Cảm ơn bạn đã truy cập Nature.com. Phiên bản trình duyệt bạn đang sử dụng hỗ trợ CSS hạn chế. Để có trải nghiệm tốt nhất, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng trình duyệt cập nhật (hoặc tắt chế độ tương thích trong Internet Explorer). Trong thời gian chờ đợi, để đảm bảo tiếp tục được hỗ trợ, chúng tôi sẽ hiển thị trang web không có kiểu và JavaScript.
Hình thái ruột của con người thiết lập các tính năng mật mã nhung mao của vi kiến ​​trúc biểu mô 3D và tổ chức không gian. Cấu trúc độc đáo này là cần thiết để duy trì cân bằng nội môi ruột bằng cách bảo vệ hốc tế bào gốc trong mật mã cơ bản khỏi các kháng nguyên vi khuẩn ngoại sinh và các chất chuyển hóa của chúng. Đáng chú ý là ruột trên chip mô phỏng hữu cơ có thể tạo ra hình thái 3D tự phát của biểu mô ruột với các chức năng sinh lý và cơ chế sinh học được tăng cường. Ở đây, chúng tôi cung cấp một giao thức có thể tái sản xuất để tạo ra hình thái ruột một cách mạnh mẽ trong ruột trên chip vi lỏng cũng như trong chip lai nhúng Transwell. D hình thái và đặc tính của biểu mô 3D đã thiết lập bằng cách sử dụng nhiều phương thức hình ảnh. Giao thức này đạt được sự tái tạo cấu trúc vi mô đường ruột chức năng bằng cách kiểm soát dòng chất lỏng cơ bản trong 5 ngày. Phương pháp hình thái trong ống nghiệm của chúng tôi sử dụng ứng suất cắt và chuyển động cơ học phù hợp về mặt sinh lý và không yêu cầu thao tác hoặc kỹ thuật tế bào phức tạp, có thể vượt trội so với các kỹ thuật hiện có khác. ứng dụng dược phẩm.
Các thí nghiệm chứng minh rằng các tế bào Caco-2 biểu mô ruột được nuôi cấy trong các thiết bị vi lỏng 1,2,3,4,5 hoặc vi lỏng hai lớp6,7 có thể trải qua quá trình hình thành 3D tự phát trong ống nghiệm mà không cần hiểu rõ về cơ chế cơ bản. hữu cơ đường ruột.Các tế bào biểu mô đã được xác thực. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đặc biệt tập trung vào quá trình sản xuất tế bào và phân bố nồng độ của một chất đối kháng Wnt mạnh, Dickkopf-1 (DKK-1), trong ruột trên chip và các thiết bị vi lỏng đã được sửa đổi có chứa miếng chèn Transwell, được gọi là ” Chip lai”. sự phát sinh hình thái hoặc phá vỡ lớp biểu mô 3D đã được cấu trúc sẵn , gợi ý rằng stress đối kháng trong quá trình nuôi cấy chịu trách nhiệm cho sự phát sinh hình thái ruột trong ống nghiệm. Do đó, một cách tiếp cận thực tế để đạt được sự hình thành mạnh mẽ ở giao diện biểu mô là loại bỏ hoặc duy trì ở mức tối thiểu mức độ của chất đối kháng Wnt trong khoang đáy bằng cách chủ động xả (ví dụ: trong các nền tảng ruột trên chip hoặc lai trên chip) hoặc khuếch tán. Môi trường cơ bản (ví dụ: từ Transwell chèn vào đáy lớn hồ chứa trong giếng).
Trong giao thức này, chúng tôi cung cấp một phương pháp chi tiết để chế tạo vi thiết bị ruột trên chip và chip lai có thể chèn Transwell (bước 1-5) để nuôi cấy tế bào biểu mô ruột trên màng xốp dựa trên polydimethylsiloxane (PDMS) (bước 6A, 7A, 8, 9) hoặc màng polyester của miếng chèn Transwell (bước 6B, 7B, 8, 9) và tạo hình thái 3D trong ống nghiệm (bước 10). Chúng tôi cũng đã xác định các đặc điểm của tế bào và phân tử cho thấy sự hình thành mô đặc hiệu của mô và sự biệt hóa tế bào phụ thuộc vào dòng dõi bằng cách áp dụng nhiều phương thức hình ảnh (bước 11-24). Chúng tôi tạo ra hình thái bằng cách sử dụng các tế bào biểu mô ruột của con người, chẳng hạn như Caco-2 hoặc các cơ quan ruột, ở hai định dạng nuôi cấy với các chi tiết kỹ thuật bao gồm sửa đổi bề mặt của màng xốp, tạo ra các đơn lớp 2D, và sinh hóa đường ruột và Tái tạo môi trường vi mô cơ học.in vitro.Để hình thành hình thái 3D từ biểu mô 2D các lớp đơn lớp thelial, chúng tôi đã loại bỏ các chất đối kháng morphogen ở cả hai dạng nuôi cấy bằng cách đưa môi trường vào ngăn cơ bản của môi trường nuôi cấy. Cuối cùng, chúng tôi cung cấp một đại diện về tiện ích của lớp biểu mô 3D có thể tái tạo có thể được sử dụng để mô hình hóa sự phát triển của biểu mô phụ thuộc vào morphogen, đồng nuôi cấy hệ vi sinh vật chủ-máy chủ theo chiều dọc, nhiễm mầm bệnh, tổn thương do viêm, rối loạn chức năng hàng rào biểu mô và các liệu pháp dựa trên lợi khuẩn.
