Cảm ơn bạn đã truy cập Nature.com. Bạn đang sử dụng phiên bản trình duyệt có hỗ trợ CSS hạn chế. Để có trải nghiệm tốt nhất, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng trình duyệt đã cập nhật (hoặc tắt Chế độ tương thích trong Internet Explorer). Ngoài ra, để đảm bảo hỗ trợ liên tục, chúng tôi hiển thị trang web không có kiểu dáng và JavaScript.
Hiển thị một vòng quay gồm ba slide cùng một lúc. Sử dụng các nút Trước và Tiếp theo để di chuyển qua ba slide cùng một lúc hoặc sử dụng các nút thanh trượt ở cuối để di chuyển qua ba slide cùng một lúc.
Hàng rào máu não và hàng rào máu não ngăn cản các tác nhân sinh học trị liệu đến được mục tiêu của chúng trong hệ thần kinh trung ương, do đó cản trở việc điều trị hiệu quả các bệnh thần kinh. Để khám phá ra các chất vận chuyển não mới in vivo, chúng tôi đã giới thiệu một thư viện peptide phage T7 và thu thập máu và dịch não tủy (CSF) theo chuỗi bằng cách sử dụng mô hình nhóm lớn có ý thức được đặt ống thông của chuột. Các bản sao phage cụ thể đã được làm giàu cao trong CSF sau bốn vòng lựa chọn. Kiểm tra từng peptide ứng cử viên cho thấy sự làm giàu gấp hơn 1000 lần trong CSF. Hoạt tính sinh học của quá trình vận chuyển qua trung gian peptide đến não đã được xác nhận bằng cách giảm 40% mức amyloid-β trong dịch não tủy bằng cách sử dụng chất ức chế peptide BACE1 liên kết với peptide vận chuyển mới đã xác định. Những kết quả này cho thấy rằng các peptide được xác định bằng các phương pháp lựa chọn phage in vivo có thể là phương tiện hữu ích để vận chuyển toàn thân các đại phân tử đến não với tác dụng điều trị.
Nghiên cứu về liệu pháp nhắm mục tiêu hệ thần kinh trung ương (CNS) chủ yếu tập trung vào việc xác định các loại thuốc và tác nhân được tối ưu hóa thể hiện các đặc tính nhắm mục tiêu CNS, với ít nỗ lực hơn trong việc khám phá các cơ chế thúc đẩy việc cung cấp thuốc chủ động đến não. Điều này đang bắt đầu thay đổi khi việc cung cấp thuốc, đặc biệt là các phân tử lớn, là một phần không thể thiếu trong quá trình phát triển thuốc khoa học thần kinh hiện đại. Môi trường của hệ thần kinh trung ương được bảo vệ tốt bởi hệ thống hàng rào mạch máu não, bao gồm hàng rào máu não (BBB) ​​​​và hàng rào máu não (BCBB)1, khiến việc cung cấp thuốc đến não trở nên khó khăn1,2. Người ta ước tính rằng gần như tất cả các loại thuốc phân tử lớn và hơn 98% thuốc phân tử nhỏ bị đào thải khỏi não3. Đó là lý do tại sao việc xác định các hệ thống vận chuyển não mới cung cấp khả năng cung cấp thuốc điều trị hiệu quả và cụ thể đến CNS là rất quan trọng 4,5. Tuy nhiên, BBB và BCSFB cũng mang đến cơ hội tuyệt vời để cung cấp thuốc vì chúng thâm nhập và đi vào tất cả các cấu trúc của não thông qua hệ thống mạch máu rộng lớn của não. Do đó, những nỗ lực hiện tại nhằm sử dụng các phương pháp đưa thuốc không xâm lấn vào não phần lớn dựa trên cơ chế vận chuyển qua trung gian thụ thể (PMT) sử dụng thụ thể BBB6 nội sinh. Bất chấp những tiến bộ quan trọng gần đây khi sử dụng con đường thụ thể transferrin7,8, vẫn cần phải phát triển thêm các hệ thống đưa thuốc mới có đặc tính được cải thiện. Để đạt được mục đích này, mục tiêu của chúng tôi là xác định các peptide có khả năng làm trung gian vận chuyển dịch não tủy, vì về nguyên tắc, chúng có thể được sử dụng để đưa các đại phân tử đến CNS hoặc mở ra các con đường thụ thể mới. Đặc biệt, các thụ thể và chất vận chuyển đặc hiệu của hệ mạch máu não (BBB và BSCFB) có thể đóng vai trò là mục tiêu tiềm năng để đưa thuốc sinh học trị liệu chủ động và đặc hiệu. Dịch não tủy (CSF) là sản phẩm tiết của đám rối mạch mạc (CS) và tiếp xúc trực tiếp với dịch kẽ của não thông qua khoang dưới nhện và khoang não thất4. Gần đây, người ta đã chỉ ra rằng dịch não tủy dưới nhện khuếch tán quá mức vào mô kẽ của não9. Chúng tôi hy vọng có thể tiếp cận không gian nhu mô bằng đường dẫn vào dưới nhện này hoặc trực tiếp qua BBB. Để đạt được điều này, chúng tôi đã triển khai một chiến lược lựa chọn phage in vivo mạnh mẽ, lý tưởng nhất là xác định các peptide được vận chuyển bởi một trong hai con đường riêng biệt này.
Bây giờ chúng tôi mô tả một phương pháp sàng lọc hiển thị phage in vivo tuần tự với lấy mẫu dịch não tủy kết hợp với giải trình tự thông lượng cao (HTS) để theo dõi các vòng lựa chọn ban đầu với sự đa dạng thư viện cao nhất. Việc sàng lọc được thực hiện trên những con chuột còn tỉnh táo với ống thông lớn (CM) được cấy ghép cố định để tránh nhiễm bẩn máu. Điều quan trọng là phương pháp này chọn cả mục tiêu não và các peptide có hoạt động vận chuyển qua hàng rào mạch máu não. Chúng tôi sử dụng phage T7 do kích thước nhỏ của chúng (~ 60 nm)10 và cho rằng chúng phù hợp để vận chuyển các túi cho phép vượt qua hàng rào nội mô và/hoặc biểu mô-tủy. Sau bốn vòng sàng lọc, các quần thể phage đã được phân lập cho thấy sự làm giàu dịch não tủy in vivo mạnh mẽ và liên kết mạch máu nhỏ não. Điều quan trọng là chúng tôi có thể xác nhận những phát hiện của mình bằng cách chứng minh rằng các peptide ứng cử viên tốt nhất được ưa chuộng và tổng hợp hóa học có thể vận chuyển hàng hóa protein vào dịch não tủy. Đầu tiên, các tác dụng dược động học của CNS đã được thiết lập bằng cách kết hợp một peptide vận chuyển hàng đầu với chất ức chế peptide BACE1. Ngoài việc chứng minh rằng các chiến lược sàng lọc chức năng in vivo có thể xác định các peptide vận chuyển não mới là chất mang protein hiệu quả, chúng tôi hy vọng các phương pháp lựa chọn chức năng tương tự cũng trở nên quan trọng trong việc xác định các con đường vận chuyển não mới.
Dựa trên các đơn vị hình thành mảng bám (PFU), sau bước đóng gói phage, một thư viện gồm các peptide phage T7 tuyến tính 12-mer ngẫu nhiên với độ đa dạng khoảng 109 đã được thiết kế và tạo ra (xem Vật liệu và Phương pháp). Điều quan trọng cần lưu ý là chúng tôi đã phân tích cẩn thận thư viện này trước khi quét in vivo. Sự khuếch đại PCR của các mẫu thư viện phage sử dụng các đoạn mồi đã sửa đổi đã tạo ra các amplicon có thể áp dụng trực tiếp cho HTS (Hình bổ sung 1a). Do a) lỗi giải trình tự HTS11, b) tác động đến chất lượng của các đoạn mồi (NNK)1-12 và c) sự hiện diện của phage kiểu hoang dã (wt) (các đoạn chèn bộ xương) trong thư viện dự phòng, một quy trình lọc trình tự đã được triển khai để chỉ trích xuất thông tin trình tự đã được xác minh (Hình bổ sung 1b). Các bước lọc này áp dụng cho tất cả các thư viện giải trình tự HTS. Đối với thư viện chuẩn, tổng cộng có 233.868 lượt đọc đã thu được, trong đó 39% vượt qua tiêu chí lọc và được sử dụng để phân tích và lựa chọn thư viện cho các vòng tiếp theo (Hình bổ sung 1c–e). Các lần đọc chủ yếu là bội số của 3 cặp bazơ có độ dài với đỉnh ở 36 nucleotide (Hình bổ sung 1c), xác nhận thiết kế thư viện (NNK) 1-12. Đáng chú ý, khoảng 11% thành viên thư viện chứa một đoạn chèn PAGISRELVDKL kiểu hoang dã (wt) 12 chiều và gần một nửa số trình tự (49%) chứa các đoạn chèn hoặc đoạn xóa. HTS của thư viện đã xác nhận tính đa dạng cao của các peptide trong thư viện: hơn 81% trình tự peptide chỉ được tìm thấy một lần và chỉ có 1,5% xuất hiện ở ≥4 bản sao (Hình bổ sung 2a). Tần suất của các axit amin (aa) ở tất cả 12 vị trí trong kho dữ liệu tương quan tốt với tần suất dự kiến ​​cho số lượng codon được tạo ra bởi kho dữ liệu NKK thoái hóa (Hình bổ sung 2b). Tần suất quan sát được của các gốc aa được mã hóa bởi các đoạn chèn này tương quan tốt với tần suất được tính toán (r = 0,893) (Hình bổ sung 2c). Việc chuẩn bị thư viện phage để tiêm bao gồm các bước khuếch đại và loại bỏ nội độc tố. Trước đây, điều này đã được chứng minh là có khả năng làm giảm tính đa dạng của thư viện phage12,13. Do đó, chúng tôi đã giải trình tự một thư viện phage được khuếch đại trên đĩa đã trải qua quá trình loại bỏ nội độc tố và so sánh với thư viện ban đầu để ước tính tần suất AA. Một mối tương quan mạnh (r = 0,995) đã được quan sát thấy giữa nhóm ban đầu và nhóm được khuếch đại và tinh khiết (Hình bổ sung 2d), cho thấy rằng sự cạnh tranh giữa các bản sao được khuếch đại trên đĩa sử dụng phage T7 không gây ra sai lệch lớn. So sánh này dựa trên tần suất của các họa tiết tripeptit trong mỗi thư viện, vì tính đa dạng của các thư viện (~109) không thể được nắm bắt đầy đủ ngay cả với HTS. Phân tích tần suất aa tại mỗi vị trí cho thấy một sai lệch nhỏ phụ thuộc vào vị trí ở ba vị trí cuối cùng của danh mục đã nhập (Hình bổ sung 2e). Tóm lại, chúng tôi kết luận rằng chất lượng và tính đa dạng của thư viện là chấp nhận được và chỉ có những thay đổi nhỏ về tính đa dạng được quan sát thấy do khuếch đại và chuẩn bị các thư viện phage giữa một số vòng chọn lọc.
