Cảm ơn bạn đã ghé thăm Nature.com.Bạn đang sử dụng phiên bản trình duyệt có hỗ trợ CSS hạn chế.Để có trải nghiệm tốt nhất, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng trình duyệt cập nhật (hoặc tắt Chế độ tương thích trong Internet Explorer).Ngoài ra, để đảm bảo hỗ trợ liên tục, chúng tôi hiển thị trang web không có kiểu và JavaScript.
Hiển thị một băng chuyền gồm ba trang trình bày cùng một lúc.Sử dụng các nút Trước và Tiếp theo để di chuyển qua ba trang chiếu cùng một lúc hoặc sử dụng các nút thanh trượt ở cuối để di chuyển qua ba trang chiếu cùng một lúc.
Hàng rào máu não và hàng rào máu não ngăn chặn các tác nhân trị liệu sinh học đạt được mục tiêu của chúng trong hệ thống thần kinh trung ương, do đó cản trở việc điều trị hiệu quả các bệnh thần kinh.Để khám phá các chất vận chuyển não mới in vivo, chúng tôi đã giới thiệu một thư viện peptide phage T7 và thu thập huyết thanh máu và dịch não tủy (CSF) bằng cách sử dụng mô hình nhóm chuột lớn có ý thức.Các dòng vô tính phage cụ thể đã được làm giàu cao trong CSF sau bốn vòng lựa chọn.Thử nghiệm các peptit ứng cử viên riêng lẻ cho thấy làm giàu hơn 1000 lần trong CSF.Hoạt tính sinh học của quá trình vận chuyển qua trung gian peptit đến não đã được xác nhận bằng cách giảm 40% mức amyloid-β trong dịch não tủy bằng cách sử dụng chất ức chế peptit BACE1 liên kết với peptit vận chuyển mới được xác định.Những kết quả này cho thấy rằng các peptide được xác định bằng phương pháp lựa chọn thể thực khuẩn in vivo có thể là phương tiện hữu ích để cung cấp các đại phân tử có hệ thống cho não với tác dụng điều trị.
Nghiên cứu liệu pháp nhắm mục tiêu hệ thống thần kinh trung ương (CNS) chủ yếu tập trung vào việc xác định các loại thuốc và tác nhân được tối ưu hóa thể hiện các đặc tính nhắm mục tiêu CNS, với ít nỗ lực hơn trong việc khám phá các cơ chế thúc đẩy quá trình vận chuyển thuốc tích cực đến não.Điều này hiện đang bắt đầu thay đổi khi việc vận chuyển thuốc, đặc biệt là các phân tử lớn, là một phần không thể thiếu trong quá trình phát triển thuốc khoa học thần kinh hiện đại.Môi trường của hệ thần kinh trung ương được bảo vệ tốt bởi hệ thống hàng rào mạch máu não, bao gồm hàng rào máu não (BBB) ​​và hàng rào máu não (BCBB)1, khiến việc đưa thuốc lên não gặp nhiều khó khăn1,2.Người ta ước tính rằng gần như tất cả các loại thuốc phân tử lớn và hơn 98% thuốc phân tử nhỏ được loại bỏ khỏi não3.Đó là lý do tại sao việc xác định các hệ thống vận chuyển não mới cung cấp việc vận chuyển hiệu quả và cụ thể các loại thuốc điều trị đến CNS 4,5 là rất quan trọng.Tuy nhiên, BBB và BCSFB cũng mang đến cơ hội tuyệt vời để phân phối thuốc khi chúng xâm nhập và đi vào tất cả các cấu trúc của não thông qua hệ thống mạch máu rộng lớn của nó.Do đó, những nỗ lực hiện tại để sử dụng các phương pháp phân phối không xâm lấn đến não phần lớn dựa trên cơ chế vận chuyển qua trung gian thụ thể (PMT) bằng cách sử dụng thụ thể BBB6 nội sinh.Mặc dù có những tiến bộ quan trọng gần đây khi sử dụng con đường thụ thể transferrin7,8, nhưng cần phải phát triển thêm các hệ thống phân phối mới với các đặc tính được cải thiện.Cuối cùng, mục tiêu của chúng tôi là xác định các peptide có khả năng làm trung gian vận chuyển CSF, vì về nguyên tắc chúng có thể được sử dụng để đưa các đại phân tử đến CNS hoặc để mở ra các con đường thụ thể mới.Đặc biệt, các thụ thể và chất vận chuyển cụ thể của hệ thống mạch máu não (BBB và BSCFB) có thể đóng vai trò là mục tiêu tiềm năng để vận chuyển các loại thuốc điều trị sinh học tích cực và cụ thể.Dịch não tủy (CSF) là sản phẩm bài tiết của đám rối màng đệm (CS) và tiếp xúc trực tiếp với dịch kẽ của não qua khoang dưới nhện và khoang não thất4.Gần đây người ta đã chứng minh rằng dịch não tủy trong khoang dưới nhện khuếch tán quá mức vào khoảng kẽ của não9.Chúng tôi hy vọng có thể tiếp cận không gian nhu mô bằng cách sử dụng đường vào khoang dưới nhện này hoặc trực tiếp thông qua BBB.Để đạt được điều này, chúng tôi đã triển khai một chiến lược lựa chọn thể thực khuẩn in vivo mạnh mẽ để xác định một cách lý tưởng các peptide được vận chuyển bằng một trong hai con đường riêng biệt này.