Giao thức của chúng tôi có thể hữu ích cho nhiều nhà khoa học trong nghiên cứu cơ bản (ví dụ: sinh học niêm mạc ruột, sinh học tế bào gốc và sinh học phát triển) và nghiên cứu ứng dụng (ví dụ: thử nghiệm thuốc tiền lâm sàng, mô hình hóa bệnh, kỹ thuật mô và khoa tiêu hóa). Do giao thức của chúng tôi có khả năng tái tạo và mạnh mẽ để tạo ra hình thái 3D của biểu mô ruột trong ống nghiệm, chúng tôi hình dung rằng chiến lược kỹ thuật của chúng tôi có thể được phổ biến cho khán giả nghiên cứu động lực của tín hiệu tế bào trong quá trình phát triển, tái tạo hoặc cân bằng nội môi. Ngoài ra, giao thức của chúng tôi rất hữu ích để thẩm vấn tình trạng nhiễm trùng dưới các tác nhân lây nhiễm khác nhau như Norovirus 8, Hội chứng hô hấp cấp tính nặng do vi-rút corona 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 hoặc Vibrio cholerae.Đối tượng nghiên cứu bệnh lý và sinh bệnh học cũng hữu ích. Việc sử dụng hệ thống vi sinh lý ruột trên chip có thể cho phép đồng nuôi cấy theo chiều dọc 10 và sau đó đánh giá khả năng phòng vệ của vật chủ, phản ứng miễn dịch và sửa chữa tổn thương liên quan đến mầm bệnh trong đường tiêu hóa (GI) 11. Các rối loạn GI khác liên quan đến hội chứng rò rỉ ruột, bệnh celiac, bệnh Crohn, viêm loét đại tràng, viêm túi lệ hoặc hội chứng ruột kích thích có thể được mô phỏng khi các lớp biểu mô ruột 3D được chuẩn bị bằng cách sử dụng 3 của bệnh nhân D, các bệnh này bao gồm teo nhung mao, rút ​​ngắn mật mã, tổn thương niêm mạc hoặc hàng rào biểu mô bị suy yếu. Sinh thiết hoặc các chất hữu cơ đường ruột có nguồn gốc từ tế bào12,13. Để mô hình hóa tốt hơn mức độ phức tạp cao hơn của môi trường bệnh, độc giả có thể cân nhắc thêm các loại tế bào liên quan đến bệnh, chẳng hạn như tế bào đơn nhân máu ngoại vi của bệnh nhân (PBMC), vào các mô hình chứa vi kiến ​​trúc mã hóa nhung mao ruột 3D.tế bào miễn dịch đặc hiệu mô, 5.
Vì cấu trúc vi mô biểu mô 3D có thể được cố định và trực quan hóa mà không cần quá trình phân chia, nên những người xem làm việc trên bản sao không gian và hình ảnh độ phân giải cao hoặc siêu phân giải có thể quan tâm đến việc lập bản đồ động lực học không gian của gen và protein trên các hốc biểu mô.Quan tâm đến công nghệ. Phản ứng với các kích thích vi khuẩn hoặc miễn dịch. Ngoài ra, giao tiếp xuyên âm giữa hệ vi sinh vật chủ và vật chủ dọc 10, 14 phối hợp cân bằng nội môi ruột có thể được thiết lập trong lớp niêm mạc ruột 3D bằng cách nuôi cấy đồng thời nhiều loài vi sinh vật, cộng đồng vi sinh vật hoặc hệ vi sinh vật trong phân, đặc biệt là trong ruột trên chip.trong nền tảng. Cách tiếp cận này đặc biệt hấp dẫn đối với khán giả nghiên cứu về miễn dịch niêm mạc, tiêu hóa, hệ vi sinh vật ở người, văn hóa học và vi sinh lâm sàng đang tìm cách nuôi cấy hệ vi sinh vật đường ruột chưa được nuôi cấy trước đó trong phòng thí nghiệm. Nếu giao thức tạo hình thái trong ống nghiệm của chúng tôi có thể được điều chỉnh theo các định dạng nuôi cấy có thể mở rộng, chẳng hạn như chèn nhiều giếng vào các đĩa 24, 96 hoặc 384 giếng liên tục bổ sung các ngăn cơ bản, thì giao thức này cũng có thể được phổ biến cho những nền tảng sàng lọc hoặc xác nhận thông lượng cao hoặc dược phẩm đang phát triển để ngành công nghiệp thực phẩm. Như một bằng chứng về nguyên tắc, gần đây chúng tôi đã chứng minh tính khả thi của hệ thống tạo hình thái thông lượng cao ghép kênh có thể mở rộng sang định dạng đĩa 24 giếng. Ngoài ra, nhiều sản phẩm nội tạng trên chip đã được thương mại hóa16,17,18. thuốc hoặc liệu pháp sinh học Sự hấp thụ và vận chuyển của các ứng cử viên thuốc được đánh giá bằng cách sử dụng chất thay thế ruột 3D hoặc sử dụng các mô hình cơ quan trên chip thương mại hoặc tùy chỉnh để đánh giá khả năng tái tạo của quá trình hình thành ruột.
Một số lượng hạn chế các mô hình thử nghiệm liên quan đến con người đã được sử dụng để nghiên cứu sự hình thành biểu mô ruột, chủ yếu là do thiếu các giao thức khả thi để tạo ra hình thái 3D trong ống nghiệm. Trên thực tế, phần lớn kiến ​​thức hiện tại về sự hình thành hình thái ruột dựa trên các nghiên cứu trên động vật (ví dụ: cá ngựa vằn20, chuột21 hoặc gà22). sẽ được thử nghiệm theo cách có thể mở rộng theo nhiều cách. Do đó, giao thức tái tạo cấu trúc mô 3D trong ống nghiệm của chúng tôi vượt trội so với các mô hình động vật in vivo cũng như các mô hình nuôi cấy tế bào 2D tĩnh truyền thống khác. Như đã mô tả trước đây, việc sử dụng các cấu trúc biểu mô 3D cho phép chúng tôi kiểm tra quá trình định vị không gian của các tế bào biệt hóa trong trục lông nhung để đáp ứng với các kích thích niêm mạc hoặc miễn dịch khác nhau. Các lớp biểu mô 3D có thể cung cấp không gian để nghiên cứu cách các tế bào vi khuẩn cạnh tranh để hình thành các hốc không gian và tiến hóa sinh thái trong phản ứng với các yếu tố vật chủ (ví dụ: lớp chất nhầy bên trong và bên ngoài, bài tiết IgA và peptide kháng khuẩn). Hơn nữa, hình thái biểu mô 3D có thể cho phép chúng ta hiểu cách thức hệ vi sinh vật đường ruột cấu trúc cộng đồng của nó và tạo ra các chất chuyển hóa vi khuẩn (ví dụ: axit béo chuỗi ngắn) định hình tổ chức tế bào và các hốc tế bào gốc trong các hốc tế bào gốc. Những đặc điểm này chỉ có thể được chứng minh khi các lớp biểu mô 3D được thiết lập trong ống nghiệm.
