimcha 90 daqiqa PBS bilan 3 marta yuviladi dog 'qo'shildi va slaydlar vectashield (Vektor Laboratories) joylashtirildi va tirnoq lak -x kattalashtirish) va 40x kattalashtirish bilan Keyence mikroskop bilan muhrlangan.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) 5 mkg/ml PBS tarkibidagi WGA binoni uchun ishlatilgan va xona haroratida 30 daqiqa davomida mahkamlangan qismlarga qo'llangan. Keyin slaydlar PBS bilan yuvildi va har bir slaydga Sudan qora qo'shildi va 30 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. Keyin slaydlar PBS bilan yuvildi va vectashield joylashtirish vositasi qo'shildi. Slaydlar Keyens mikroskopida 40x kattalashtirishda ko'rsatildi.
Yuqorida aytib o'tilganidek, OCT namunalardan olib tashlandi. OKTni olib tashlaganingizdan so'ng, slaydlarni bir kechada Bouin eritmasiga botiring. Keyin slaydlar 1 soat davomida distillangan suv bilan yuviladi va keyin 10 daqiqa davomida Bibrich aloe kislotasi fuchsin eritmasiga joylashtiriladi. Keyin slaydlar distillangan suv bilan yuviladi va 5% fosfomolibden/5% fosfotungstik kislota eritmasiga 10 daqiqaga joylashtiriladi. Slaydlarni yuvmasdan, 15 daqiqa davomida to'g'ridan-to'g'ri anilin ko'k eritmasiga o'tkazing. Keyin slaydlar distillangan suv bilan yuviladi va 1% sirka kislotasi eritmasiga 2 daqiqa davomida joylashtiriladi. Slaydlar 200 N etanolda quritilgan va ksilenga o'tkazilgan. Bo'yalgan slaydlar 10x ob'ektiv bilan Keyence mikroskopi yordamida ingl. Fibroz maydoni foizi Keyence Analyzer dasturi yordamida aniqlangan.
CyQUANT™ MTT hujayra hayotiyligi tahlili (Invitrogen, Carlsbad, CA), katalog raqami V13154, ba'zi o'zgartirishlar bilan ishlab chiqaruvchining protokoliga muvofiq. Xususan, MTT tahlilida to'qimalarning bir xil o'lchamini ta'minlash uchun diametri 6 mm bo'lgan jarrohlik zarbasi ishlatilgan. To'qimalar ishlab chiqaruvchining protokoliga muvofiq MTT substratini o'z ichiga olgan 12 quduqli plastinkaning quduqlariga individual ravishda qo'yildi. Bo'limlar 37 ° C da 3 soat davomida inkubatsiya qilinadi va tirik to'qimalar MTT substratini metabolizatsiya qiladi va binafsha rangli formazan birikmasini hosil qiladi. MTT eritmasini 1 ml DMSO bilan almashtiring va yurak bo'limlaridan binafsha rangli formazanni olish uchun 37 ° C da 15 daqiqa davomida inkubatsiya qiling. Namunalar DMSO da 1:10 nisbatda 96 quduqli shaffof pastki plitalarda suyultirildi va binafsha rang intensivligi 570 nm da Cytation plate reader (BioTek) yordamida o'lchandi. O'qishlar yurakning har bir bo'lagining og'irligiga normallashtirildi.
Yurak tilim muhiti yuqorida tavsiflanganidek, glyukozadan foydalanish tahlili uchun 1 mCi/ml [5-3H]-glyukoza (Moravek Biochemicals, Brea, CA, AQSh) bo'lgan vosita bilan almashtirildi. 4 soatlik inkubatsiyadan so'ng, 100 mkl 0,2 N HCl bo'lgan ochiq mikrosentrifuga naychasiga 100 mkl muhit qo'shing. Keyin trubka 37°C da 72 soat davomida [3H]2O bug'lanishi uchun 500 mkl dH2O bo'lgan sintillyatsion trubaga joylashtirildi. Keyin mikrotsentrifuga trubkasini sintillyatsiya trubkasidan chiqarib oling va unga 10 ml sintillyatsion suyuqlik qo'shing. Sintilatsiyani hisoblash Tri-Carb 2900TR suyuqlik sintillash analizatori (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, AQSh) yordamida amalga oshirildi. Keyin glyukozadan foydalanish [5-3H]-glyukozaga xos faollik, to'liq bo'lmagan muvozanat va fon, [5-3H] ning etiketlanmagan glyukozaga suyultirilishi va sintilatsiyani hisoblagich samaradorligini hisobga olgan holda hisoblab chiqilgan. Ma'lumotlar yurak bo'limlari massasiga normallashtiriladi.