Bây giờ chúng tôi mô tả một phương pháp sàng lọc hiển thị thể thực khuẩn in vivo tuần tự với lấy mẫu CSF kết hợp với giải trình tự thông lượng cao (HTS) để theo dõi các vòng lựa chọn ban đầu với độ đa dạng của thư viện cao nhất.Việc sàng lọc được thực hiện trên những con chuột có ý thức bằng ống thông cisterna lớn (CM) được cấy ghép vĩnh viễn để tránh nhiễm bẩn máu.Điều quan trọng là, phương pháp này chọn cả nhắm mục tiêu não và peptide với hoạt động vận chuyển qua hàng rào mạch máu não.Chúng tôi đã sử dụng các phage T7 do kích thước nhỏ của chúng (~60 nm)10 và gợi ý rằng chúng thích hợp cho việc vận chuyển các túi cho phép xuyên qua tế bào qua hàng rào nội mô và/hoặc biểu mô-tủy.Sau bốn vòng quét, các quần thể thể thực khuẩn được phân lập cho thấy sự làm giàu dịch não tủy in vivo mạnh mẽ và sự liên kết vi mạch não.Điều quan trọng là chúng tôi có thể xác nhận những phát hiện của mình bằng cách chứng minh rằng các peptide ứng cử viên tốt nhất được ưa thích và được tổng hợp hóa học có thể vận chuyển hàng hóa protein vào dịch não tủy.Đầu tiên, các tác dụng dược lực học của CNS được thiết lập bằng cách kết hợp một peptide vận chuyển hàng đầu với một chất ức chế peptide BACE1.Ngoài việc chứng minh rằng các chiến lược sàng lọc chức năng in vivo có thể xác định các peptide vận chuyển não mới là chất vận chuyển protein hiệu quả, chúng tôi hy vọng các phương pháp lựa chọn chức năng tương tự cũng trở nên quan trọng trong việc xác định các con đường vận chuyển não mới.
Dựa trên các đơn vị hình thành mảng bám (PFU), sau bước đóng gói phage, một thư viện gồm các peptit phage T7 tuyến tính 12-mer ngẫu nhiên với độ đa dạng khoảng 109 đã được thiết kế và tạo ra (xem Vật liệu và Phương pháp).Điều quan trọng cần lưu ý là chúng tôi đã phân tích cẩn thận thư viện này trước khi quét in vivo.Khuếch đại PCR các mẫu thư viện phage bằng cách sử dụng các đoạn mồi đã sửa đổi đã tạo ra các bộ khuếch đại có thể áp dụng trực tiếp cho HTS (Hình bổ sung. 1a).Do a) Lỗi trình tự HTS11, b) ảnh hưởng đến chất lượng của đoạn mồi (NNK) 1-12 và c) sự hiện diện của phage kiểu hoang dã (wt) (chèn bộ xương) trong thư viện dự phòng, quy trình lọc trình tự đã được thực hiện để chỉ trích xuất thông tin trình tự đã được xác minh (Hình bổ sung. 1b).Các bước lọc này áp dụng cho tất cả các thư viện giải trình tự HTS.Đối với thư viện tiêu chuẩn, đã thu được tổng cộng 233.868 lượt đọc, trong đó 39% vượt qua tiêu chí bộ lọc và được sử dụng để phân tích và lựa chọn thư viện cho các vòng tiếp theo (Hình bổ sung 1c kèm e).Các lần đọc chủ yếu là bội số của 3 cặp cơ sở có độ dài cực đại là 36 nucleotide (Hình bổ sung. 1c), xác nhận thiết kế thư viện (NNK) 1-12.Đáng chú ý, khoảng 11% thành viên thư viện chứa phần chèn PAGISRELVDKL kiểu hoang dã (wt) 12 chiều và gần một nửa số trình tự (49%) chứa phần chèn hoặc xóa.HTS của thư viện thư viện đã xác nhận tính đa dạng cao của các peptide trong thư viện: hơn 81% trình tự peptide chỉ được tìm thấy một lần và chỉ 1, 5% xảy ra trong ≥4 bản sao (Hình bổ sung 2a).Tần số của axit amin (aa) ở tất cả 12 vị trí trong tiết mục tương quan tốt với tần số dự kiến ​​​​cho số lượng codon được tạo bởi tiết mục NKK thoái hóa (Hình bổ sung 2b).Tần suất quan sát được của dư lượng aa được mã hóa bởi các phần chèn này tương quan tốt với tần số tính toán (r = 0,893) (Hình bổ sung. 2c).Việc chuẩn bị các thư viện thể thực khuẩn để tiêm bao gồm các bước khuếch đại và loại bỏ nội độc tố.Điều này trước đây đã được chứng minh là có khả năng làm giảm tính đa dạng của các thư viện thể thực khuẩn12,13.Do đó, chúng tôi đã giải trình tự thư viện thể thực khuẩn được khuếch đại bằng đĩa đã trải qua quá trình loại bỏ nội độc tố và so sánh nó với thư viện ban đầu để ước tính tần suất của AA.Một mối tương quan mạnh mẽ (r = 0,995) đã được quan sát giữa nhóm ban đầu và nhóm được khuếch đại và tinh chế (Hình bổ sung 2d), cho thấy rằng sự cạnh tranh giữa các dòng vô tính được khuếch đại trên các đĩa sử dụng phage T7 không gây ra sai lệch lớn.So sánh này dựa trên tần suất của họa tiết tripeptide trong mỗi thư viện, vì không thể nắm bắt đầy đủ tính đa dạng của thư viện (~109) ngay cả với HTS.Phân tích tần số của aa tại mỗi vị trí cho thấy độ lệch nhỏ phụ thuộc vào vị trí ở ba vị trí cuối cùng của tiết mục đã nhập (Hình bổ sung. 2e).Để kết luận, chúng tôi đã kết luận rằng chất lượng và tính đa dạng của thư viện có thể chấp nhận được và chỉ quan sát thấy những thay đổi nhỏ về tính đa dạng do khuếch đại và chuẩn bị các thư viện thể thực khuẩn giữa một số vòng lựa chọn.