Ngoài phương pháp tạo cấu trúc biểu mô ruột 3D của chúng tôi, còn có một số phương pháp in vitro. Nuôi cấy cơ quan trong ruột là một kỹ thuật kỹ thuật mô tiên tiến dựa trên việc nuôi cấy tế bào gốc ruột trong các điều kiện hình thái cụ thể23,24,25. Tuy nhiên, việc sử dụng các mô hình cơ quan 3D để phân tích vận chuyển hoặc nuôi cấy đồng thời hệ vi sinh vật chủ và vật chủ thường gặp thách thức vì lòng ruột được bao bọc trong cơ quan và do đó, việc đưa vào các thành phần bên trong lòng như tế bào vi sinh vật hoặc ngoại sinh kháng nguyên bị hạn chế.Khả năng tiếp cận với lumens organoid có thể được cải thiện bằng cách sử dụng microinjector,26,27 nhưng phương pháp này xâm lấn, tốn nhiều công sức và đòi hỏi kiến ​​thức chuyên môn để thực hiện. Hơn nữa, nuôi cấy organoid truyền thống được duy trì trong giàn hydrogel trong điều kiện tĩnh không phản ánh chính xác cơ chế sinh học in vivo đang hoạt động.
Các phương pháp tiếp cận khác được một số nhóm nghiên cứu sử dụng sử dụng giàn giáo hydrogel 3D được cấu trúc sẵn để bắt chước cấu trúc biểu mô ruột bằng cách nuôi cấy các tế bào ruột người bị cô lập trên bề mặt gel. Chế tạo giàn giáo hydrogel bằng cách sử dụng khuôn in 3D, vi xay hoặc chế tạo bằng kỹ thuật in thạch bản. trong giàn giáo. Tuy nhiên, bản chất của giàn giáo được cấu trúc sẵn có thể ngăn cản việc hiển thị quá trình hình thái tự phát. Các mô hình này cũng không cung cấp dòng chảy động trong lòng hoặc kẽ, thiếu ứng suất cắt chất lỏng mà các tế bào ruột cần trải qua quá trình hình thành và đạt được chức năng sinh lý. được mô phỏng bằng cách sử dụng mô-đun vi lỏng. Tuy nhiên, mô hình này không thể hiện các quá trình hình thái tự phát cũng như không bao gồm các chuyển động cơ học ruột. Các kỹ thuật in 3D từ cùng một nhóm có thể tạo ra các ống ruột thu nhỏ với các quá trình hình thái tự phát. hình thái, ứng suất cắt liên quan đến sinh lý, cơ chế sinh học bắt chước nhu động ruột, khả năng tiếp cận của các ngăn đỉnh và đáy độc lập, đồng thời tái tạo các môi trường vi mô sinh học phức tạp của mô đun. Do đó, giao thức tạo hình 3D trong ống nghiệm của chúng tôi có thể cung cấp một phương pháp bổ sung để vượt qua những thách thức của các phương pháp hiện có.
Giao thức của chúng tôi hoàn toàn tập trung vào quá trình hình thành biểu mô 3D, chỉ có các tế bào biểu mô được nuôi cấy và không có các loại tế bào xung quanh khác như tế bào trung mô, tế bào nội mô và tế bào miễn dịch. Như đã mô tả trước đây, cốt lõi của giao thức của chúng tôi là tạo ra hình thái biểu mô bằng cách loại bỏ các chất ức chế hình thái được tiết ra ở mặt bên của môi trường được giới thiệu. lớp biểu mô 3D, các phức hợp sinh học bổ sung như tương tác giữa biểu mô-trung mô33,34, lắng đọng Ma trận ngoại bào (ECM) 35 và, trong mô hình của chúng tôi, các tính năng lông nhung truyền tải các hốc tế bào gốc trong các tinh thể cơ bản vẫn còn được xem xét thêm. các tế bào trung mô vào mô hình của chúng tôi đã tăng cường quá trình tạo hình thái và hiệu quả gắn kết tế bào. Lớp nội mô (tức là mao mạch hoặc bạch huyết) đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh quá trình vận chuyển phân tử39 và tuyển dụng tế bào miễn dịch40 trong môi trường vi mô đường ruột. Hơn nữa, các thành phần mạch máu có thể được kết nối giữa các mô hình mô là điều kiện tiên quyết khi các mô hình mô được thiết kế để thể hiện sự tương tác giữa nhiều cơ quan. Do đó, các tế bào nội mô có thể cần được đưa vào để mô hình hóa các đặc điểm sinh lý chính xác hơn với độ phân giải ở cấp độ cơ quan. Bệnh nhân Các tế bào miễn dịch có nguồn gốc cũng rất cần thiết để thể hiện các phản ứng miễn dịch bẩm sinh, trình diện kháng nguyên, nhiễu xuyên âm miễn dịch thích nghi bẩm sinh và miễn dịch đặc hiệu mô trong bối cảnh bắt chước bệnh đường ruột.
Việc sử dụng chip lai đơn giản hơn so với gut-on-a-chip vì thiết lập thiết bị đơn giản hơn và việc sử dụng miếng chèn Transwell cho phép nuôi cấy biểu mô ruột có thể mở rộng. Tuy nhiên, miếng chèn Transwell có bán trên thị trường với màng polyester không đàn hồi và không thể mô phỏng các chuyển động giống như nhu động. Hơn nữa, khoang đỉnh của miếng chèn Transwell được đặt trong chip lai vẫn cố định mà không có ứng suất cắt ở phía đỉnh. Rõ ràng, các đặc tính tĩnh trong khoang chóp hiếm khi cho phép sử dụng lâu dài đồng nuôi cấy vi khuẩn trong chip lai. Mặc dù chúng ta có thể tạo ra hình thái 3D một cách mạnh mẽ trong miếng chèn Transwell khi sử dụng chip lai, nhưng sự thiếu hụt cơ chế sinh học liên quan đến sinh lý và dòng chất lỏng ở đỉnh có thể hạn chế tính khả thi của nền tảng chip lai cho các ứng dụng tiềm năng.
Việc tái tạo toàn bộ trục nhung mao-mật mã của con người trong môi trường nuôi cấy ruột trên chip và lai trên chip vẫn chưa được thiết lập đầy đủ. Vì quá trình hình thái bắt đầu từ một lớp đơn lớp biểu mô, nên các vi kiến ​​trúc 3D không nhất thiết phải cung cấp sự tương đồng về hình thái với các tế bào trong cơ thể. các kênh trên chip dẫn đến tăng chiều cao của biểu mô vi kỹ thuật, chiều cao tối đa vẫn bị giới hạn ở ~300–400 µm. Độ sâu thực tế của các lỗ hổng trong ruột người ở ruột non và ruột già lần lượt là ~135 µm và ~400 µm, và chiều cao của nhung mao ruột non là ~600 µm41.