Lấy mẫu dịch não tủy hàng loạt có thể được thực hiện bằng cách phẫu thuật cấy ghép một ống thông vào CM của những con chuột còn tỉnh táo để tạo điều kiện xác định phage T7 được tiêm tĩnh mạch (iv) qua BBB và/hoặc BCSFB (Hình 1a-b). Chúng tôi đã sử dụng hai nhánh chọn lọc độc lập (nhánh A và B) trong ba vòng đầu tiên của quá trình chọn lọc in vivo (Hình 1c). Chúng tôi dần dần tăng mức độ nghiêm ngặt của quá trình chọn lọc bằng cách giảm tổng lượng phage được đưa vào trong ba vòng chọn lọc đầu tiên. Đối với vòng quét thứ tư, chúng tôi kết hợp các mẫu từ nhánh A và B và thực hiện thêm ba lần chọn lọc độc lập. Để nghiên cứu các đặc tính in vivo của các hạt phage T7 trong mô hình này, phage kiểu hoang dã (chèn chính PAGISRELVDKL) đã được tiêm vào chuột qua tĩnh mạch đuôi. Việc thu hồi phage từ dịch não tủy và máu tại các thời điểm khác nhau cho thấy phage hình nhị thập diện T7 tương đối nhỏ có giai đoạn thanh thải ban đầu nhanh khỏi khoang máu (Hình bổ sung 3). Dựa trên nồng độ được dùng và thể tích máu của chuột, chúng tôi tính toán rằng chỉ có khoảng 1% wt. phage từ liều dùng được phát hiện trong máu 10 phút sau khi tiêm tĩnh mạch. Sau sự suy giảm nhanh chóng ban đầu này, độ thanh thải chính chậm hơn đã được đo với thời gian bán hủy là 27,7 phút. Điều quan trọng là chỉ có rất ít phage được lấy ra từ khoang dịch não tủy, cho thấy nền thấp để phage loại hoang dã di chuyển vào khoang dịch não tủy (Hình bổ sung 3). Trung bình, chỉ có khoảng 1 x 10-3% nồng độ phage T7 trong máu và 4 x 10-8% phage được truyền ban đầu được phát hiện trong dịch não tủy trong toàn bộ thời gian lấy mẫu (0-250 phút). Đáng chú ý là thời gian bán hủy (25,7 phút) của phage loại hoang dã trong dịch não tủy tương tự như thời gian quan sát thấy trong máu. Những dữ liệu này chứng minh rằng hàng rào ngăn cách khoang dịch não tủy với máu vẫn còn nguyên vẹn ở những con chuột được đặt ống thông CM, cho phép lựa chọn thư viện phage trong cơ thể sống để xác định các bản sao dễ dàng được vận chuyển từ máu vào khoang dịch não tủy.
(a) Thiết lập phương pháp lấy mẫu lại dịch não tủy (CSF) từ một nhóm lớn. (b) Sơ đồ cho thấy vị trí tế bào của hàng rào hệ thần kinh trung ương (CNS) và chiến lược lựa chọn được sử dụng để xác định các peptide vượt qua hàng rào máu não (BBB) ​​và hàng rào máu não. (c) Sơ đồ quy trình sàng lọc hiển thị phage in vivo. Trong mỗi vòng lựa chọn, các phage (mã định danh động vật bên trong các mũi tên) được tiêm tĩnh mạch. Hai nhánh thay thế độc lập (A, B) được giữ riêng cho đến vòng lựa chọn thứ 4. Đối với vòng lựa chọn thứ 3 và thứ 4, mỗi bản sao phage được chiết xuất từ ​​​​dịch não tủy được giải trình tự thủ công. (d) Động học của phage được phân lập từ máu (vòng tròn màu đỏ) và dịch não tủy (hình tam giác màu xanh lá cây) trong vòng lựa chọn đầu tiên ở hai con chuột được tiêm tĩnh mạch thư viện peptide T7 (2 x 1012 phage/con vật). Các ô vuông màu xanh biểu thị nồng độ phage ban đầu trung bình trong máu, được tính toán từ lượng phage được tiêm, có tính đến tổng thể tích máu. Các ô vuông màu đen biểu thị điểm giao nhau của đường y được ngoại suy từ nồng độ phage trong máu. (e,f) Trình bày tần suất tương đối và phân bố của tất cả các họa tiết tripeptit chồng lấn có thể có trong peptit. Số lượng họa tiết tìm thấy trong 1000 lần đọc được hiển thị. Các họa tiết được làm giàu có ý nghĩa (p < 0,001) được đánh dấu bằng các chấm đỏ. (e) Biểu đồ phân tán tương quan so sánh tần suất tương đối của họa tiết tripeptit của thư viện được tiêm với phage có nguồn gốc từ máu từ động vật #1.1 và #1.2. (f) Biểu đồ phân tán tương quan so sánh tần suất tương đối của họa tiết tripeptit của phage động vật #1.1 và #1.2 được phân lập trong máu và dịch não tủy. (g, h) Biểu diễn ID trình tự của phage được làm giàu trong máu (g) ​​so với thư viện được tiêm và phage được làm giàu trong dịch não tủy (h) so với máu sau một vòng chọn lọc trong cơ thể sống ở cả hai động vật. Kích thước của mã một chữ cái cho biết tần suất axit amin đó xuất hiện ở vị trí đó. Xanh lá cây = phân cực, tím = trung tính, xanh lam = bazơ, đỏ = axit và đen = axit amin kỵ nước. Hình 1a, b được thiết kế và sản xuất bởi Eduard Urich.