Việc lấy mẫu dịch não tủy nối tiếp có thể được thực hiện bằng cách phẫu thuật cấy ống thông vào CM của chuột còn tỉnh để tạo điều kiện xác định phage T7 được tiêm tĩnh mạch (iv) thông qua BBB và/hoặc BCSFB (Hình 1a-b).Chúng tôi đã sử dụng hai nhánh lựa chọn độc lập (nhánh A và B) trong ba vòng lựa chọn in vivo đầu tiên (Hình 1c).Chúng tôi dần dần tăng mức độ nghiêm ngặt của việc lựa chọn bằng cách giảm tổng số lượng thể thực khuẩn được đưa vào trong ba vòng lựa chọn đầu tiên.Đối với vòng xoay thứ tư, chúng tôi đã kết hợp các mẫu từ nhánh A và B và thực hiện ba lựa chọn độc lập bổ sung.Để nghiên cứu các đặc tính in vivo của các hạt thể thực khuẩn T7 trong mô hình này, thể thực khuẩn dại (phần chèn chính PAGISRELVDKL) đã được tiêm vào chuột qua tĩnh mạch đuôi.Việc phục hồi các phage từ dịch não tủy và máu tại các thời điểm khác nhau cho thấy các phage icosahedral T7 tương đối nhỏ có giai đoạn thanh thải ban đầu nhanh chóng khỏi khoang máu (Hình bổ sung 3).Dựa trên các chuẩn độ được sử dụng và lượng máu của chuột, chúng tôi đã tính toán rằng chỉ có khoảng 1% trọng lượng.thể thực khuẩn từ liều dùng đã được phát hiện trong máu 10 phút sau khi tiêm tĩnh mạch.Sau sự suy giảm nhanh ban đầu này, người ta đo được độ thanh thải ban đầu chậm hơn với thời gian bán hủy là 27,7 phút.Điều quan trọng là, chỉ có rất ít phage được lấy từ ngăn CSF, cho thấy nền tảng thấp để di chuyển phage kiểu hoang dã vào ngăn CSF (Hình bổ sung 3).Trung bình, chỉ có khoảng 1 x 10-3% hiệu giá phage T7 trong máu và 4 x 10-8% phage truyền ban đầu được phát hiện trong dịch não tủy trong toàn bộ thời gian lấy mẫu (0-250 phút).Đáng chú ý là thời gian bán hủy (25,7 phút) của thể thực khuẩn dại trong dịch não tủy tương tự như thời gian quan sát được trong máu.Những dữ liệu này chứng minh rằng hàng rào ngăn cách ngăn CSF với máu còn nguyên vẹn ở những con chuột được đặt trong hộp CM, cho phép lựa chọn in vivo các thư viện thể thực khuẩn để xác định các dòng vô tính dễ dàng được vận chuyển từ máu vào ngăn CSF.
(a) Thiết lập phương pháp lấy mẫu lại dịch não tủy (CSF) từ một bể lớn.(b) Sơ đồ thể hiện vị trí tế bào của hàng rào hệ thần kinh trung ương (CNS) và chiến lược chọn lọc được sử dụng để xác định các peptit vượt qua hàng rào máu não (BBB) ​​và hàng rào máu não.( c ) Sơ đồ sàng lọc hiển thị phage in vivo.Trong mỗi vòng lựa chọn, các thể thực khuẩn (mã định danh động vật bên trong mũi tên) được tiêm vào tĩnh mạch.Hai nhánh phương án độc lập (A, B) được giữ riêng cho đến vòng xét chọn thứ 4.Đối với vòng lựa chọn 3 và 4, mỗi bản sao phage được trích xuất từ ​​​​CSF đã được giải trình tự thủ công.( d ) Động học của thể thực khuẩn được phân lập từ máu (vòng tròn màu đỏ) và dịch não tủy (hình tam giác màu xanh lá cây) trong vòng lựa chọn đầu tiên ở hai con chuột được đặt ống thông sau khi tiêm thư viện peptide T7 vào tĩnh mạch (2 x 1012 thể thực khuẩn/con).Hình vuông màu xanh biểu thị nồng độ ban đầu trung bình của thể thực khuẩn trong máu, được tính từ lượng thể thực khuẩn được tiêm vào, có tính đến tổng thể tích máu.Các ô vuông màu đen biểu thị giao điểm của đường y được ngoại suy từ nồng độ phage trong máu.(e, f) Trình bày tần số tương đối và sự phân bố của tất cả các họa tiết tripeptide chồng chéo có thể có trong peptide.Số lượng họa tiết được tìm thấy trong 1000 bài đọc được hiển thị.Các họa tiết phong phú đáng kể (p <0,001) được đánh dấu bằng các chấm đỏ.(e) Biểu đồ phân tán tương quan so sánh tần số tương đối của mô-đun tripeptide của thư viện được tiêm với thể thực khuẩn có nguồn gốc từ máu từ động vật #1.1 và #1.2.( f ) Biểu đồ phân tán tương quan so sánh tần số tương đối của các họa tiết tripeptide phage động vật # 1.1 và # 1.2 được phân lập trong máu và dịch não tủy.(g, h) Biểu diễn ID trình tự của thể thực khuẩn được làm giàu trong máu (g) ​​so với các thư viện được tiêm và thể thực khuẩn được làm giàu trong CSF (h) so với máu sau một vòng chọn lọc in vivo ở cả hai loài động vật.Kích thước của mã một chữ cái cho biết tần suất axit amin đó xuất hiện ở vị trí đó.Màu lục = phân cực, màu tím = trung tính, màu lam = bazơ, màu đỏ = axit và màu đen = axit amin kỵ nước.Hình 1a, b do Eduard Urich thiết kế và sản xuất.