Từ quan điểm hình ảnh, hình ảnh siêu phân giải tại chỗ của vi kiến ​​trúc 3D có thể bị giới hạn ở ruột trên chip, do khoảng cách làm việc cần thiết từ thấu kính vật kính đến lớp biểu mô là khoảng vài milimét. , việc mở hoặc loại bỏ lớp trên để kiểm tra cấu trúc bề mặt của lớp biểu mô là vô cùng khó khăn. Ví dụ, bằng cách sử dụng kính hiển vi điện tử quét (SEM).
Tính kỵ nước của PDMS là một yếu tố hạn chế trong các nghiên cứu dựa trên vi lỏng xử lý các phân tử nhỏ kỵ nước, vì PDMS có thể hấp phụ không đặc hiệu các phân tử kỵ nước như vậy. Có thể xem xét các giải pháp thay thế cho PDMS bằng các vật liệu polyme khác. Ngoài ra, có thể cân nhắc sửa đổi bề mặt của PDMS (ví dụ: lớp phủ bằng vật liệu ưa béo 42 hoặc poly(ethylene glycol) 43 ) để giảm thiểu sự hấp phụ của các phân tử kỵ nước.
Cuối cùng, phương pháp của chúng tôi chưa được mô tả rõ ràng về mặt cung cấp sàng lọc thông lượng cao hoặc nền tảng thử nghiệm thân thiện với người dùng “một kích cỡ phù hợp với tất cả”. Giao thức hiện tại yêu cầu một bơm tiêm trên mỗi thiết bị siêu nhỏ, chiếm không gian trong tủ ấm CO2 và ngăn cản các thí nghiệm quy mô lớn. Hạn chế này có thể được cải thiện đáng kể nhờ khả năng mở rộng của các định dạng nuôi cấy cải tiến (ví dụ: chèn xốp 24 giếng, 96 giếng hoặc 384 giếng cho phép bổ sung liên tục và loại bỏ môi trường đáy).
Để tạo ra hình thái 3D của biểu mô ruột người trong ống nghiệm, chúng tôi đã sử dụng một thiết bị ruột chip vi lỏng chứa hai vi kênh song song và một màng xốp đàn hồi ở giữa để tạo ra giao diện lumen-mao quản. Chúng tôi cũng chứng minh việc sử dụng thiết bị vi lỏng một kênh (chip lai) cung cấp dòng chảy cơ bản liên tục bên dưới các lớp biểu mô phân cực được phát triển trên các miếng chèn Transwell. chất đối kháng gen từ khoang đáy bên. Toàn bộ quy trình thí nghiệm (Hình 1) bao gồm năm phần: (i) chế tạo vi mô chip ruột hoặc chip lai có thể chèn Transwell (bước 1-5; Hộp 1), (ii) chuẩn bị tế bào biểu mô ruột (tế bào Caco-2) hoặc các cơ quan đường ruột của con người;hộp 2-5), (iii) nuôi cấy tế bào biểu mô ruột trên chip ruột hoặc chip lai (bước 6-9), (iv) tạo ra hình thái 3D trong ống nghiệm (bước 10) và (v) ) để mô tả cấu trúc vi mô biểu mô 3D (bước 11-24). kiểm soát có điều kiện hoặc thủ tục.
Chúng tôi đã sử dụng hai nền tảng nuôi cấy khác nhau: ruột trên chip với các kênh thẳng hoặc kênh phức tạp phi tuyến tính hoặc chip lai có chứa Transwell (TW) chèn vào trong một thiết bị vi lỏng, được chế tạo như mô tả trong Hộp 1 và bước 1 -5. hình thái" cho thấy các bước tổng thể trong đó các tế bào biểu mô có nguồn gốc từ Caco-2 hoặc organoid được nuôi cấy trên một con chip ruột hoặc trên các miếng chèn Transwell của một con chip lai, tiếp theo là tạo ra hình thái 3D và hình thành một cấu trúc biểu mô đặc trưng. Hình ảnh miễn dịch huỳnh quang trong “Sự biệt hóa tế bào” cho thấy nhân, F-actin và MUC2 thể hiện trong lớp biểu mô 3D Caco-2 được tạo ra trên chip ruột. Tín hiệu MUC2 hiện diện trong các tế bào cốc và chất nhầy tiết ra từ bề mặt niêm mạc. Các nền văn hóa” hiển thị quá trình đồng nuôi cấy vi sinh vật chủ-hệ vi sinh vật đại diện trong ruột trên một con chip. Bảng điều khiển bên trái cho thấy quá trình đồng nuôi cấy của E. coli biểu hiện protein huỳnh quang màu xanh lá cây (GFP) với các tế bào biểu mô 3D Caco-2 được thiết kế vi mô. các tế bào viêm dưới thách thức sinh lý với các kháng nguyên vi khuẩn (ví dụ: lipopolysacarit, LPS) và các tế bào miễn dịch (ví dụ: PBMC;màu xanh lá cây).Các tế bào Caco-2 được nuôi cấy để thiết lập một lớp biểu mô 3D.Thanh tỷ lệ, 50 µm.Hình ảnh ở hàng dưới cùng: “Sự biệt hóa của các tế bào” được điều chỉnh với sự cho phép từ tài liệu tham khảo.2.Nhà xuất bản Đại học Oxford;Sao chép với sự cho phép từ Ref.5.NAS;“Host-Microbe Co-Culture” được điều chỉnh với sự cho phép từ ref.3.NAS;“Mô hình bệnh tật” được điều chỉnh với sự cho phép từ tài liệu tham khảo.5.NAS.