Trizolda to'qimalarni homogenlashtirgandan so'ng RNK ishlab chiqaruvchining protokoliga muvofiq Qiagen miRNeasy Micro Kit # 210874 yordamida yurak bo'limlaridan ajratildi. RNAsec kutubxonasini tayyorlash, tartiblash va ma'lumotlarni tahlil qilish quyidagicha amalga oshirildi:
RNK kutubxonasini tayyorlash uchun boshlang'ich material sifatida har bir namuna uchun 1 mkg RNK ishlatilgan. Sequencing kutubxonalari ishlab chiqaruvchining tavsiyalariga binoan Illumina (NEB, AQSH) uchun NEBNext UltraTM RNK kutubxonasini tayyorlash to'plami yordamida yaratildi va har bir namuna uchun atributlar ketma-ketligiga indeks kodlari qo'shildi. Qisqacha aytganda, mRNK poli-T oligonukleotidlari bilan biriktirilgan magnit boncuklar yordamida umumiy RNKdan tozalandi. Parchalanish NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buferida (5X) yuqori haroratda ikki valentli kationlar yordamida amalga oshiriladi. Birinchi zanjir cDNK tasodifiy hexamer primerlari va M-MuLV teskari transkriptaza (RNase H-) yordamida sintez qilindi. Keyin ikkinchi zanjir cDNK DNK polimeraza I va RNase H yordamida sintezlanadi. Qolgan o'simtalar ekzonukleaza/polimeraza faolligi bilan to'mtoq uchlarga aylanadi. DNK fragmentining 3' uchi adenilatsiya qilingandan so'ng, uni duragaylash uchun tayyorlash uchun unga soch turmagi halqasi tuzilishiga ega NEBNext adapteri biriktiriladi. Afzal uzunlikdagi cDNK fragmentlarini tanlash uchun 150-200 bp. kutubxona fragmentlari AMPure XP tizimi (Beckman Coulter, Beverli, AQSh) yordamida tozalandi. Keyin, adapter bilan bog'langan o'lchami tanlangan cDNKga ega 3 mkl USER fermenti (NEB, AQSh) PCRdan oldin 37 ° C da 15 daqiqa, so'ngra 95 ° C da 5 daqiqa davomida ishlatilgan. Keyin PCR Phusion High-Fidelity DNK polimeraza, universal PCR primerlari va Index (X) primerlari yordamida amalga oshirildi. Nihoyat, PCR mahsulotlari tozalandi (AMPure XP tizimi) va kutubxona sifati Agilent Bioanalyzer 2100 tizimida baholandi. Keyin cDNK kutubxonasi Novaseq sequencer yordamida ketma-ketlashtirildi. Illumina-dan olingan xom tasvir fayllari CASAVA Base Calling yordamida xom o'qishga aylantirildi. Xom ma'lumotlar o'qish ketma-ketligi va mos keladigan asosiy sifatlarni o'z ichiga olgan FASTQ(fq) formatidagi fayllarda saqlanadi. Filtrlangan ketma-ketlikni o'qishni Sscrofa11.1 mos yozuvlar genomiga moslashtirish uchun HISAT2 ni tanlang. Umuman olganda, HISAT2 har qanday o'lchamdagi genomlarni, shu jumladan 4 milliard bazadan katta genomlarni qo'llab-quvvatlaydi va ko'pgina parametrlar uchun standart qiymatlar o'rnatiladi. RNK Seq ma'lumotlaridan o'qishlarni ulash HISAT2 yordamida samarali tarzda moslashtirilishi mumkin, hozirda mavjud bo'lgan eng tezkor tizim, boshqa usullarga qaraganda bir xil yoki yaxshiroq aniqlik bilan.