Chúng tôi đã tiêm một thư viện phage peptide vào hai con chuột dụng cụ CM (nhánh A và B) và phân lập phage từ dịch não tủy và máu (Hình 1d).Sự giải phóng nhanh chóng ban đầu của thư viện ít rõ rệt hơn so với phage kiểu hoang dã.Thời gian bán hủy trung bình của thư viện được tiêm ở cả hai động vật là 24,8 phút trong máu, tương tự như thể thực khuẩn dại và 38,5 phút trong CSF.Các mẫu thể thực khuẩn trong máu và dịch não tủy từ mỗi động vật đã được xử lý HTS và tất cả các peptit đã xác định được phân tích để tìm sự hiện diện của mô típ tripeptide ngắn.Các họa tiết tripeptide được chọn vì chúng cung cấp cơ sở tối thiểu cho sự hình thành cấu trúc và tương tác peptide-protein14,15.Chúng tôi đã tìm thấy mối tương quan tốt trong việc phân phối các họa tiết giữa thư viện phage được tiêm và các dòng vô tính được chiết xuất từ ​​​​máu của cả hai loài động vật (Hình 1e).Dữ liệu chỉ ra rằng thành phần của thư viện chỉ được làm giàu một chút trong ngăn chứa máu.Tần số axit amin và trình tự đồng thuận đã được phân tích sâu hơn ở từng vị trí bằng cách sử dụng bản điều chỉnh của phần mềm Weblogo16.Thật thú vị, chúng tôi đã tìm thấy sự phong phú mạnh mẽ trong dư lượng glycine trong máu (Hình 1g).Khi máu được so sánh với các dòng vô tính được chọn từ CSF, sự lựa chọn mạnh mẽ và một số họa tiết được loại bỏ đã được quan sát (Hình 1f) và một số axit amin nhất định được ưu tiên có mặt ở các vị trí được xác định trước trong 12 thành viên (Hình 1h).Đáng chú ý, các động vật riêng lẻ khác nhau đáng kể về dịch não tủy, trong khi sự làm giàu glycine trong máu được quan sát thấy ở cả hai loài động vật (Hình bổ sung. 4a cách j).Sau khi lọc nghiêm ngặt dữ liệu trình tự trong dịch não tủy của động vật # 1.1 và # 1.2, đã thu được tổng cộng 964 và 420 peptide 12-mer duy nhất (Hình bổ sung. 1d, e).Các dòng thể thực khuẩn đã phân lập được khuếch đại và trải qua vòng chọn lọc in vivo thứ hai.Thể thực khuẩn được chiết xuất từ ​​vòng lựa chọn thứ hai đã bị HTS ở mỗi động vật và tất cả các peptide được xác định đã được sử dụng làm đầu vào cho chương trình nhận dạng mô-đun để phân tích sự xuất hiện của các mô-đun tripeptide (Hình 2a, b, ef).So với chu kỳ đầu tiên của thể thực khuẩn được phục hồi từ CSF, chúng tôi đã quan sát thấy sự lựa chọn thêm và bỏ chọn nhiều họa tiết trong CSF ở các nhánh A và B (Hình 2).Một thuật toán nhận dạng mạng đã được áp dụng để xác định xem chúng có đại diện cho các mẫu khác nhau của chuỗi nhất quán hay không.Một sự tương đồng rõ ràng đã được quan sát giữa các chuỗi 12 chiều được phục hồi bởi CSF trong nhánh thay thế A (Hình 2c, d) và nhánh B (Hình 2g, h).Phân tích tổng hợp trong mỗi nhánh cho thấy các cấu hình lựa chọn khác nhau đối với các peptide 12 mer (Hình bổ sung 5c, d) và sự gia tăng tỷ lệ chuẩn độ CSF / máu theo thời gian đối với các dòng vô tính gộp sau vòng lựa chọn thứ hai so với vòng đầu tiên lựa chọn (Hình bổ sung 5e).).
Làm phong phú các họa tiết và peptide trong dịch não tủy bằng hai vòng lựa chọn hiển thị phage chức năng in vivo liên tiếp.
Tất cả các thể thực khuẩn dịch não tủy được phục hồi từ vòng đầu tiên của mỗi con vật (động vật #1.1 và #1.2) được gộp lại, khuếch đại, giải trình tự HT và tiêm lại cùng nhau (2 x 1010 thể thực khuẩn/con vật) 2 con chuột được đặt ống thông SM (#1.1 → #).2.1 và 2.2, 1.2 → 2.3 và 2.4).(a, b, e, f) Biểu đồ phân tán tương quan so sánh tần số tương đối của họa tiết tripeptide của tất cả các phage có nguồn gốc CSF trong vòng lựa chọn thứ nhất và thứ hai.Tần số tương đối và sự phân bố của các họa tiết đại diện cho tất cả các tripeptide chồng chéo có thể được tìm thấy trong các peptide theo cả hai hướng.Số lượng họa tiết được tìm thấy trong 1000 bài đọc được hiển thị.Các họa tiết được chọn hoặc loại trừ đáng kể (p < 0,001) trong một trong các thư viện so sánh được đánh dấu bằng các chấm đỏ.(c, d, g, h) Biểu trưng trình tự đại diện cho tất cả các trình tự dài 12 axit amin giàu CSF dựa trên vòng 2 và 1 của quá trình chọn lọc in vivo.Kích thước của mã một chữ cái cho biết tần suất axit amin đó xuất hiện ở vị trí đó.Để thể hiện biểu tượng, tần suất của các trình tự CSF được chiết xuất từ ​​các động vật riêng lẻ giữa hai vòng lựa chọn được so sánh và các trình tự được làm giàu trong vòng thứ hai được hiển thị: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 và (h) #1.2–#2.4.Các axit amin được làm giàu nhất ở một vị trí nhất định trong (c, d) động vật không.2.1 và không.2.2 hoặc (g, h) ở động vật không.2.3 và không.2.4 được hiển thị bằng màu sắc.Màu lục = phân cực, màu tím = trung tính, màu lam = bazơ, màu đỏ = axit và màu đen = axit amin kỵ nước.