Cả chip ruột trên chip và chip lai đều được chế tạo bằng cách sử dụng các bản sao PDMS được đúc từ khuôn silicon bằng kỹ thuật in khắc mềm1,44 và được tạo khuôn bằng SU-8. Thiết kế của các vi kênh trong mỗi chip được xác định bằng cách xem xét thủy động lực học như ứng suất cắt và áp suất thủy động1,4,12. chip (Dữ liệu mở rộng Hình 1b) bao gồm một cặp vi kênh cong để tăng thời gian cư trú của chất lỏng, mô hình dòng chảy phi tuyến tính và biến dạng đa trục của tế bào nuôi cấy (Hình 2a–f) 12. Khi cần tái tạo cơ chế sinh học đường ruột phức tạp hơn, có thể chọn chip ruột trên chip phức tạp. Chúng tôi đã chứng minh rằng Gut-Chip phức tạp cũng tạo ra hình thái 3D mạnh mẽ trong một khung thời gian tương tự với mức độ phát triển biểu mô tương tự so với Gut-Chip ban đầu, bất kể loại tế bào nuôi cấy. Do đó, để tạo ra hình thái 3D, các thiết kế ruột trên chip tuyến tính và phức tạp có thể hoán đổi cho nhau. Các bản sao PDMS được xử lý trên khuôn silicon với các mẫu SU-8 cung cấp các tính năng tiêu cực sau khi tháo khuôn (Hình.2a). Để chế tạo ruột trên chip, lớp PDMS phía trên đã chuẩn bị được liên kết tuần tự với màng PDMS xốp và sau đó được căn chỉnh với lớp PDMS phía dưới bằng cách liên kết không thể đảo ngược bằng cách sử dụng bộ xử lý corona (Hình 2b–f). Để chế tạo chip lai, các bản sao PDMS đã xử lý được liên kết với các phiến kính để tạo ra các thiết bị vi lỏng đơn kênh có thể chứa các miếng chèn Transwell (Hình 2h và Hình dữ liệu mở rộng 2). Quá trình liên kết được thực hiện bằng cách xử lý các bề mặt của bản sao PDMS và thủy tinh bằng plasma oxy hoặc xử lý corona. Sau khi khử trùng thiết bị chế tạo siêu nhỏ gắn vào ống silicon, quá trình thiết lập thiết bị đã sẵn sàng để thực hiện hình thái 3D của biểu mô ruột (Hình 2g).
a, Sơ đồ minh họa quá trình chuẩn bị các bộ phận PDMS từ khuôn silicon có hoa văn SU-8. Dung dịch PDMS chưa xử lý được đổ vào khuôn silicon (trái), xử lý ở 60 °C (giữa) và tháo khuôn (phải). PDMS đã tháo khuôn được cắt thành từng mảnh và làm sạch để sử dụng tiếp.b, Ảnh chụp khuôn silicon được sử dụng để chuẩn bị lớp trên của PDMS.c, Ảnh chụp khuôn silicon được sử dụng để chế tạo màng xốp PDMS.d, Một loạt ảnh chụp các thành phần PDMS trên và dưới và quá trình lắp ráp thiết bị ruột trên chip.e, Sơ đồ căn chỉnh các thành phần PDMS trên, màng và dưới. Mỗi lớp được liên kết không thể đảo ngược bằng cách xử lý plasma hoặc corona.f, Sơ đồ thiết bị ruột trên chip được chế tạo với các vi kênh và buồng chân không phức tạp được xếp chồng lên nhau.g, Thiết lập ruột trên chip để nuôi cấy tế bào vi lỏng. Ruột chế tạo trên chip được lắp ráp bằng một ống silicon và ống tiêm được đặt trên một nắp trượt. Thiết bị chip được đặt trên nắp của một Đĩa Petri 150 mm để xử lý. Chất kết dính được sử dụng để đóng ống silicon.h, Ảnh chụp trực quan quá trình chế tạo chip lai và hình thái 3D bằng cách sử dụng chip lai. Các miếng chèn Transwell được chuẩn bị độc lập để nuôi cấy các lớp đơn lớp 2D của tế bào biểu mô ruột được đưa vào chip lai để tạo ra hình thái 3D ở ruột. Môi trường được tưới máu qua các vi kênh bên dưới lớp tế bào được thiết lập trên miếng chèn Transwell. Thanh tỷ lệ, 1 cm.h Được in lại với sự cho phép từ tài liệu tham khảo.4.Elsevier.
Trong giao thức này, dòng tế bào Caco-2 và các chất hữu cơ trong ruột được sử dụng làm nguồn biểu mô (Hình 3a). Cả hai loại tế bào đều được nuôi cấy độc lập (Hộp 2 và Hộp 5) và được sử dụng để tạo mầm cho các vi kênh được phủ ECM của ruột trên chip hoặc miếng chèn Transwell. huyền phù tế bào được tạo ra bằng chất lỏng trypsin hóa (hộp 2). Các chất hữu cơ đường ruột của con người từ sinh thiết ruột hoặc phẫu thuật cắt bỏ được nuôi cấy trong vòm giàn giáo Matrigel trong các đĩa 24 giếng để hỗ trợ môi trường vi mô cấu trúc. Môi trường chứa các morphogen thiết yếu (chẳng hạn như Wnt, R-spondin và Noggin) và các yếu tố tăng trưởng được chuẩn bị như mô tả trong Hộp 3 được bổ sung mỗi ngày cho đến khi các chất hữu cơ tăng lên đường kính ~ 500 µm. Các chất hữu cơ phát triển đầy đủ được thu hoạch và phân tách thành các tế bào đơn lẻ để cấy vào ruột hoặc miếng chèn Transwell trên chip (Hộp 5). Như chúng tôi đã báo cáo trước đây, nó có thể được phân biệt theo loại bệnh12,13 (ví dụ: viêm loét đại tràng, bệnh Crohn, ung thư đại trực tràng hoặc người hiến tặng bình thường), vị trí tổn thương (ví dụ: tổn thương so với vùng không bị tổn thương) và vị trí đường tiêu hóa trong đường (ví dụ: tá tràng, hỗng tràng, hồi tràng, manh tràng, ruột kết hoặc trực tràng). Chúng tôi cung cấp một giao thức tối ưu hóa trong Hộp 5 cho nuôi cấy các chất hữu cơ đại tràng (coloids) thường đòi hỏi nồng độ morphogens cao hơn so với các chất hữu cơ ruột non.