Chúng tôi đã tiêm một thư viện peptide phage vào hai con chuột dụng cụ CM (nhóm A và B) và phân lập phage từ dịch não tủy và máu (Hình 1d). Quá trình thanh thải nhanh ban đầu của thư viện ít rõ rệt hơn so với phage kiểu hoang dã. Thời gian bán hủy trung bình của thư viện được tiêm ở cả hai con vật là 24,8 phút trong máu, tương tự như phage kiểu hoang dã và 38,5 phút trong dịch não tủy. Các mẫu phage máu và dịch não tủy từ mỗi con vật đã được xử lý bằng HTS và tất cả các peptide đã xác định được đều được phân tích để tìm sự hiện diện của một mô típ tripeptit ngắn. Các mô típ tripeptit được chọn vì chúng cung cấp cơ sở tối thiểu cho sự hình thành cấu trúc và tương tác peptide-protein14,15. Chúng tôi đã tìm thấy mối tương quan tốt trong sự phân bố các mô típ giữa thư viện phage được tiêm và các bản sao được chiết xuất từ ​​máu của cả hai con vật (Hình 1e). Dữ liệu chỉ ra rằng thành phần của thư viện chỉ được làm giàu một cách không đáng kể trong khoang máu. Tần suất axit amin và trình tự đồng thuận đã được phân tích thêm tại mỗi vị trí bằng cách sử dụng phần mềm Weblogo16. Điều thú vị là chúng tôi phát hiện thấy sự làm giàu mạnh mẽ trong các gốc glycine trong máu (Hình 1g). Khi so sánh máu với các dòng được chọn từ dịch não tủy, người ta quan sát thấy sự chọn lọc mạnh mẽ và một số kiểu mẫu bị loại bỏ (Hình 1f) và một số axit amin nhất định có mặt ưu tiên ở các vị trí được xác định trước trong 12 thành viên (Hình 1h). Đáng chú ý là các động vật riêng lẻ khác nhau đáng kể trong dịch não tủy, trong khi sự làm giàu glycine trong máu được quan sát thấy ở cả hai động vật (Hình bổ sung 4a–j). Sau khi lọc chặt chẽ dữ liệu trình tự trong dịch não tủy của các động vật #1.1 và #1.2, tổng cộng có 964 và 420 peptide 12-mer duy nhất đã thu được (Hình bổ sung 1d–e). Các dòng phage được phân lập đã được khuếch đại và trải qua vòng chọn lọc in vivo thứ hai. Phage được chiết xuất từ ​​vòng chọn lọc thứ hai đã được trải qua HTS ở mỗi động vật và tất cả các peptide đã xác định được đều được sử dụng làm đầu vào cho chương trình nhận dạng kiểu mẫu để phân tích sự xuất hiện của các kiểu mẫu tripeptit (Hình 2a, b, ef). So với chu kỳ đầu tiên của phage được phục hồi từ dịch não tủy, chúng tôi quan sát thấy sự chọn lọc và hủy chọn tiếp theo của nhiều mô típ trong dịch não tủy ở nhánh A và B (Hình 2). Một thuật toán nhận dạng mạng đã được áp dụng để xác định xem chúng có đại diện cho các kiểu khác nhau của trình tự nhất quán hay không. Một điểm tương đồng rõ ràng đã được quan sát thấy giữa các trình tự 12 chiều được phục hồi bởi dịch não tủy ở nhánh A thay thế (Hình 2c, d) và nhánh B (Hình 2g, h). Phân tích gộp trong mỗi nhánh đã tiết lộ các cấu hình chọn lọc khác nhau đối với các peptide 12-mer (Hình bổ sung 5c, d) và tỷ lệ nồng độ dịch não tủy/máu tăng theo thời gian đối với các bản sao gộp sau vòng chọn lọc thứ hai so với vòng chọn lọc đầu tiên (Hình bổ sung 5e). ).
Làm giàu các họa tiết và peptide trong dịch não tủy bằng hai vòng liên tiếp của quá trình lựa chọn hiển thị phage chức năng trong cơ thể sống.
Tất cả các phage dịch não tủy thu được từ vòng đầu tiên của mỗi con vật (con vật số 1.1 và số 1.2) đều được gom lại, khuếch đại, giải trình tự HT và tiêm lại cùng nhau (2 x 1010 phage/con vật) 2 con chuột được đặt ống thông SM (số 1.1 → số). 2.1 và 2.2, 1.2 → số 2.3 và 2.4). (a,b,e,f) Biểu đồ phân tán tương quan so sánh tần suất tương đối của các họa tiết tripeptit của tất cả các phage có nguồn gốc từ dịch não tủy trong vòng chọn lọc đầu tiên và thứ hai. Tần suất tương đối và sự phân bố của các họa tiết đại diện cho tất cả các tripeptit chồng lấn có thể có trong các peptit theo cả hai hướng. Số lượng họa tiết tìm thấy trong 1000 lần đọc được hiển thị. Các họa tiết được chọn hoặc loại trừ đáng kể (p < 0,001) trong một trong các thư viện được so sánh sẽ được đánh dấu bằng các chấm đỏ. (c, d, g, h) Biểu diễn logo trình tự của tất cả các trình tự dài 12 axit amin giàu dịch não tủy dựa trên vòng 2 và 1 của quá trình chọn lọc trong cơ thể sống. Kích thước của mã một chữ cái cho biết tần suất axit amin đó xuất hiện ở vị trí đó. Để biểu diễn logo, tần suất các trình tự dịch não tủy được chiết xuất từ ​​từng động vật giữa hai vòng chọn lọc được so sánh và các trình tự được làm giàu ở vòng thứ hai được hiển thị: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 và (h) #1.2–#2.4. Các axit amin được làm giàu nhất ở một vị trí nhất định trong (c, d) động vật số 2.1 và số 2.2 hoặc (g, h) ở động vật số 2.3 và số 2.4 được hiển thị bằng màu. Xanh lá cây = phân cực, tím = trung tính, xanh lam = bazơ, đỏ = axit và đen = axit amin kỵ nước.
Sau vòng chọn lọc thứ ba, chúng tôi đã xác định được 124 trình tự peptide độc ​​đáo (#3.1 và #3.2) từ 332 dòng phage tái tạo trong dịch não tủy được phân lập từ hai con vật (Hình bổ sung 6a). Trình tự LGSVS (18,7%) có tỷ lệ tương đối cao nhất, tiếp theo là các đoạn chèn kiểu hoang dã PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) và SARGSWREIVSLS (2,2%). Trong vòng thứ tư cuối cùng, chúng tôi đã tập hợp hai nhánh được chọn độc lập từ ba con vật riêng biệt (Hình 1c). Trong số 925 dòng phage đã giải trình tự thu được từ dịch não tủy, ở vòng thứ tư, chúng tôi đã tìm thấy 64 trình tự peptide độc ​​đáo (Hình bổ sung 6b), trong đó tỷ lệ tương đối của phage kiểu hoang dã giảm xuống còn 0,8%. Các bản sao CSF ​​phổ biến nhất trong vòng thứ tư là LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) và RLSSVDSDLSGC (3, 2%). Phạm vi chiều dài của các peptide được chọn là do chèn/xóa nucleotide hoặc codon dừng sớm trong các đoạn mồi thư viện khi sử dụng codon thoái hóa để thiết kế thư viện NNK. Codon dừng sớm tạo ra các peptide ngắn hơn và được chọn vì chúng chứa mô típ aa thuận lợi. Các peptide dài hơn có thể là kết quả của chèn/xóa trong các đoạn mồi của thư viện tổng hợp. Điều này định vị codon dừng được thiết kế bên ngoài khung và đọc nó cho đến khi một codon dừng mới xuất hiện ở hạ lưu. Nhìn chung, chúng tôi đã tính toán các yếu tố làm giàu cho tất cả bốn vòng lựa chọn bằng cách so sánh dữ liệu đầu vào với dữ liệu đầu ra mẫu. Đối với vòng sàng lọc đầu tiên, chúng tôi đã sử dụng các giá trị chuẩn phage kiểu hoang dã làm tham chiếu nền không đặc hiệu. Điều thú vị là, quá trình chọn lọc phage âm tính rất mạnh trong chu kỳ dịch não tủy đầu tiên, nhưng không phải trong máu (Hình 3a), điều này có thể là do khả năng khuếch tán thụ động của hầu hết các thành viên của thư viện peptide vào khoang dịch não tủy thấp hoặc các phage tương đối có xu hướng được giữ lại hoặc loại bỏ khỏi máu hiệu quả hơn so với các phage vi khuẩn. Tuy nhiên, trong vòng sàng lọc thứ hai, quá trình chọn lọc phage mạnh trong dịch não tủy đã được quan sát thấy ở cả hai nhánh, cho thấy rằng vòng trước đã được làm giàu trong các phage hiển thị các peptide thúc đẩy quá trình hấp thụ dịch não tủy (Hình 3a). Một lần nữa, không có sự làm giàu máu đáng kể. Cũng trong vòng thứ ba và thứ tư, các bản sao phage đã được làm giàu đáng kể trong dịch não tủy. So sánh tần suất tương đối của từng trình tự peptide duy nhất giữa hai vòng chọn lọc cuối cùng, chúng tôi thấy rằng các trình tự thậm chí còn được làm giàu hơn ở vòng chọn lọc thứ tư (Hình 3b). Tổng cộng 931 mô típ tripeptit đã được chiết xuất từ ​​tất cả 64 trình tự peptide duy nhất bằng cách sử dụng cả hai hướng peptide. Các mô típ được làm giàu nhất trong vòng thứ tư đã được kiểm tra kỹ lưỡng hơn về hồ sơ làm giàu của chúng trong tất cả các vòng so với thư viện được tiêm (ngưỡng cắt: làm giàu 10%) (Hình bổ sung 6c). Các mô hình chọn lọc chung cho thấy hầu hết các mô típ được nghiên cứu đều được làm giàu trong tất cả các vòng trước của cả hai nhánh chọn lọc. Tuy nhiên, một số mô típ (ví dụ SGL, VSG, LGS GSV) chủ yếu đến từ nhánh A thay thế, trong khi những mô típ khác (ví dụ FGW, RTN, WGF, NTR) được làm giàu trong nhánh B thay thế.
Xác nhận quá trình vận chuyển dịch não tủy của các peptide hiển thị phage giàu trong dịch não tủy và các peptide dẫn đầu biotin liên hợp với tải trọng streptavidin.