Sau vòng lựa chọn thứ ba, chúng tôi đã xác định được 124 trình tự peptide duy nhất (#3.1 và #3.2) từ 332 dòng vô tính phage được tái tạo CSF ​​được phân lập từ hai loài động vật (Hình bổ sung 6a).Trình tự LGSVS (18,7%) có tỷ lệ tương đối cao nhất, tiếp theo là các đoạn chèn kiểu hoang dã PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) và SARGSWREIVSLS ( 2,2%).Trong vòng thứ tư cuối cùng, chúng tôi gộp hai nhánh được chọn độc lập từ ba loài động vật riêng biệt (Hình 1c).Trong số 925 dòng vô tính của phage được giải trình tự được phục hồi từ CSF, trong vòng thứ tư, chúng tôi đã tìm thấy 64 chuỗi peptide duy nhất (Hình bổ sung 6b), trong đó tỷ lệ tương đối của phage loại hoang dã giảm xuống 0,8%.Các bản sao CSF ​​phổ biến nhất trong vòng thứ tư là LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) và RLSSVDSDLSGC (3, 2%).%)).Phạm vi độ dài của các peptit đã chọn là do chèn/xóa nucleotide hoặc codon dừng sớm trong đoạn mồi thư viện khi sử dụng codon suy biến cho thiết kế thư viện NNK.Các codon kết thúc sớm tạo ra các peptit ngắn hơn và được chọn vì chúng chứa mô típ aa thuận lợi.Các peptide dài hơn có thể là kết quả của việc chèn/xóa trong đoạn mồi của thư viện tổng hợp.Điều này định vị codon dừng được thiết kế bên ngoài khung và đọc nó cho đến khi một codon dừng mới xuất hiện ở phía dưới.Nói chung, chúng tôi đã tính toán các hệ số làm giàu cho cả bốn vòng lựa chọn bằng cách so sánh dữ liệu đầu vào với dữ liệu đầu ra của mẫu.Đối với vòng sàng lọc đầu tiên, chúng tôi đã sử dụng các chuẩn độ phage kiểu hoang dã làm tài liệu tham khảo cơ bản không cụ thể.Thật thú vị, sự lựa chọn phage âm tính rất mạnh trong chu kỳ CSF đầu tiên, nhưng không phải trong máu (Hình 3a), điều này có thể là do xác suất khuếch tán thụ động của hầu hết các thành viên của thư viện peptide vào khoang CSF hoặc các phage tương đối thấp có xu hướng được giữ lại hoặc loại bỏ khỏi dòng máu hiệu quả hơn so với thể thực khuẩn.Tuy nhiên, trong vòng quét thứ hai, sự lựa chọn mạnh mẽ của các phage trong CSF đã được quan sát thấy ở cả hai nhánh, cho thấy rằng vòng trước đó đã được làm giàu trong các phage hiển thị các peptide thúc đẩy sự hấp thu của CSF (Hình 3a).Một lần nữa, không làm giàu máu đáng kể.Cũng trong vòng thứ ba và thứ tư, các dòng vô tính của phage đã được làm giàu đáng kể trong CSF.So sánh tần số tương đối của từng chuỗi peptide duy nhất giữa hai vòng lựa chọn cuối cùng, chúng tôi thấy rằng các chuỗi thậm chí còn phong phú hơn trong vòng lựa chọn thứ tư (Hình 3b).Tổng cộng có 931 họa tiết tripeptide được chiết xuất từ ​​tất cả 64 trình tự peptit duy nhất sử dụng cả hai hướng peptit.Các họa tiết được làm giàu nhất trong vòng thứ tư đã được kiểm tra kỹ hơn về cấu hình làm giàu của chúng trên tất cả các vòng so với thư viện được tiêm (giới hạn: làm giàu 10%) (Hình bổ sung 6c).Các mô hình lựa chọn chung cho thấy hầu hết các động cơ được nghiên cứu đều được làm phong phú trong tất cả các vòng trước đó của cả hai nhánh lựa chọn.Tuy nhiên, một số họa tiết (ví dụ: SGL, VSG, LGS GSV) chủ yếu là từ nhánh thay thế A, trong khi các họa tiết khác (ví dụ: FGW, RTN, WGF, NTR) được làm giàu trong nhánh thay thế B.
Xác thực quá trình vận chuyển CSF của các peptit thể thực khuẩn được làm giàu trong CSF và các peptit dẫn đầu được đánh dấu biotin kết hợp với tải trọng streptavidin.