a, Quy trình làm việc để tạo ra hình thái ruột trong chip ruột. Caco-2 biểu mô ruột người và các chất hữu cơ đường ruột được sử dụng trong giao thức này để chứng minh sự hình thành 3D. Các tế bào biểu mô bị cô lập được gieo vào thiết bị chip ruột đã chuẩn bị (chuẩn bị chip). , D0-D2). Dòng chảy cơ bản (BL) cũng được bắt đầu cùng với các chuyển động kéo dài theo chu kỳ (kéo dài, dòng chảy, AP và BL) khi một lớp đơn lớp 2D hoàn chỉnh được hình thành. Hình thái 3D trong ruột xảy ra một cách tự nhiên sau 5 ngày nuôi cấy vi lỏng (hình thái, D5). các tầng hình thái ruột (trên cùng bên phải). Các mũi tên nét đứt trong sơ đồ biểu thị hướng của dòng chất lỏng. b, Ảnh SEM hiển thị cấu trúc liên kết bề mặt của biểu mô Caco-2 3D đã được thiết lập (trái). Hình nhỏ làm nổi bật vùng phóng đại (hộp nét đứt màu trắng) cho thấy các vi nhung mao được tái tạo trên lớp Caco-2 3D (phải). các màng được dán nhãn F-actin (màu xanh lá cây) và nhân (màu xanh lam) Trực quan hóa đồng thời miễn dịch huỳnh quang của các tế bào biểu mô trên chip ruột. Các mũi tên chỉ vào sơ đồ ở giữa cho biết vị trí của mặt phẳng tiêu điểm cho mỗi chế độ xem đồng tiêu. máy chụp ảnh hiển vi của biểu mô 3D dạng cơ quan được thiết lập trong ruột trên lát cắt được chụp vào ngày thứ 7.f, Hình ảnh miễn dịch huỳnh quang phủ cho thấy các dấu hiệu của tế bào gốc (LGR5;đỏ tươi), các tế bào cốc (MUC2; xanh lục), F-actin (xám) và nhân (lục lam) phát triển trên các chip ruột trong 3 ngày, tương ứng (Trái) và các cơ quan 13 ngày (giữa) trên lớp biểu mô. Xem thêm Dữ liệu mở rộng Hình 3, làm nổi bật tín hiệu LGR5 mà không có tín hiệu MUC2. Hình ảnh huỳnh quang cho thấy vi cấu trúc biểu mô (phải) của biểu mô cơ quan 3D được thiết lập trong ruột trên chip bằng cách nhuộm plasma màng bằng thuốc nhuộm CellMask (phải) vào ngày nuôi cấy thứ 13. Thanh tỷ lệ là 50 μm trừ khi có quy định khác.b In lại với sự cho phép từ tài liệu tham khảo.2.Nhà xuất bản Đại học Oxford;c Được điều chỉnh với sự cho phép từ Reference.2.Nhà xuất bản Đại học Oxford;e và f được điều chỉnh với sự cho phép bằng cách tham khảo.12 Theo Giấy phép Creative Commons CC BY 4.0.
Trong ruột trên chip, cần phải sửa đổi bề mặt kỵ nước của màng xốp PDMS để có lớp phủ ECM thành công. Trong giao thức này, chúng tôi áp dụng hai phương pháp khác nhau để sửa đổi tính kỵ nước của màng PDMS. Để nuôi cấy tế bào Caco-2, chỉ kích hoạt bề mặt bằng xử lý UV/ozone là đủ để giảm tính kỵ nước của bề mặt PDMS, phủ ECM và gắn các tế bào Caco-2 vào màng PDMS. Tuy nhiên, nuôi cấy vi lỏng của biểu mô cơ quan cần chức năng hóa bề mặt dựa trên hóa chất để đạt được sự lắng đọng protein ECM hiệu quả bằng cách áp dụng tuần tự polyetylen (PEI) và glutaraldehyd cho các vi kênh PDMS. Sau khi sửa đổi bề mặt, các protein ECM được lắng đọng để che phủ bề mặt PDMS đã được chức năng hóa và sau đó được đưa vào biểu mô cơ quan bị cô lập. ium để tạo ra hình thái 3D trên bề mặt PDMS.
Nuôi cấy transwell cũng yêu cầu lớp phủ ECM trước khi cấy tế bào;tuy nhiên, nuôi cấy Transwell không yêu cầu các bước tiền xử lý phức tạp để kích hoạt bề mặt của vật liệu chèn xốp. Để phát triển các tế bào Caco-2 trên vật liệu chèn Transwell, lớp phủ ECM trên vật liệu chèn xốp giúp tăng tốc độ gắn kết của các tế bào Caco-2 đã phân tách (<1 giờ) và sự hình thành hàng rào mối nối chặt chẽ (<1-2 ngày). Để nuôi cấy các chất hữu cơ trên vật liệu chèn Transwell, các chất hữu cơ bị cô lập được gieo vào các vật chèn được phủ ECM, gắn vào bề mặt màng (<3 h) và được duy trì cho đến khi các chất hữu cơ tạo thành một lớp đơn lớp hoàn chỉnh với hàng rào tính toàn vẹn .Nuôi cấy truyền qua giếng được thực hiện trong các đĩa 24 giếng mà không sử dụng chip lai.
Sự hình thành 3D trong ống nghiệm có thể được bắt đầu bằng cách áp dụng dòng chất lỏng vào khía cạnh cơ bản của lớp biểu mô đã được thiết lập. Trong ruột trên chip, sự hình thành biểu mô bắt đầu khi môi trường được tưới máu vào các vi kênh trên và dưới (Hình 3a). áp dụng dòng chảy kép trong ruột trên một con chip. Trong các con chip lai, các miếng chèn Transwell có chứa các lớp đơn biểu mô được đưa vào các con chip lai. Sau đó, môi trường được áp dụng dưới mặt đáy của miếng chèn Transwell xốp thông qua vi kênh. Hình thái đường ruột xảy ra 3-5 ngày sau khi bắt đầu dòng chảy cơ bản trong cả hai nền tảng nuôi cấy.