Transkriptlarning ko'pligi genlarni ifodalash darajasini bevosita aks ettiradi. Genni ifodalash darajalari genom yoki ekzonlar bilan bog'liq bo'lgan transkriptlarning ko'pligi (ketmalash soni) bilan baholanadi. O'qishlar soni genlarni ifodalash darajalariga, gen uzunligiga va ketma-ketlik chuqurligiga mutanosibdir. FPKM (million tayanch juftiga ketma-ket tuzilgan transkriptning ming tayanch juftiga fragmentlar) hisoblab chiqilgan va DESeq2 to'plami yordamida differentsial ifodaning P-qiymatlari aniqlangan. Keyin biz o'rnatilgan R-funktsiyasi "p.adjust" asosida Benjamini-Xochberg usuli9 yordamida har bir P qiymati uchun noto'g'ri ochish tezligini (FDR) hisoblab chiqdik.
Yurak bo'limlaridan ajratilgan RNK Thermo (Thermo, kat. № 11756050) SuperScript IV Vilo Master aralashmasi yordamida 200 ng/ml konsentratsiyada cDNK ga aylantirildi. Miqdoriy RT-PCR Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-quduqli shaffof reaksiya plitasi (Thermo, cat. no. 4483319) va mikroampli optik yopishtiruvchi (Thermo, cat. no. 4311971) yordamida amalga oshirildi. Reaksiya aralashmasi 5 µl Taqman Fast Advanced Master aralashmasidan (Thermo, cat # 4444557), 0,5 µl Taqman Primer va har bir quduqqa aralashtirilgan 3,5 µl H2O dan iborat edi. Standart qPCR sikllari bajarildi va KT qiymatlari Applied Biosystems Quantstudio 5 real vaqtda PCR asbobi (384 quduqli modul; mahsulot № A28135) yordamida o'lchandi. Taqman primerlari Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (S81_m1), RGL1 (S811) dan sotib olindi. (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1 (Ss04323794_m1), ACTA245 ning ACTA245 qiymati barcha namunalar GAPDH uy xo'jaligi geniga normallashtirildi.
NT-ProBNP ning ommaviy axborot vositalarida chiqarilishi ishlab chiqaruvchining protokoliga muvofiq NT-ProBNP to'plami (cho'chqa) (kat. No. MBS2086979, MyBioSource) yordamida baholandi. Qisqacha aytganda, har bir quduqqa ikki nusxada har bir namuna va standartdan 250 µl qo‘shilgan. Namunani qo'shgandan so'ng darhol har bir quduqqa 50 µl tahlil reagenti A qo'shing. Plastinani muloyimlik bilan silkitib, plomba bilan yoping. Keyin planshetlar 1 soat davomida 37 ° C da inkubatsiya qilinadi. Keyin eritmani aspiratsiya qiling va quduqlarni 350 µl 1X yuvish eritmasi bilan 4 marta yuving, yuvish eritmasini har safar 1-2 daqiqa davomida inkubatsiya qiling. Keyin har bir quduqqa 100 µl tahlil reagenti B qo‘shing va plastinka plomba bilan yoping. Tabletka muloyimlik bilan silkitildi va 37 ° C da 30 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. Eritmani aspiratsiya qiling va quduqlarni 350 µl 1X yuvish eritmasi bilan 5 marta yuving. Har bir quduqqa 90 µl substrat eritmasi qo‘shing va plastinkani yoping. Plastinani 37 ° C da 10-20 daqiqa davomida inkubatsiya qiling. Har bir quduqqa 50 µl Stop eritmasi qo‘shing. Plastinka darhol 450 nm da o'rnatilgan Cytation (BioTek) plastinka o'quvchi yordamida o'lchandi.