( a ) Tỷ lệ làm giàu được tính toán trong cả bốn vòng (R1-R4) dựa trên các chuẩn độ phage (PFU) được tiêm (đầu vào = I) và các chuẩn độ phage CSF được xác định (đầu ra = O).Các hệ số làm giàu cho ba vòng cuối cùng (R2-R4) được tính toán bằng cách so sánh với vòng trước và vòng đầu tiên (R1) với dữ liệu trọng lượng.Thanh mở là dịch não tủy, thanh bóng mờ là huyết tương.(*** p <0,001, dựa trên bài kiểm tra t của Sinh viên).( b ) Danh sách các peptit phage phong phú nhất, được xếp hạng theo tỷ lệ tương đối của chúng với tất cả các phage được thu thập trong CSF sau vòng 4 lựa chọn.Sáu dòng vô tính phage phổ biến nhất được đánh dấu bằng màu sắc, được đánh số và các hệ số làm giàu của chúng giữa vòng 3 và 4 của quá trình lựa chọn (phần trong).( c, d ) Sáu thư viện phage phage được làm giàu nhất, phage trống và phage peptide của thư viện từ vòng 4 được phân tích riêng lẻ trong mô hình lấy mẫu CSF.CSF và các mẫu máu được thu thập tại các thời điểm được chỉ định.(c) Số lượng bằng nhau của 6 thể thực khuẩn vô tính ứng cử viên (2 x 1010 thể thực khuẩn/động vật), thể thực khuẩn trống (#1779) (2 x 1010 thể thực khuẩn/động vật) và thư viện peptide của thể thực khuẩn dự trữ (2 x 1012 thể thực khuẩn/động vật) Tiêm ít nhất 3 CM được tiêm riêng cho động vật được đặt ống thông qua tĩnh mạch đuôi.Dược động học CSF của từng thư viện phage nhân bản và phage peptide được tiêm theo thời gian được hiển thị.(d) hiển thị tỷ lệ CSF/máu trung bình cho tất cả các phage/mL được phục hồi trong thời gian lấy mẫu.(e) Bốn peptide dẫn đầu tổng hợp và một đối chứng xáo trộn được liên kết với biotin với streptavidin thông qua đầu N của chúng (hiển thị tetramer) sau đó được tiêm (iv tĩnh mạch đuôi, 10 mg streptavidin/kg).Ít nhất ba con chuột được đặt nội khí quản (N = 3).).Các mẫu CSF được thu thập tại các thời điểm được chỉ định và nồng độ streptavidin được đo bằng ELISA chống streptavidin CSF (nd = không phát hiện).(*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, dựa trên kiểm định ANOVA).(f) So sánh trình tự axit amin của dòng vô tính phage peptide được làm giàu nhất #2002 (màu tím) với các dòng vô tính phage peptide được chọn khác từ vòng chọn lọc thứ 4.Các đoạn axit amin giống hệt nhau và tương tự nhau được mã hóa màu.
Trong số tất cả các phage được làm giàu ở vòng thứ tư (Hình 3b), sáu dòng vô tính ứng cử viên đã được chọn để phân tích riêng lẻ hơn nữa trong mô hình lấy mẫu CSF.Một lượng bằng nhau của sáu thư viện phage ứng cử viên, phage trống (không chèn) và peptit tiên tri đã được tiêm vào ba động vật CM được đóng hộp và dược động học được xác định trong xét nghiệm CSF (Hình 3c) và máu (Hình bổ sung 7).Tất cả các dòng vô tính của thể thực khuẩn được thử nghiệm đều nhắm vào ngăn CSF ở mức cao hơn 10-1000 lần so với mức của thể thực khuẩn đối chứng trống (#1779).Ví dụ: dòng vô tính #2020 và #2077 có hiệu giá CSF cao hơn khoảng 1000 lần so với phage đối chứng.Hồ sơ dược động học của mỗi peptide được chọn là khác nhau, nhưng tất cả chúng đều có khả năng dẫn đường CSF cao.Chúng tôi đã quan sát thấy mức giảm liên tục theo thời gian đối với các bản sao #1903 và #2011, trong khi đối với các bản sao #2077, #2002 và #2009, mức tăng trong 10 phút đầu tiên có thể cho thấy quá trình vận chuyển đang hoạt động nhưng cần được xác minh.Các bản sao #2020, #2002 và #2077 ổn định ở mức cao, trong khi nồng độ Dịch não tủy của bản sao #2009 giảm dần sau lần tăng ban đầu.Sau đó, chúng tôi so sánh tần suất tương đối của từng ứng cử viên CSF với nồng độ trong máu của nó (Hình 3d).Mối tương quan giữa hiệu giá trung bình của từng ứng cử viên CSF với hiệu giá máu của nó tại mọi thời điểm lấy mẫu cho thấy ba trong số sáu ứng cử viên được làm giàu đáng kể trong CSF máu.Thật thú vị, bản sao #2077 cho thấy độ ổn định trong máu cao hơn (Bổ sung Hình 7).Để xác nhận rằng bản thân các peptide có khả năng vận chuyển tích cực hàng hóa không phải là các hạt phage vào ngăn CSF, chúng tôi đã tổng hợp bốn peptide dẫn đầu được tạo dẫn xuất bằng biotin tại đầu N nơi các peptide gắn vào hạt phage.Các peptit đánh dấu biotin (số 2002, 2009, 2020 và 2077) được kết hợp với streptavidin (SA) để thu được các dạng đa phân tử phần nào bắt chước hình dạng của thể thực khuẩn.Định dạng này cũng cho phép chúng tôi đo mức độ phơi nhiễm SA trong máu và dịch não tủy dưới dạng peptide protein vận chuyển hàng hóa.Điều quan trọng là, dữ liệu phage thường có thể được sao chép khi các peptide tổng hợp được quản lý ở định dạng liên hợp SA này (Hình 3e).Các peptide được xáo trộn ít tiếp xúc ban đầu hơn và thanh thải CSF nhanh hơn với mức không thể phát hiện trong vòng 48 giờ.Để hiểu rõ hơn về con đường phân phối của các dòng phage peptide này vào không gian CSF, chúng tôi đã phân tích quá trình nội địa hóa các lần truy cập peptide của phage riêng lẻ bằng cách sử dụng hóa mô miễn dịch (IHC) để phát hiện trực tiếp các hạt phage 1 giờ sau khi tiêm tĩnh mạch in vivo.Đáng chú ý, các dòng vô tính #2002, #2077 và #2009 có thể được phát hiện bằng cách nhuộm màu mạnh trong mao mạch não, trong khi phage kiểm soát (#1779) và bản sao #2020 không được phát hiện (Hình bổ sung 8).Điều này cho thấy rằng các peptide này góp phần tạo ra hiệu ứng lên não một cách chính xác bằng cách vượt qua BBB.Cần phân tích chi tiết hơn để kiểm tra giả thuyết này, vì tuyến đường BSCFB cũng có thể liên quan.Khi so sánh trình tự axit amin của dòng vô tính được làm giàu nhất (#2002) với các peptide được chọn khác, người ta lưu ý rằng một số trong số chúng có phần mở rộng axit amin tương tự, có thể chỉ ra cơ chế vận chuyển tương tự (Hình 3f).