Các đặc điểm hình thái của các lớp biểu mô 3D vi kỹ thuật có thể được phân tích bằng cách áp dụng các phương thức hình ảnh khác nhau, bao gồm kính hiển vi tương phản pha, kính hiển vi tương phản giao thoa vi sai (DIC), SEM hoặc kính hiển vi đồng tiêu miễn dịch huỳnh quang (Hình 3 và 4). Có thể dễ dàng thực hiện tương phản pha hoặc tạo ảnh DIC bất cứ lúc nào trong quá trình nuôi cấy để theo dõi hình dạng và độ lồi của các lớp biểu mô 3D. Do tính trong suốt quang học của màng PDMS và polyester, cả hai loại ruột trên-a- nền tảng chip và chip lai có thể cung cấp hình ảnh tại chỗ theo thời gian thực mà không cần phải cắt hoặc tháo rời thiết bị. Khi thực hiện hình ảnh miễn dịch huỳnh quang (Hình 1, 3c, f và 4b, c), các tế bào thường được cố định bằng 4% (wt/vol) paraformaldehyde (PFA), tiếp theo là Triton X-100 và 2% (wt/vol) ) albumin huyết thanh bò (BSA), theo thứ tự. Tùy thuộc vào loại tế bào, các chất cố định khác nhau, chất làm thấm s, và các tác nhân ngăn chặn có thể được sử dụng. Các kháng thể chính nhắm mục tiêu vào các tế bào phụ thuộc vào dòng dõi hoặc các điểm đánh dấu vùng được sử dụng để làm nổi bật các tế bào cố định tại chỗ trên chip, tiếp theo là các kháng thể thứ cấp cùng với thuốc nhuộm phản quang nhắm vào một trong hai nhân (ví dụ: 4′, 6-diamidino-2-phenylene) indole, DAPI) hoặc F-actin (ví dụ: phalloidin được đánh dấu huỳnh quang). Hình ảnh trực tiếp dựa trên huỳnh quang cũng có thể được thực hiện tại chỗ để phát hiện quá trình sản xuất chất nhầy (Hình.1, “Sự biệt hóa tế bào” và “Sinh lý học đường ruột”), sự xâm nhập ngẫu nhiên của các tế bào vi sinh vật (Hình 1, “Đồng nuôi cấy vi khuẩn ký chủ”), tuyển dụng các tế bào miễn dịch (Hình 1, 'Mô hình hóa bệnh') hoặc các đường viền của hình thái biểu mô 3D (Hình 3c, f và 4b, c). Khi sửa đổi ruột trên chip để tách lớp trên khỏi lớp vi kênh dưới, như được mô tả trong tài liệu tham khảo. , hình thái biểu mô 3D cũng như vi nhung mao trên viền bàn chải đỉnh có thể được hiển thị bằng SEM (Hình 3b). Biểu hiện của các dấu hiệu phân biệt có thể được đánh giá bằng cách thực hiện PCR5 định lượng hoặc giải trình tự RNA đơn bào. Trong trường hợp này, các lớp tế bào biểu mô 3D phát triển trong chip ruột hoặc chip lai được thu hoạch bằng cách trypsin hóa và sau đó được sử dụng để phân tích phân tử hoặc di truyền.
a, Quy trình làm việc để tạo ra hình thái ruột trong chip lai. Caco-2 và các chất hữu cơ ruột được sử dụng trong giao thức này để chứng minh sự hình thành 3D trong nền tảng chip lai. Các tế bào biểu mô phân tách được gieo vào các miếng chèn Transwell đã chuẩn bị sẵn (chuẩn bị TW; xem hình bên dưới). của các tế bào biểu mô đã được tích hợp vào một con chip lai để giới thiệu một dòng chảy cơ bản (Flow, BL), cuối cùng dẫn đến việc tạo ra một lớp biểu mô 3D (hình thái). Các vi ảnh tương phản pha cho thấy các đặc điểm hình thái của các tế bào biểu mô cơ quan người có nguồn gốc từ người hiến tặng bình thường (dòng C103) tăng dần dấu hai chấm ở mỗi bước thử nghiệm hoặc thời điểm. Sơ đồ ở các lớp trên minh họa cấu hình thử nghiệm cho từng bước.b, Chip lai (sơ đồ bên trái) có thể dẫn đến sự hình thành 3D của biểu mô cơ quan các tế bào vỏ với chế độ xem kính hiển vi đồng tiêu từ trên xuống được chụp ở các vị trí Z khác nhau (trên, giữa và dưới;xem sơ đồ bên phải và các đường chấm chấm tương ứng).cho thấy các đặc điểm hình thái rõ ràng. F-actin (lục lam), nhân (xám).c, Ảnh vi mô đồng tiêu huỳnh quang (chế độ xem góc 3D) của các tế bào biểu mô có nguồn gốc từ cơ quan được nuôi cấy trong Transwell tĩnh (TW; bên trong hộp nét đứt màu trắng) so với chip lai (ảnh chụp đầy đủ lớn nhất) tương ứng so sánh hình thái 2D với 3D. Một cặp chế độ xem cắt ngang dọc 2D (chèn ở góc trên bên phải; “XZ”) cũng hiển thị 2D và 3D features.Scale bar, 100 µm.c In lại với sự cho phép từ tài liệu tham khảo.4.Elsevier.
Các biện pháp kiểm soát có thể được chuẩn bị bằng cách nuôi cấy các tế bào giống nhau (Caco-2 hoặc tế bào biểu mô cơ quan ruột) thành các lớp đơn lớp hai chiều trong điều kiện nuôi cấy tĩnh thông thường. Đáng chú ý, sự cạn kiệt chất dinh dưỡng có thể xảy ra do khả năng thể tích hạn chế của các vi kênh (tức là ~4 µL trong kênh trên cùng của thiết kế chip ruột ban đầu). Do đó, hình thái biểu mô trước và sau khi áp dụng dòng chảy cơ bản cũng có thể được so sánh.
Quá trình in thạch bản mềm phải được thực hiện trong phòng sạch. Đối với mỗi lớp trên chip (lớp trên và dưới và màng) và chip lai, các mặt nạ quang khác nhau được sử dụng và chế tạo trên các tấm silicon riêng biệt vì chiều cao của các vi kênh là khác nhau. Chiều cao mục tiêu của các vi kênh trên và dưới của ruột trên chip lần lượt là 500 µm và 200 µm. Chiều cao mục tiêu của kênh của chip lai là 200 µm.
Đặt một tấm wafer silicon 3 inch vào đĩa có axeton. Xoay nhẹ tấm trong 30 giây, sau đó làm khô tấm wafer trong không khí. Chuyển tấm wafer sang một tấm có IPA, sau đó xoay tấm trong 30 giây để làm sạch.
Có thể tùy chọn sử dụng dung dịch piranha (hỗn hợp hydro peroxide và axit sulfuric đậm đặc, 1:3 (vol/vol)) để tối đa hóa việc loại bỏ cặn hữu cơ khỏi bề mặt tấm bán dẫn silicon.