(a) Tỷ lệ làm giàu được tính toán trong cả bốn vòng (R1-R4) dựa trên nồng độ phage (PFU) được tiêm (đầu vào = I) và nồng độ phage CSF xác định (đầu ra = O). Các yếu tố làm giàu cho ba vòng cuối cùng (R2-R4) được tính toán bằng cách so sánh với vòng trước và vòng đầu tiên (R1) với dữ liệu trọng lượng. Các thanh mở là dịch não tủy, các thanh tô bóng là huyết tương. (***p <0,001, dựa trên kiểm định t của Student). (b) Danh sách các peptide phage phong phú nhất, được xếp hạng theo tỷ lệ tương đối của chúng so với tất cả các phage được thu thập trong CSF sau vòng 4 của quá trình chọn lọc. Sáu bản sao phage phổ biến nhất được tô sáng bằng màu, đánh số và các yếu tố làm giàu của chúng giữa vòng 3 và 4 của quá trình chọn lọc (phần chèn). (c, d) Sáu bản sao phage được làm giàu nhất, phage rỗng và thư viện peptide phage gốc từ vòng 4 đã được phân tích riêng lẻ trong mô hình lấy mẫu CSF. Các mẫu CSF và máu đã được thu thập tại các thời điểm đã chỉ định. (c) Số lượng bằng nhau của 6 dòng thực khuẩn thể ứng cử viên (2 x 1010 thực khuẩn thể/động vật), thực khuẩn thể rỗng (#1779) (2 x 1010 thực khuẩn thể/động vật) và thư viện peptide thực khuẩn thể dự trữ (2 x 1012 thực khuẩn thể/động vật) Tiêm ít nhất 3 CM được đưa vào động vật được tiêm riêng biệt qua tĩnh mạch đuôi. Dược động học dịch não tủy của mỗi dòng thực khuẩn thể được tiêm và thư viện peptide thực khuẩn thể theo thời gian được thể hiện. (d) thể hiện tỷ lệ dịch não tủy/máu trung bình cho tất cả các thực khuẩn thể thu hồi/mL trong suốt thời gian lấy mẫu. (e) Bốn peptide dẫn đầu tổng hợp và một đối chứng hỗn hợp được liên kết với biotin với streptavidin thông qua đầu N của chúng (hiển thị tetramer) sau đó tiêm (tĩnh mạch đuôi, 10 mg streptavidin/kg). Ít nhất ba con chuột được đặt nội khí quản (N = 3). ). Các mẫu dịch não tủy được thu thập tại các thời điểm đã chỉ định và nồng độ streptavidin được đo bằng ELISA anti-streptavidin dịch não tủy (nd = không phát hiện). (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, dựa trên thử nghiệm ANOVA). (f) So sánh trình tự axit amin của bản sao peptide phage được làm giàu nhất #2002 (màu tím) với các bản sao peptide phage được chọn khác từ vòng chọn lọc thứ 4. Các đoạn axit amin giống hệt nhau và tương tự được mã hóa màu.
Trong số tất cả các phage được làm giàu ở vòng thứ tư (Hình 3b), sáu bản sao ứng viên đã được chọn để phân tích riêng lẻ thêm trong mô hình lấy mẫu dịch não tủy. Một lượng bằng nhau của sáu phage ứng viên, phage rỗng (không có phần chèn) và thư viện peptide prophage đã được tiêm vào ba động vật CM được thông ống, và dược động học đã được xác định trong các xét nghiệm dịch não tủy (Hình 3c) và máu (Hình bổ sung 7). Tất cả các bản sao phage được thử nghiệm đều nhắm vào khoang dịch não tủy ở mức cao hơn 10-1000 lần so với phage đối chứng rỗng (#1779). Ví dụ, các bản sao #2020 và #2077 có nồng độ dịch não tủy cao hơn khoảng 1000 lần so với phage đối chứng. Hồ sơ dược động học của mỗi peptide được chọn là khác nhau, nhưng tất cả chúng đều có khả năng định vị CSF cao. Chúng tôi đã quan sát thấy sự giảm liên tục theo thời gian đối với các bản sao số #1903 và số #2011, trong khi đối với các bản sao số #2077, số #2002 và số #2009, sự gia tăng trong 10 phút đầu tiên có thể chỉ ra sự vận chuyển tích cực nhưng cần phải được xác minh. Các bản sao số #2020, số #2002 và số #2077 ổn định ở mức cao, trong khi nồng độ dịch não tủy của bản sao số #2009 giảm chậm sau khi tăng ban đầu. Sau đó, chúng tôi so sánh tần suất tương đối của từng ứng cử viên dịch não tủy với nồng độ trong máu của ứng cử viên đó (Hình 3d). Mối tương quan giữa nồng độ trung bình của từng ứng cử viên dịch não tủy với nồng độ trong máu của ứng cử viên đó tại mọi thời điểm lấy mẫu cho thấy ba trong số sáu ứng cử viên có hàm lượng dịch não tủy trong máu làm giàu đáng kể. Điều thú vị là bản sao số #2077 cho thấy độ ổn định trong máu cao hơn (Hình bổ sung 7). Để xác nhận rằng bản thân các peptide có khả năng vận chuyển tích cực các hàng hóa khác ngoài các hạt phage vào khoang dịch não tủy, chúng tôi đã tổng hợp bốn peptide dẫn xuất được tạo thành từ biotin tại đầu N, nơi các peptide gắn vào hạt phage. Các peptide biotin hóa (số 2002, 2009, 2020 và 2077) được liên hợp với streptavidin (SA) để thu được các dạng đa phân tử có phần mô phỏng hình dạng thực khuẩn thể. Định dạng này cũng cho phép chúng tôi đo mức độ phơi nhiễm SA trong máu và dịch não tủy dưới dạng các peptide protein vận chuyển hàng hóa. Điều quan trọng là dữ liệu về thực khuẩn thể thường có thể được tái tạo khi các peptide tổng hợp được đưa vào theo định dạng liên hợp SA này (Hình 3e). Các peptide hỗn hợp có mức độ phơi nhiễm ban đầu thấp hơn và thanh thải dịch não tủy nhanh hơn với mức không phát hiện được trong vòng 48 giờ. Để hiểu rõ hơn về các con đường đưa các dòng thực khuẩn thể peptide này vào không gian dịch não tủy, chúng tôi đã phân tích vị trí của từng peptide thực khuẩn thể bằng cách sử dụng miễn dịch mô hóa học (IHC) để phát hiện trực tiếp các hạt thực khuẩn thể 1 giờ sau khi tiêm tĩnh mạch trong cơ thể sống. Đáng chú ý, các bản sao #2002, #2077 và #2009 có thể được phát hiện bằng cách nhuộm màu mạnh trong các mao mạch não, trong khi phage kiểm soát (#1779) và bản sao #2020 không được phát hiện (Hình bổ sung 8). Điều này cho thấy các peptide này góp phần vào tác động lên não chính xác bằng cách vượt qua BBB. Cần phân tích chi tiết hơn nữa để kiểm tra giả thuyết này, vì tuyến đường BSCFB cũng có thể liên quan. Khi so sánh trình tự axit amin của bản sao được làm giàu nhất (#2002) với các peptide được chọn khác, người ta nhận thấy rằng một số trong số chúng có phần mở rộng axit amin tương tự, điều này có thể chỉ ra cơ chế vận chuyển tương tự (Hình 3f).
Do cấu hình huyết tương độc đáo và sự gia tăng đáng kể trong dịch não tủy theo thời gian, bản sao hiển thị phage #2077 đã được khám phá sâu hơn trong khoảng thời gian 48 giờ dài hơn và có thể tái tạo sự gia tăng nhanh chóng trong dịch não tủy được quan sát thấy liên quan đến mức SA duy trì (Hình 4a). Đối với các bản sao phage đã xác định khác, #2077 nhuộm màu mạnh đối với các mao mạch não và cho thấy sự đồng định vị đáng kể với lectin đánh dấu mao mạch khi xem ở độ phân giải cao hơn và có thể nhuộm một số trong không gian nhu mô (Hình 4b). Để nghiên cứu xem liệu có thể thu được các tác dụng dược lý do peptide trung gian trong CNS hay không, chúng tôi đã tiến hành một thí nghiệm trong đó các phiên bản biotin của i) peptide vận chuyển #2077 và ii) peptide ức chế BACE1 được trộn với SA theo hai tỷ lệ khác nhau. Đối với một sự kết hợp, chúng tôi chỉ sử dụng chất ức chế peptide BACE1 và đối với sự kết hợp khác, chúng tôi sử dụng tỷ lệ 1:3 của chất ức chế peptide BACE1 với peptide #2077. Cả hai mẫu đều được tiêm tĩnh mạch và nồng độ beta-amyloid peptide 40 (Abeta40) trong máu và dịch não tủy được đo theo thời gian. Abeta40 được đo trong dịch não tủy vì nó phản ánh sự ức chế BACE1 trong nhu mô não. Như mong đợi, cả hai phức hợp đều làm giảm đáng kể nồng độ Abeta40 trong máu (Hình 4c, d). Tuy nhiên, chỉ những mẫu chứa hỗn hợp peptide số 2077 và chất ức chế peptide BACE1 liên hợp với SA mới gây ra sự giảm đáng kể Abeta40 trong dịch não tủy (Hình 4c). Dữ liệu cho thấy peptide số 2077 có thể vận chuyển protein SA 60 kDa vào CNS và cũng gây ra các tác dụng dược lý với chất ức chế liên hợp SA của peptide BACE1.