Do cấu hình plasma độc đáo của nó và sự gia tăng đáng kể trong CSF theo thời gian, bản sao hiển thị thể thực khuẩn #2077 đã được khám phá thêm trong khoảng thời gian 48 giờ dài hơn và có thể tái tạo sự gia tăng nhanh chóng của CSF được quan sát thấy cùng với mức SA duy trì (Hình 4a).Đối với các dòng vô tính phage đã được xác định khác, #2077 nhuộm màu mạnh mẽ cho các mao mạch não và cho thấy sự tập trung đáng kể với chất đánh dấu mao mạch khi được xem ở độ phân giải cao hơn và có thể nhuộm một số trong không gian nhu mô (Hình 4b).Để tìm hiểu xem có thể thu được tác dụng dược lý qua trung gian peptit trong CNS hay không, chúng tôi đã thực hiện một thử nghiệm trong đó các phiên bản đánh dấu biotin của i) peptit vận chuyển #2077 và ii) peptit ức chế BACE1 được trộn với SA ở hai tỷ lệ khác nhau.Đối với một sự kết hợp, chúng tôi chỉ sử dụng chất ức chế peptit BACE1 và đối với sự kết hợp khác, chúng tôi sử dụng chất ức chế peptit BACE1 theo tỷ lệ 1:3 so với peptit #2077.Cả hai mẫu đều được tiêm vào tĩnh mạch và nồng độ beta-amyloid peptide 40 (Abeta40) trong máu và dịch não tủy được đo theo thời gian.Abeta40 được đo bằng CSF vì nó phản ánh sự ức chế BACE1 trong nhu mô não.Đúng như dự đoán, cả hai phức hợp đều làm giảm đáng kể nồng độ Abeta40 trong máu (Hình 4c, d).Tuy nhiên, chỉ những mẫu chứa hỗn hợp peptit no.2077 và chất ức chế peptide BACE1 kết hợp với SA đã gây ra sự sụt giảm đáng kể Abeta40 trong dịch não tủy (Hình 4c).Dữ liệu cho thấy peptide không.2077 có thể vận chuyển protein SA 60 kDa vào CNS và cũng gây ra tác dụng dược lý với các chất ức chế liên hợp SA của peptit BACE1.
(a) Tiêm vô tính (2 × 10 phage/động vật) của phage T7 cho thấy hồ sơ dược động học dài hạn của peptit CSF #2077 (RLSSVDSDLSGC) và phage đối chứng không được tiêm (#1779) ở ít nhất ba con chuột được đặt nội khí quản CM.( b ) Hình ảnh hiển vi đồng tiêu của các vi mạch vỏ não đại diện ở chuột được tiêm phage (2 × 10 10 phage / động vật) cho thấy sự chống lại peptide # 2077 và các mạch (lectin).Các dòng thể thực khuẩn này được tiêm cho 3 con chuột và được phép lưu thông trong 1 giờ trước khi truyền dịch.Não được cắt và nhuộm bằng kháng thể đa dòng được đánh dấu FITC chống lại capsid của phage T7.Mười phút trước khi truyền dịch và cố định sau đó, lectin có nhãn DyLight594 được tiêm tĩnh mạch.Hình ảnh huỳnh quang cho thấy nhuộm lectin (màu đỏ) ở phía bên trong của vi mạch và thể thực khuẩn (màu xanh lá cây) trong lòng của mao mạch và mô não quanh mạch máu.Thanh tỷ lệ tương ứng với 10 Pha.(c, d) Peptide ức chế BACE1 đánh dấu biotin đơn thuần hoặc kết hợp với peptit vận chuyển #2077 được đánh dấu biotin được kết hợp với streptavidin sau đó tiêm tĩnh mạch ít nhất ba con chuột CM đã được đặt ống thông (10 mg streptavidin/kg).Mức giảm qua trung gian chất ức chế peptide BACE1 trong Aβ40 được đo bằng ELISA Aβ1-40 trong máu (màu đỏ) và dịch não tủy (màu cam) tại các thời điểm được chỉ định.Để rõ ràng hơn, một đường chấm chấm được vẽ trên biểu đồ ở tỷ lệ 100%.( c ) Giảm phần trăm Aβ40 trong máu (hình tam giác màu đỏ) và dịch não tủy (hình tam giác màu cam) ở chuột được điều trị bằng streptavidin kết hợp với peptit vận chuyển #2077 và peptit ức chế BACE1 theo tỷ lệ 3:1.( d ) Giảm phần trăm Aβ40 trong máu (vòng tròn màu đỏ) và dịch não tủy (vòng tròn màu cam) của chuột được điều trị bằng streptavidin chỉ kết hợp với peptide ức chế BACE1.Nồng độ Aβ trong đối chứng là 420 pg/ml (độ lệch chuẩn = 101 pg/ml).