5% I turdagi xatolik darajasi bilan parametrning 10% mutlaq o'zgarishini aniqlash uchun >80% quvvatni ta'minlaydigan guruh o'lchamlarini tanlash uchun quvvat tahlillari o'tkazildi. 5% I turdagi xatolik darajasi bilan parametrning 10% mutlaq o'zgarishini aniqlash uchun >80% quvvatni ta'minlaydigan guruh o'lchamlarini tanlash uchun quvvat tahlillari o'tkazildi. Analiz moschnosti by vypolnen uchun vybora razmerov guruhi, kotorye obespechat >80% moschnosti uchun obnarujeniya 10% absolyutnogo izmeniya parametra s 5% chastotoy oshibok tipi I. 5% I turdagi xatolik darajasi bilan 10% mutlaq parametr o'zgarishini aniqlash uchun >80% quvvatni ta'minlaydigan guruh o'lchamlarini tanlash uchun quvvat tahlili o'tkazildi.língǎngǎngǎngǎngǎngíngíngíngínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínmíi> 80fjnjngyngyjínjínjín 10％línjínjínjínė5％Ijíngíngíngíngíngíngínjín.língǎngǎngǎngǎngǎngíngíngíngínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínjínmíi> 80fjnjngyngyjínjínjín 10％línjínjínjínė5％Ijíngíngíngíngíngíngínjín. Byl proveden analiz moschnosti dlya vybora razmera gruppy, kotoryy obespechil by > 80% moschnosti uchun obnarujeniya 10% absolyutnogo izmeniya parametrov va 5% chastoty oshibok tipi I. 10% mutlaq parametr o'zgarishini va 5% turdagi I xatolik darajasini aniqlash uchun>80% quvvatni ta'minlaydigan guruh hajmini tanlash uchun quvvat tahlili o'tkazildi.Tajribadan oldin to'qimalarning bo'limlari tasodifiy tanlangan. Barcha tahlillar ko'r-ko'rona shart emas edi va namunalar barcha ma'lumotlar tahlil qilingandan keyingina dekodlangan. Barcha statistik tahlillarni amalga oshirish uchun GraphPad Prism dasturi (San-Diego, CA) ishlatilgan. Barcha statistik ma'lumotlar uchun p-qiymatlari <0,05 qiymatlarida muhim deb hisoblanadi. Barcha statistik ma'lumotlar uchun p-qiymatlari <0,05 qiymatlarda muhim deb hisoblanadi. Dlya vsey statistiki p-znacheniya schitalis znachimymi pri znacheniyax <0,05. Barcha statistik ma'lumotlar uchun p-qiymatlari <0,05 qiymatlarda muhim deb hisoblanadi.língíííííííí, p chíngíní<0.05 língíngíngíngíngíngíngíngíngíníng.língíííííííí, p chíngíní<0.05 língíngíngíngíngíngíngíngíngíníng. Dlya vsey statistiki p-znacheniya schitalis znachimymi pri znacheniyax <0,05. Barcha statistik ma'lumotlar uchun p-qiymatlari <0,05 qiymatlarda muhim deb hisoblanadi.Ikki dumli Studentning t-testi faqat 2 ta taqqoslash bilan ma'lumotlar bo'yicha o'tkazildi. Bir nechta guruhlar o'rtasidagi ahamiyatni aniqlash uchun bir tomonlama yoki ikki tomonlama ANOVA ishlatilgan. Post hoc testlarini o'tkazishda Tukeyning tuzatishi bir nechta taqqoslashlarni hisobga olish uchun qo'llanildi. RNAsec ma'lumotlari FDR va p.adjustni "Usullar" bo'limida tavsiflanganidek hisoblashda maxsus statistik mulohazalarga ega.
Tadqiqot dizayni haqida ko'proq ma'lumot olish uchun ushbu maqolaga havola qilingan Tabiatni o'rganish hisobotiga qarang.
Yuborilgan vaqt: 2022 yil 28-sentabr