(a) Tiêm vô tính (2 × 10 phage/con) phage T7 cho thấy hồ sơ dược động học dài hạn của peptide CSF #2077 (RLSSVDSDLSGC) và phage đối chứng không tiêm (#1779) ở ít nhất ba con chuột được đặt nội khí quản CM. (b) Hình ảnh vi mô cộng tiêu của các vi mạch vỏ não đại diện ở những con chuột được tiêm phage (2 × 10 10 phage/con) cho thấy sự nhuộm màu đối lập của peptide #2077 và các mạch máu (lectin). Các bản sao phage này được dùng cho 3 con chuột và để lưu thông trong 1 giờ trước khi tưới máu. Não được cắt lát và nhuộm bằng kháng thể đa dòng gắn nhãn FITC chống lại vỏ phage T7. Mười phút trước khi tưới máu và cố định sau đó, lectin gắn nhãn DyLight594 được tiêm tĩnh mạch. Hình ảnh huỳnh quang cho thấy nhuộm lectin (màu đỏ) ở phía lòng mạch của các vi mạch và phage (màu xanh lá cây) trong lòng mao mạch và mô não quanh mạch máu. Thanh tỷ lệ tương ứng với 10 µm. (c, d) Peptide ức chế BACE1 biotin hóa đơn lẻ hoặc kết hợp với peptide vận chuyển biotin hóa #2077 được ghép với streptavidin sau đó tiêm tĩnh mạch ít nhất ba con chuột CM được đặt ống thông (10 mg streptavidin/kg). Giảm Aβ40 do chất ức chế peptide BACE1 được đo bằng ELISA Aβ1-40 trong máu (màu đỏ) và dịch não tủy (màu cam) tại các thời điểm đã chỉ định. Để rõ ràng hơn, một đường chấm được vẽ trên đồ thị theo tỷ lệ 100%. (c) Tỷ lệ phần trăm giảm Aβ40 trong máu (hình tam giác màu đỏ) và dịch não tủy (hình tam giác màu cam) ở chuột được điều trị bằng streptavidin liên hợp với peptide vận chuyển #2077 và peptide ức chế BACE1 theo tỷ lệ 3:1. (d) Tỷ lệ phần trăm giảm Aβ40 trong máu (hình tròn màu đỏ) và dịch não tủy (hình tròn màu cam) của chuột được điều trị bằng streptavidin chỉ kết hợp với peptide ức chế BACE1. Nồng độ Aβ ở nhóm đối chứng là 420 pg/ml (độ lệch chuẩn = 101 pg/ml).
Hiển thị phage đã được áp dụng thành công trong một số lĩnh vực nghiên cứu y sinh17. Phương pháp này đã được sử dụng cho các nghiên cứu về tính đa dạng mạch máu trong cơ thể sống18,19 cũng như các nghiên cứu nhắm vào mạch máu não20,21,22,23,24,25,26. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã mở rộng ứng dụng của phương pháp chọn lọc này không chỉ để xác định trực tiếp các peptide nhắm vào mạch máu não mà còn để phát hiện ra các ứng viên có đặc tính vận chuyển tích cực để vượt qua hàng rào máu não. Bây giờ chúng tôi mô tả sự phát triển của quy trình chọn lọc trong cơ thể sống ở chuột được đặt nội khí quản CM và chứng minh tiềm năng của nó trong việc xác định các peptide có đặc tính định hướng dịch não tủy. Sử dụng phage T7 hiển thị thư viện các peptide ngẫu nhiên 12-mer, chúng tôi đã có thể chứng minh rằng phage T7 đủ nhỏ (đường kính khoảng 60 nm)10 để thích nghi với hàng rào máu não, do đó trực tiếp vượt qua hàng rào máu não hoặc đám rối màng mạch. Chúng tôi quan sát thấy rằng việc thu thập dịch não tủy từ chuột CM được đặt ống thông là một phương pháp sàng lọc chức năng in vivo được kiểm soát tốt và phage được chiết xuất không chỉ liên kết với mạch máu mà còn hoạt động như một chất vận chuyển qua hàng rào máu não. Hơn nữa, bằng cách đồng thời thu thập máu và áp dụng HTS vào dịch não tủy và phage có nguồn gốc từ máu, chúng tôi đã xác nhận rằng lựa chọn dịch não tủy của chúng tôi không bị ảnh hưởng bởi sự làm giàu máu hoặc khả năng mở rộng giữa các vòng chọn lọc. Tuy nhiên, khoang máu là một phần của quy trình chọn lọc, vì phage có khả năng tiếp cận khoang dịch não tủy phải tồn tại và lưu thông trong máu đủ lâu để làm giàu chính chúng trong não. Để trích xuất thông tin trình tự đáng tin cậy từ dữ liệu HTS thô, chúng tôi đã triển khai các bộ lọc được điều chỉnh theo lỗi giải trình tự cụ thể của nền tảng trong quy trình phân tích. Bằng cách kết hợp các thông số động học vào phương pháp sàng lọc, chúng tôi đã xác nhận dược động học nhanh của phage T7 kiểu hoang dã (t½ ~ 28 phút) trong máu24, 27, 28 và cũng xác định được thời gian bán hủy của chúng trong dịch não tủy (t½ ~ 26 phút) mỗi phút). Mặc dù có hồ sơ dược động học tương tự trong máu và dịch não tủy, chỉ có 0,001% nồng độ phage trong máu có thể được phát hiện trong dịch não tủy, cho thấy khả năng di chuyển nền thấp của phage T7 kiểu hoang dã qua hàng rào máu não. Công trình này nhấn mạnh tầm quan trọng của vòng lựa chọn đầu tiên khi sử dụng các chiến lược quét phage in vivo, đặc biệt là đối với các hệ thống phage được đào thải nhanh khỏi hệ tuần hoàn, vì ít bản sao nào có thể đến được khoang CNS. Do đó, trong vòng đầu tiên, sự giảm sút về tính đa dạng của thư viện là rất lớn, vì cuối cùng chỉ có một số lượng bản sao hạn chế được thu thập trong mô hình dịch não tủy rất nghiêm ngặt này. Chiến lược quét phage in vivo này bao gồm một số bước lựa chọn như tích lũy tích cực trong khoang dịch não tủy, sự sống sót của bản sao trong khoang máu và loại bỏ nhanh chóng các bản sao phage T7 khỏi máu trong vòng 10 phút đầu tiên (Hình 1d và Hình bổ sung 4M). Do đó, sau vòng đầu tiên, các bản sao phage khác nhau đã được xác định trong dịch não tủy, mặc dù cùng một nhóm ban đầu được sử dụng cho từng động vật. Điều này cho thấy rằng nhiều bước lựa chọn nghiêm ngặt đối với các thư viện nguồn có số lượng thành viên thư viện lớn dẫn đến sự giảm đáng kể về tính đa dạng. Do đó, các sự kiện ngẫu nhiên sẽ trở thành một phần không thể thiếu của quá trình lựa chọn ban đầu, ảnh hưởng rất lớn đến kết quả. Có khả năng là nhiều bản sao trong thư viện gốc có xu hướng làm giàu CSF rất giống nhau. Tuy nhiên, ngay cả trong cùng điều kiện thử nghiệm, kết quả lựa chọn có thể khác nhau do số lượng nhỏ của từng bản sao cụ thể trong nhóm ban đầu.