Dung dịch Piranha cực kỳ ăn mòn và sinh nhiệt. Cần có các biện pháp phòng ngừa an toàn bổ sung. Để xử lý chất thải, hãy để dung dịch nguội và chuyển sang thùng chứa chất thải khô, sạch. Sử dụng thùng chứa thứ cấp và dán nhãn đúng cách cho thùng chứa chất thải. Vui lòng tuân theo các hướng dẫn an toàn của cơ sở để biết thêm các quy trình chi tiết.
Khử nước các tấm wafer bằng cách đặt chúng trên một tấm nóng 200°C trong 10 phút. Sau khi khử nước, tấm wafer được lắc năm lần trong không khí để làm mát.
Đổ ~10 g chất cản quang SU-8 2100 vào giữa tấm bán dẫn silicon đã được làm sạch. Sử dụng nhíp để trải đều chất cản quang lên tấm bán dẫn. Thỉnh thoảng đặt tấm bán dẫn lên một tấm nóng 65°C để làm cho tấm cản quang ít dính hơn và dễ dàn trải hơn. Không đặt tấm bán dẫn trực tiếp lên tấm làm nóng.
SU-8 được phân bố đều trên wafer bằng cách chạy lớp phủ kéo sợi. Lập trình một vòng quay tới của SU-8 trong 5–10 giây để lan truyền ở tốc độ 500 vòng/phút với gia tốc 100 vòng/phút/giây. Đặt vòng quay chính cho độ dày 200 µm tạo khuôn ở 1.500 vòng/phút hoặc đạt được độ dày 250 µm (tạo chiều cao 500 µm cho lớp trên của ruột trên chip; xem “Các bước quan trọng” bên dưới) được đặt ở mức tăng tốc 300 vòng/phút 30 giây tại 1.200 vòng/phút.
Tốc độ quay chính có thể được điều chỉnh theo độ dày mục tiêu của mẫu SU-8 trên tấm wafer silicon.
Để chế tạo các mẫu SU-8 có chiều cao 500 µm cho lớp trên của ruột trên chip, các bước phủ kéo sợi và nướng mềm của Hộp này (bước 7 và 8) được lặp lại tuần tự (xem bước 9) để tạo ra hai lớp SU-8 dày 250 µm, có thể được phân lớp và nối bằng cách tiếp xúc với tia cực tím ở bước 12 của hộp này, tạo ra một lớp cao 500 µm.
Nướng mềm các tấm wafer tráng SU-8 bằng cách cẩn thận đặt các tấm wafer lên đĩa nóng ở 65 °C trong 5 phút, sau đó chuyển cài đặt sang 95 °C và ủ thêm 40 phút.
Để đạt được chiều cao 500 μm của mẫu SU-8 ở vi kênh phía trên, hãy lặp lại bước 7 và 8 để tạo hai lớp SU-8 dày 250 μm.
Sử dụng UV Mask Aligner, thực hiện kiểm tra đèn theo hướng dẫn của nhà sản xuất để tính toán thời gian phơi sáng của tấm wafer.(thời gian phơi sáng, ms) = (liều lượng phơi nhiễm, mJ/cm2)/(công suất đèn, mW/cm2).
Sau khi xác định thời gian phơi sáng, đặt mặt nạ quang lên giá đỡ mặt nạ của bộ chỉnh mặt nạ UV và đặt mặt nạ quang lên tấm bán dẫn có phủ SU-8.
Đặt bề mặt đã in của mặt nạ quang trực tiếp lên mặt được phủ SU-8 của tấm silicon để giảm thiểu sự phân tán tia cực tím.
Phơi sáng tấm wafer và mặt nạ quang được phủ SU-8 theo chiều dọc với ánh sáng UV 260 mJ/cm2 trong thời gian phơi sáng định trước (xem bước 10 của hộp này).
Sau khi tiếp xúc với tia cực tím, các tấm wafer silicon phủ SU-8 được nung ở 65°C trong 5 phút và 95°C trong 15 phút trên mỗi tấm gia nhiệt để tạo ra các mẫu có chiều cao 200 μm. Kéo dài thời gian sau khi nướng ở 95 °C thành 30 phút để tạo các mẫu có chiều cao 500 µm.
Thuốc trợ sáng được đổ vào một đĩa thủy tinh và miếng wafer đã nướng được đặt vào đĩa. Thể tích của thuốc trợ sáng SU-8 có thể khác nhau tùy thuộc vào kích thước của tấm kính. Đảm bảo sử dụng đủ thuốc trợ sáng SU-8 để loại bỏ hoàn toàn SU-8 chưa phơi sáng. Ví dụ: khi sử dụng đĩa thủy tinh có đường kính 150 mm với dung tích 1 L, hãy sử dụng ~300 mL thuốc trợ sáng SU-8. Thỉnh thoảng phát triển khuôn trong 25 phút bằng cách xoay nhẹ.
Rửa sạch khuôn đã phát triển với ~10 mL chất phát triển mới, sau đó là IPA bằng cách phun dung dịch bằng pipet.
Đặt wafer vào máy làm sạch plasma và tiếp xúc với plasma oxy (khí trong khí quyển, áp suất mục tiêu 1 × 10−5 Torr, công suất 125 W) trong 1,5 phút.
Đặt tấm wafer vào bình hút ẩm chân không với một phiến kính bên trong. Có thể đặt các tấm wafer và phiến kính cạnh nhau. Nếu bình hút ẩm chân không được chia thành nhiều lớp bằng một tấm, hãy đặt các phiến kính ở khoang dưới và các tấm wafer ở khoang trên. Nhỏ 100 μL dung dịch silan trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) lên một phiến kính và hút chân không để silan hóa.
Rã đông một lọ tế bào Caco-2 đông lạnh trong bể nước 37°C, sau đó chuyển tế bào đã rã đông vào bình T75 chứa 15 mL môi trường Caco-2 đã được làm ấm trước ở 37°C.
Để vượt qua các tế bào Caco-2 ở độ hợp lưu ~90%, trước tiên hãy làm ấm môi trường Caco-2, PBS và 0,25% trypsin/1 mM EDTA trong bể nước 37°C.
Hút môi trường bằng cách hút chân không. Rửa tế bào hai lần với 5 mL PBS ấm bằng cách lặp lại hút chân không và thêm PBS mới.