Các họa tiết làm giàu trong dịch não tủy khác với các họa tiết trong máu. Điều thú vị là chúng tôi đã ghi nhận sự dịch chuyển đầu tiên về phía các peptide giàu glycine trong máu của từng động vật. (Hình 1g, Hình bổ sung 4e, 4f). Các peptide glycine chứa phage có thể ổn định hơn và ít có khả năng bị loại khỏi lưu thông. Tuy nhiên, các peptide giàu glycine này không được phát hiện trong các mẫu dịch não tủy, điều này cho thấy các thư viện được quản lý đã trải qua hai bước lựa chọn khác nhau: một trong máu và một bước khác được phép tích tụ trong dịch não tủy. Các bản sao làm giàu dịch não tủy thu được từ vòng lựa chọn thứ tư đã được thử nghiệm rộng rãi. Hầu như tất cả các bản sao được thử nghiệm riêng lẻ đều được xác nhận là làm giàu trong dịch não tủy so với phage đối chứng trống. Một lần trúng peptide (#2077) đã được kiểm tra chi tiết hơn. Nó cho thấy thời gian bán hủy trong huyết tương dài hơn so với các lần trúng khác (Hình 3d và Hình bổ sung 7) và điều thú vị là peptide này chứa một dư lượng cysteine ​​​​ở đầu C. Gần đây người ta đã chỉ ra rằng việc bổ sung cysteine ​​​​vào peptide có thể cải thiện các đặc tính dược động học của chúng bằng cách liên kết với albumin 29. Hiện tại, điều này chưa được biết đối với peptide #2077 và cần được nghiên cứu thêm. Một số peptide cho thấy sự phụ thuộc vào hóa trị trong quá trình làm giàu dịch não tủy (dữ liệu không được hiển thị), điều này có thể liên quan đến hình học bề mặt được hiển thị của capsid T7. Hệ thống T7 mà chúng tôi sử dụng cho thấy 5-15 bản sao của mỗi peptide trên mỗi hạt phage. IHC đã được thực hiện trên các bản sao phage chì ứng cử viên được tiêm tĩnh mạch vào vỏ não của chuột (Hình bổ sung 8). Dữ liệu cho thấy ít nhất ba bản sao (Số 2002, Số 2009 và Số 2077) đã tương tác với BBB. Vẫn chưa xác định được liệu tương tác BBB này có dẫn đến sự tích tụ của dịch não tủy hay sự di chuyển của các bản sao này trực tiếp đến BCSFB hay không. Điều quan trọng là chúng tôi chỉ ra rằng các peptide đã chọn vẫn giữ được khả năng vận chuyển dịch não tủy của chúng khi được tổng hợp và liên kết với protein vận chuyển. Liên kết của các peptide biotin hóa đầu N với SA về cơ bản lặp lại các kết quả thu được với các bản sao phage tương ứng của chúng trong máu và dịch não tủy (Hình 3e). Cuối cùng, chúng tôi chỉ ra rằng peptide dẫn đầu #2077 có thể thúc đẩy hoạt động của não đối với chất ức chế peptide biotin hóa của BACE1 liên hợp với SA, gây ra các tác dụng dược động học rõ rệt trong CNS bằng cách làm giảm đáng kể nồng độ Abeta40 trong CSF (Hình 4). Chúng tôi không thể xác định bất kỳ đồng đẳng nào trong cơ sở dữ liệu bằng cách thực hiện tìm kiếm đồng đẳng trình tự peptide của tất cả các lần truy cập. Điều quan trọng cần lưu ý là kích thước của thư viện T7 xấp xỉ 109, trong khi kích thước thư viện lý thuyết cho 12-mer là 4 x 1015. Do đó, chúng tôi chỉ chọn một phần nhỏ trong không gian đa dạng của thư viện peptide 12-mer, điều này có thể có nghĩa là có thể xác định các peptide được tối ưu hóa hơn bằng cách đánh giá không gian trình tự liền kề của các lần truy cập đã xác định này. Về mặt giả thuyết, một trong những lý do khiến chúng ta không tìm thấy bất kỳ đồng đẳng tự nhiên nào của các peptide này có thể là do quá trình loại bỏ trong quá trình tiến hóa nhằm ngăn chặn sự xâm nhập không kiểm soát của một số mô típ peptide nhất định vào não.
Tổng hợp lại, kết quả của chúng tôi cung cấp cơ sở cho công việc trong tương lai nhằm xác định và mô tả chi tiết hơn các hệ thống vận chuyển của hàng rào mạch máu não trong cơ thể sống. Thiết lập cơ bản của phương pháp này dựa trên chiến lược lựa chọn chức năng không chỉ xác định các bản sao có đặc tính liên kết mạch máu não mà còn bao gồm một bước quan trọng trong đó các bản sao thành công có hoạt động nội tại để vượt qua các rào cản sinh học trong cơ thể sống vào khoang CNS. là làm sáng tỏ cơ chế vận chuyển các peptide này và sở thích của chúng đối với việc liên kết với vi mạch cụ thể của vùng não. Điều này có thể dẫn đến việc khám phá ra các con đường mới để vận chuyển BBB và các thụ thể. Chúng tôi hy vọng rằng các peptide đã xác định có thể liên kết trực tiếp với các thụ thể mạch máu não hoặc với các phối tử lưu thông được vận chuyển qua BBB hoặc BCSFB. Các vectơ peptide có hoạt động vận chuyển CSF được phát hiện trong công trình này sẽ được nghiên cứu thêm. Hiện tại, chúng tôi đang nghiên cứu tính đặc hiệu của não đối với các peptide này về khả năng vượt qua BBB và/hoặc BCSFB. Những peptide mới này sẽ là công cụ cực kỳ giá trị cho khả năng khám phá các thụ thể hoặc con đường mới và cho sự phát triển các nền tảng mới có hiệu quả cao để đưa các đại phân tử, chẳng hạn như chất sinh học, vào não.
Đặt ống thông vào bể lớn (CM) bằng cách sử dụng một sửa đổi của phương pháp đã mô tả trước đó. Chuột Wistar gây mê (200-350 g) được gắn vào một thiết bị định vị lập thể và một vết rạch ở giữa được thực hiện trên da đầu đã cạo và được chuẩn bị vô trùng để lộ hộp sọ. Khoan hai lỗ ở khu vực của dây chằng trên và vặn chặt các vít cố định vào các lỗ. Một lỗ bổ sung được khoan ở mào chẩm bên để hướng dẫn định vị lập thể của ống thông bằng thép không gỉ vào CM. Bôi xi măng nha khoa xung quanh ống thông và cố định bằng vít. Sau khi quang trùng hợp và xi măng đông cứng, vết thương trên da được đóng lại bằng chỉ khâu supramid 4/0. Vị trí đặt ống thông thích hợp được xác nhận bằng cách rò rỉ tự nhiên dịch não tủy (CSF). Lấy chuột ra khỏi thiết bị định vị lập thể, được chăm sóc hậu phẫu thích hợp và kiểm soát cơn đau, và để chuột hồi phục trong ít nhất một tuần cho đến khi quan sát thấy dấu hiệu có máu trong dịch não tủy. Chuột Wistar (Crl:WI/Han) được lấy từ Charles River (Pháp). Tất cả chuột đều được nuôi trong điều kiện không có mầm bệnh cụ thể. Tất cả các thí nghiệm trên động vật đều được Văn phòng Thú y của Thành phố Basel, Thụy Sĩ chấp thuận và được thực hiện theo Giấy phép Động vật số 2474 (Đánh giá Vận chuyển Não tích cực bằng cách Đo mức độ Ứng viên Trị liệu trong Dịch não tủy và Não của Chuột).
Nhẹ nhàng giữ cho chuột tỉnh táo với ống thông CM trong tay. Lấy cây Datura ra khỏi ống thông và thu thập 10 µl dịch não tủy chảy tự nhiên. Vì tính thông suốt của ống thông cuối cùng đã bị tổn hại, nên chỉ những mẫu dịch não tủy trong suốt không có bằng chứng nhiễm máu hoặc đổi màu mới được đưa vào nghiên cứu này. Song song đó, khoảng 10–20 μl máu được lấy từ một vết rạch nhỏ ở đầu đuôi vào các ống có heparin (Sigma-Aldrich). Dịch não tủy và máu được thu thập tại các thời điểm khác nhau sau khi tiêm tĩnh mạch phage T7. Khoảng 5–10 μl chất lỏng được loại bỏ trước khi thu thập mỗi mẫu dịch não tủy, tương ứng với thể tích chết của ống thông.
Thư viện được tạo ra bằng cách sử dụng vectơ T7Select 10-3b như được mô tả trong hướng dẫn hệ thống T7Select (Novagen, Rosenberg và cộng sự, InNovations 6, 1-6, 1996). Tóm lại, một đoạn chèn DNA 12-mer ngẫu nhiên đã được tổng hợp theo định dạng sau:
Bộ ba NNK được sử dụng để tránh bộ ba dừng kép và sự biểu hiện quá mức axit amin trong đoạn chèn. N là tỷ lệ mol tương đương được trộn thủ công của mỗi nucleotide và K là tỷ lệ mol tương đương được trộn thủ công của các nucleotide adenine và cytosine. Các vùng mạch đơn được chuyển đổi thành DNA mạch kép bằng cách ủ thêm với dNTP (Novagen) và enzyme Klenow (New England Biolabs) trong đệm Klenow (New England Biolabs) trong 3 giờ ở 37°C. Sau phản ứng, DNA mạch đôi được thu hồi bằng cách kết tủa EtOH. DNA thu được được tiêu hóa bằng các enzyme hạn chế EcoRI và HindIII (cả hai đều từ Roche). Đoạn chèn đã cắt và tinh khiết (QIAquick, Qiagen) (T4 ligase, New England Biolabs) sau đó được nối trong khung vào vectơ T7 đã cắt trước sau axit amin 348 của gen capsid 10B. Phản ứng nối được ủ ở 16° C trong 18 giờ trước khi đóng gói trong ống nghiệm. Đóng gói phage trong ống nghiệm được thực hiện theo hướng dẫn đi kèm với bộ dụng cụ nhân bản T7Select 10-3b (Novagen) và dung dịch đóng gói được khuếch đại một lần để ly giải bằng Escherichia coli (BLT5615, Novagen). Các chất ly giải được ly tâm, chuẩn độ và đông lạnh ở -80° C dưới dạng dung dịch dự trữ glycerol.
Sự khuếch đại PCR trực tiếp các vùng biến đổi phage được khuếch đại trong môi trường nuôi cấy hoặc đĩa sử dụng các đoạn mồi hợp nhất 454/Roche-amplicon độc quyền. Đoạn mồi hợp nhất hướng tới chứa các trình tự bao quanh vùng biến đổi (NNK) 12 (đặc hiệu cho khuôn mẫu), GS FLX Titanium Adapter A và trình tự khóa thư viện bốn bazơ (TCAG) (Hình bổ sung 1a):
Mồi phản ứng tổng hợp ngược cũng chứa biotin gắn vào các hạt bắt giữ và Bộ chuyển đổi GS FLX Titanium B cần thiết cho quá trình khuếch đại dòng trong quá trình PCR nhũ tương:
Các amplicon sau đó được tiến hành giải trình tự pyrosequencing 454/Roche theo giao thức 454 GS-FLX Titanium. Đối với giải trình tự Sanger thủ công (Máy phân tích DNA Hitachi 3730 xl của Applied Biosystems), DNA phage T7 được khuếch đại bằng PCR và giải trình tự với các cặp mồi sau:
Các đoạn chèn từ các mảng riêng lẻ được tiến hành khuếch đại PCR bằng Bộ DNA Polymerase Roche Fast Start (theo hướng dẫn của nhà sản xuất). Thực hiện khởi động nóng (10 phút ở 95 °C) và 35 chu kỳ tăng cường (50 giây ở 95 °C, 1 phút ở 50 °C và 1 phút ở 72 °C).
Phage từ thư viện, phage kiểu hoang dã, phage cứu từ dịch não tủy và máu, hoặc các bản sao riêng lẻ được khuếch đại trong Escherichia coli BL5615 trong môi trường nuôi cấy TB (Sigma Aldrich) hoặc trong đĩa 500 cm2 (Thermo Scientific) trong 4 giờ ở 37°C. Phage được chiết xuất từ ​​các đĩa bằng cách rửa đĩa bằng đệm Tris-EDTA (Fluka Analytical) hoặc bằng cách thu thập các mảng bám bằng đầu pipet vô trùng. Phage được phân lập từ dịch nuôi cấy hoặc đệm chiết xuất với một vòng kết tủa polyethylene glycol (PEG 8000) (Promega) và được huyền phù lại trong đệm Tris-EDTA.
Phage khuếch đại được đưa vào 2-3 vòng loại bỏ nội độc tố bằng hạt loại bỏ nội độc tố (Miltenyi Biotec) trước khi tiêm tĩnh mạch (IV) (500 μl/con). Ở vòng đầu tiên, 2×1012 phage được đưa vào; ở vòng thứ hai, 2×1010 phage; ở vòng chọn lọc thứ ba và thứ tư, 2×109 phage trên mỗi con vật. Hàm lượng phage trong các mẫu máu và dịch não tủy được thu thập tại các thời điểm chỉ định được xác định bằng cách đếm mảng bám theo hướng dẫn của nhà sản xuất (sổ tay hướng dẫn hệ thống T7Select). Việc chọn lọc phage được thực hiện bằng cách tiêm tĩnh mạch các thư viện đã tinh chế vào tĩnh mạch đuôi hoặc tiêm lại phage được chiết xuất từ ​​dịch não tủy từ vòng chọn lọc trước đó và các lần thu hoạch tiếp theo được thực hiện ở các thời điểm tương ứng là 10 phút, 30 phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút, 180 phút và 240 phút vào các mẫu máu và dịch não tủy. Tổng cộng bốn vòng quét in vivo đã được tiến hành trong đó hai nhánh được chọn đã được lưu trữ và phân tích riêng biệt trong ba vòng chọn lọc đầu tiên. Tất cả các đoạn chèn phage được chiết xuất từ ​​dịch não tủy từ hai vòng chọn lọc đầu tiên đã trải qua quá trình giải trình tự pyrosequencing 454/Roche, trong khi tất cả các bản sao được chiết xuất từ ​​dịch não tủy từ hai vòng chọn lọc cuối cùng đã được giải trình tự thủ công. Tất cả các phage máu từ vòng chọn lọc đầu tiên cũng đã trải qua quá trình giải trình tự pyrosequencing 454/Roche. Để tiêm các bản sao phage, các phage đã chọn đã được khuếch đại trong E. coli (BL5615) trên các đĩa 500 cm2 ở 37°C trong 4 giờ. Các bản sao được chọn riêng lẻ và giải trình tự thủ công đã được nhân giống trong môi trường TB. Sau khi chiết xuất phage, tinh chế và loại bỏ nội độc tố (như mô tả ở trên), 2×1010 phage/động vật trong 300 μl đã được tiêm tĩnh mạch vào một tĩnh mạch đuôi.
Tiền xử lý và lọc định tính dữ liệu trình tự. Dữ liệu 454/Roche thô được chuyển đổi từ định dạng bản đồ luồng chuẩn nhị phân (sff) sang định dạng có thể đọc được của Pearson (fasta) bằng phần mềm của nhà cung cấp. Quá trình xử lý tiếp theo của trình tự nucleotide được thực hiện bằng các chương trình và tập lệnh C độc quyền (gói phần mềm chưa phát hành) như mô tả bên dưới. Phân tích dữ liệu chính bao gồm các quy trình lọc nhiều giai đoạn nghiêm ngặt. Để lọc ra các lần đọc không chứa trình tự DNA chèn 12mer hợp lệ, các lần đọc được căn chỉnh tuần tự thành nhãn bắt đầu (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), nhãn dừng (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) và chèn nền (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) bằng cách sử dụng thử nghiệm Needleman-Wunsch toàn cầu. căn chỉnh cho phép tối đa 2 lần không nhất quán trên mỗi lần căn chỉnh31. Do đó, các lần đọc không có thẻ bắt đầu và dừng và các lần đọc chứa chèn nền, tức là các căn chỉnh vượt quá số lượng không khớp được phép, đã bị xóa khỏi thư viện. Đối với các lần đọc còn lại, trình tự DNA N-mer kéo dài từ dấu bắt đầu và kết thúc trước dấu dừng đã được cắt khỏi trình tự đọc ban đầu và được xử lý thêm (sau đây gọi là "chèn"). Sau khi dịch chèn, phần sau codon dừng đầu tiên ở đầu 5' của đoạn mồi được loại bỏ khỏi chèn. Ngoài ra, các nucleotide dẫn đến codon không đầy đủ ở đầu 3' của đoạn mồi cũng bị loại bỏ. Để loại trừ các chèn chỉ chứa trình tự nền, các chèn đã dịch bắt đầu bằng mẫu axit amin "PAG" cũng bị loại bỏ. Các peptide có chiều dài sau dịch mã nhỏ hơn 3 axit amin đã bị loại bỏ khỏi thư viện. Cuối cùng, loại bỏ phần trùng lặp trong nhóm chèn và xác định tần suất của từng chèn duy nhất. Kết quả của phân tích này bao gồm danh sách các trình tự nucleotide (chèn) và tần suất (đọc) của chúng (Hình bổ sung 1c và 2).
Nhóm các đoạn chèn DNA N-mer theo độ tương đồng trình tự: Để loại bỏ các lỗi giải trình tự đặc hiệu 454/Roche (chẳng hạn như các vấn đề với phần mở rộng homopolymer giải trình tự) và loại bỏ các phần trùng lặp ít quan trọng hơn, các đoạn chèn trình tự DNA N-mer đã lọc trước đó (các đoạn chèn) được sắp xếp theo độ tương đồng. Các đoạn chèn (cho phép tối đa 2 bazơ không khớp) bằng thuật toán lặp được định nghĩa như sau: các đoạn chèn trước tiên được sắp xếp theo tần suất (cao nhất đến thấp nhất) và nếu chúng giống nhau, theo thứ tự thứ cấp theo độ dài (dài nhất đến ngắn nhất)). Do đó, các đoạn chèn thường xuyên nhất và dài nhất sẽ xác định "nhóm" đầu tiên. Tần suất nhóm được đặt thành tần suất chính. Sau đó, mỗi đoạn chèn còn lại trong danh sách đã sắp xếp được thử thêm vào nhóm theo phép căn chỉnh Needleman-Wunsch từng cặp. Nếu số lượng các đoạn không khớp, đoạn chèn hoặc đoạn xóa trong phép căn chỉnh không vượt quá ngưỡng 2, đoạn chèn sẽ được thêm vào nhóm và tần suất nhóm tổng thể sẽ tăng lên theo tần suất chèn được thêm vào. Các đoạn chèn được thêm vào nhóm sẽ được đánh dấu là đã sử dụng và bị loại khỏi quá trình xử lý tiếp theo. Nếu không thể thêm trình tự chèn vào một nhóm đã tồn tại, trình tự chèn sẽ được sử dụng để tạo một nhóm mới với tần suất chèn phù hợp và được đánh dấu là đã sử dụng. Quá trình lặp lại kết thúc khi mỗi trình tự chèn đã được sử dụng để tạo thành một nhóm mới hoặc có thể được đưa vào một nhóm đã tồn tại. Sau cùng, các trình tự chèn được nhóm lại bao gồm các nucleotide cuối cùng sẽ được dịch thành các trình tự peptide (thư viện peptide). Kết quả của phân tích này là một tập hợp các trình tự chèn và tần suất tương ứng của chúng tạo nên số lần đọc liên tiếp (Hình bổ sung 2).
Tạo Motif: Dựa trên danh sách các peptide duy nhất, một thư viện đã được tạo ra chứa tất cả các mẫu axit amin có thể (aa) như được hiển thị bên dưới. Mỗi mẫu có thể có độ dài 3 được trích xuất từ ​​peptide và mẫu nghịch đảo của nó được thêm vào cùng với một thư viện motif chung chứa tất cả các mẫu (tripeptide). Các thư viện của các motif có độ lặp lại cao đã được giải trình tự và loại bỏ sự trùng lặp. Sau đó, đối với mỗi tripeptit trong thư viện motif, chúng tôi đã kiểm tra sự hiện diện của nó trong thư viện bằng các công cụ tính toán. Trong trường hợp này, tần suất của peptide chứa tripeptide motif đã tìm thấy được thêm vào và gán cho motif trong thư viện motif ("số motif"). Kết quả của việc tạo motif là một mảng hai chiều chứa tất cả các lần xuất hiện của tripeptit (motif) và các giá trị tương ứng của chúng, đó là số lần đọc trình tự tạo ra motif tương ứng khi các lần đọc được lọc, nhóm và dịch. Các số liệu như mô tả chi tiết ở trên.
Chuẩn hóa số lượng họa tiết và biểu đồ phân tán tương ứng: Số lượng họa tiết cho mỗi mẫu được chuẩn hóa bằng cách sử dụng
trong đó ni là số lần đọc chứa chủ đề i. Do đó, vi biểu thị tần suất phần trăm các lần đọc (hoặc peptide) chứa chủ đề i trong mẫu. Giá trị P cho số chủ đề không chuẩn hóa được tính toán bằng cách sử dụng kiểm định chính xác của Fisher. Đối với biểu đồ tương quan của số chủ đề, tương quan Spearman được tính toán bằng cách sử dụng số chủ đề chuẩn hóa với R.
Để trực quan hóa hàm lượng axit amin tại mỗi vị trí trong thư viện peptide, logogram web 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) đã được tạo. Đầu tiên, hàm lượng axit amin tại mỗi vị trí của peptide 12-mer được lưu trữ trong ma trận 20×12. Sau đó, một tập hợp 1000 peptide chứa cùng hàm lượng axit amin tương đối tại mỗi vị trí được tạo theo định dạng fasta-sequence và được cung cấp làm đầu vào cho logo web 3, tạo ra biểu diễn đồ họa về hàm lượng axit amin tương đối tại mỗi vị trí. cho một thư viện peptide nhất định. Để trực quan hóa các tập dữ liệu đa chiều, bản đồ nhiệt đã được tạo bằng một công cụ được phát triển nội bộ trong R (biosHeatmap, một gói R chưa được phát hành). Các biểu đồ phân nhánh được trình bày trong bản đồ nhiệt đã được tính toán bằng phương pháp phân cụ phân cấp của Ward với số liệu khoảng cách Euclid. Đối với phân tích thống kê dữ liệu chấm điểm mô típ, các giá trị P cho điểm không chuẩn hóa đã được tính toán bằng cách sử dụng kiểm định chính xác của Fisher. Giá trị P cho các tập dữ liệu khác được tính toán trong R bằng cách sử dụng kiểm định t của Student hoặc ANOVA.
Các dòng phage và phage không có phần chèn được tiêm tĩnh mạch qua tĩnh mạch đuôi (2×1010 phage/con trong 300 μl PBS). Mười phút trước khi truyền dịch và cố định sau đó, những con vật tương tự được tiêm tĩnh mạch 100 μl lectin gắn nhãn DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177). 60 phút sau khi tiêm phage, chuột được truyền dịch qua tim bằng 50 ml PBS tiếp theo là 50 ml 4% PFA/PBS. Các mẫu não cũng được cố định qua đêm trong 4% PFA/PBS và ngâm trong 30% sucrose qua đêm ở 4°C. Các mẫu được đông lạnh nhanh trong hỗn hợp OCT. Phân tích miễn dịch mô hóa học của các mẫu đông lạnh được thực hiện ở nhiệt độ phòng trên các lát cắt đông lạnh 30 µm được chặn bằng 1% BSA và ủ với kháng thể gắn nhãn FITC đa dòng chống lại phage T7 (Novus NB 600-376A) ở 4 °C. Ủ qua đêm. Cuối cùng, các lát cắt được rửa 3 lần bằng PBS và kiểm tra bằng kính hiển vi laser cộng hưởng (Leica TCS SP5).
Tất cả các peptide có độ tinh khiết tối thiểu là 98% đều được tổng hợp bởi GenScript USA, biotin hóa và đông khô. Biotin được liên kết thông qua một chất giãn cách ba glycine bổ sung ở đầu N. Kiểm tra tất cả các peptide bằng phương pháp khối phổ.
Streptavidin (Sigma S0677) được trộn với lượng peptide biotinylated dư thừa gấp 5 lần, peptide ức chế BACE1 biotinylated hoặc kết hợp (tỷ lệ 3:1) peptide ức chế BACE1 biotinylated và peptide ức chế BACE1 trong 5–10% DMSO/ủ trong PBS. 1 giờ ở nhiệt độ phòng trước khi tiêm. Peptide liên hợp với streptavidin được tiêm tĩnh mạch với liều 10 mg/kg vào một trong các tĩnh mạch đuôi của chuột có khoang não.
Nồng độ phức hợp streptavidin-peptide được đánh giá bằng ELISA. Các đĩa vi mô Nunc Maxisorp (Sigma) được phủ qua đêm ở 4°C bằng kháng thể kháng streptavidin của chuột 1,5 μg/ml (Thermo, MA1-20011). Sau khi chặn (đệm chặn: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% gelatin, 1% BSA) ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ, rửa đĩa bằng 0,05% Tween-20/PBS (đệm rửa) trong 3 giây, các mẫu dịch não tủy và huyết tương được thêm vào các giếng pha loãng bằng đệm chặn (huyết tương 1:10.000, dịch não tủy 1:115). Sau đó, đĩa được ủ qua đêm ở 4°C với kháng thể phát hiện (1 μg/ml, kháng streptavidin-HRP, Novus NB120-7239). Sau ba bước rửa, streptavidin được phát hiện bằng cách ủ trong dung dịch nền TMB (Roche) trong tối đa 20 phút. Sau khi dừng quá trình phát triển màu bằng 1M H2SO4, đo độ hấp thụ ở 450 nm.
Chức năng của phức hợp chất ức chế streptavidin-peptide-BACE1 được đánh giá bằng ELISA Aβ(1-40) theo giao thức của nhà sản xuất (Wako, 294-64701). Tóm lại, các mẫu dịch não tủy được pha loãng trong chất pha loãng chuẩn (1:23) và ủ qua đêm ở 4°C trong các đĩa 96 giếng được phủ kháng thể bắt giữ BNT77. Sau năm bước rửa, kháng thể BA27 liên hợp HRP được thêm vào và ủ trong 2 giờ ở 4°C, sau đó là năm bước rửa. Aβ(1–40) được phát hiện bằng cách ủ trong dung dịch TMB trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Sau khi dừng sự phát triển màu bằng dung dịch dừng, đo độ hấp thụ ở 450 nm. Các mẫu huyết tương được chiết pha rắn trước khi tiến hành ELISA Aβ(1–40). Huyết tương được thêm vào 0,2% DEA (Sigma) trong các đĩa 96 giếng và ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Sau khi rửa liên tiếp các tấm SPE (Oasis, 186000679) bằng nước và 100% methanol, các mẫu huyết tương được thêm vào các tấm SPE và loại bỏ toàn bộ chất lỏng. Các mẫu được rửa (đầu tiên bằng 5% methanol sau đó là 30% methanol) và rửa giải bằng 2% NH4OH/90% methanol. Sau khi sấy khô dịch rửa giải ở 55°C trong 99 phút ở dòng điện N2 không đổi, các mẫu được khử trong chất pha loãng chuẩn và Aβ(1–40) được đo như mô tả ở trên.
Cách trích dẫn bài viết này: Urich, E. et al. Vận chuyển hàng hóa đến não bằng cách sử dụng các peptide vận chuyển được xác định trong cơ thể sống. khoa học. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB và Moos T. Vận chuyển thuốc đại phân tử đến não bằng liệu pháp nhắm mục tiêu. Tạp chí Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., và Martinez-Martinez, P. Vận chuyển thuốc peptide và protein qua hàng rào máu não. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Hàng rào máu não: một nút thắt trong quá trình phát triển thuốc não. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG và Byrd, A. Triển vọng cải thiện việc cung cấp thuốc và nhắm mục tiêu đến não thông qua con đường đám rối màng mạch-CSF. Nghiên cứu dược phẩm 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Hiện đại hóa dược phẩm sinh học với Trojan horse phân tử để đưa vào não. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, Vận chuyển peptide qua trung gian thụ thể WM qua hàng rào máu não. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al. Tăng cường khả năng thâm nhập não và hiệu quả của kháng thể điều trị bằng cách sử dụng các con thoi phân tử đơn trị. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al. Vận chuyển thụ thể transferrin (TfR) xác định sự hấp thụ các biến thể ái lực của kháng thể TfR vào não. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).