Hiển thị thể thực khuẩn đã được áp dụng thành công trong một số lĩnh vực nghiên cứu y sinh17.Phương pháp này đã được sử dụng cho các nghiên cứu đa dạng mạch in vivo18,19 cũng như các nghiên cứu nhắm mục tiêu vào mạch não20,21,22,23,24,25,26.Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã mở rộng ứng dụng của phương pháp lựa chọn này không chỉ để xác định trực tiếp các peptide nhắm vào mạch máu não mà còn phát hiện ra các ứng cử viên có đặc tính vận chuyển tích cực để vượt qua hàng rào máu não.Bây giờ chúng tôi mô tả sự phát triển của quy trình lựa chọn in vivo ở chuột được đặt nội khí quản CM và chứng minh tiềm năng của nó để xác định các peptide có đặc tính di chuyển CSF.Bằng cách sử dụng thể thực khuẩn T7 hiển thị một thư viện gồm 12 peptit ngẫu nhiên, chúng tôi có thể chứng minh rằng thể thực khuẩn T7 đủ nhỏ (đường kính khoảng 60 nm)10 để thích nghi với hàng rào máu não, do đó trực tiếp vượt qua hàng rào máu não hoặc đám rối màng đệm.Chúng tôi đã quan sát thấy rằng việc thu hoạch CSF từ chuột CM được đặt ống là một phương pháp sàng lọc chức năng in vivo được kiểm soát tốt và phage được chiết xuất không chỉ liên kết với mạch máu mà còn hoạt động như một chất vận chuyển qua hàng rào máu não.Hơn nữa, bằng cách đồng thời thu thập máu và áp dụng HTS cho CSF ​​và các phage có nguồn gốc từ máu, chúng tôi đã xác nhận rằng lựa chọn CSF của chúng tôi không bị ảnh hưởng bởi việc làm giàu máu hoặc khả năng mở rộng giữa các vòng lựa chọn.Tuy nhiên, ngăn máu là một phần của quy trình chọn lọc, vì các thể thực khuẩn có khả năng đến được ngăn CSF phải tồn tại và lưu thông trong dòng máu đủ lâu để tự làm giàu trong não.Để trích xuất thông tin trình tự đáng tin cậy từ dữ liệu HTS thô, chúng tôi đã triển khai các bộ lọc phù hợp với các lỗi trình tự dành riêng cho nền tảng trong quy trình phân tích.Bằng cách kết hợp các thông số động học vào phương pháp sàng lọc, chúng tôi đã xác nhận dược động học nhanh chóng của các thể thực khuẩn T7 hoang dã (t½ ~ 28 phút) trong máu24, 27, 28 và cũng xác định thời gian bán hủy của chúng trong dịch não tủy (t½ ~ 26 phút) mỗi phút).Mặc dù các cấu hình dược động học trong máu và CSF tương tự nhau, nhưng chỉ có 0,001% nồng độ của thể thực khuẩn trong máu có thể được phát hiện trong CSF, cho thấy khả năng di động cơ bản của thể thực khuẩn T7 hoang dại qua hàng rào máu não thấp.Công việc này nhấn mạnh tầm quan trọng của vòng lựa chọn đầu tiên khi sử dụng các chiến lược quét in vivo, đặc biệt là đối với các hệ thống thể thực khuẩn nhanh chóng bị xóa khỏi lưu thông, vì một số dòng vô tính có thể đến được ngăn CNS.Do đó, trong vòng đầu tiên, sự suy giảm tính đa dạng của thư viện là rất lớn, vì cuối cùng chỉ có một số bản sao hạn chế được thu thập trong mô hình CSF rất nghiêm ngặt này.Chiến lược quét in vivo này bao gồm một số bước lựa chọn như tích lũy tích cực trong ngăn CSF, sự sống sót của bản sao trong ngăn chứa máu và loại bỏ nhanh chóng các dòng vô tính của phage T7 khỏi máu trong vòng 10 phút đầu tiên (Hình 1d và Hình bổ sung 4M).).Do đó, sau vòng đầu tiên, các dòng vô tính của thể thực khuẩn khác nhau đã được xác định trong CSF, mặc dù cùng một nhóm ban đầu được sử dụng cho từng động vật.Điều này cho thấy rằng nhiều bước lựa chọn nghiêm ngặt đối với các thư viện nguồn có số lượng thành viên thư viện lớn dẫn đến giảm đáng kể tính đa dạng.Do đó, các sự kiện ngẫu nhiên sẽ trở thành một phần không thể thiếu trong quá trình lựa chọn ban đầu, ảnh hưởng lớn đến kết quả.Có khả năng nhiều bản sao trong thư viện ban đầu có xu hướng làm giàu CSF rất giống nhau.Tuy nhiên, ngay cả trong cùng điều kiện thử nghiệm, kết quả lựa chọn có thể khác nhau do số lượng nhỏ của mỗi bản sao cụ thể trong nhóm ban đầu.
Các họa tiết được làm giàu trong CSF khác với các họa tiết trong máu.Thật thú vị, chúng tôi đã ghi nhận sự thay đổi đầu tiên đối với các peptide giàu glycine trong máu của từng động vật.(Hình 1g, Hình bổ sung 4e, 4f).Thể thực khuẩn chứa peptit glycine có thể ổn định hơn và ít có khả năng bị đưa ra khỏi lưu thông.Tuy nhiên, các peptide giàu glycine này không được phát hiện trong các mẫu dịch não tủy, cho thấy rằng các thư viện được tuyển chọn đã trải qua hai bước lựa chọn khác nhau: một bước trong máu và một bước khác được phép tích tụ trong dịch não tủy.Các dòng vô tính được làm giàu CSF từ vòng lựa chọn thứ tư đã được thử nghiệm rộng rãi.Gần như tất cả các dòng vô tính được thử nghiệm riêng lẻ đã được xác nhận là được làm giàu trong CSF so với phage kiểm soát trống.Một lần truy cập peptide (#2077) đã được kiểm tra chi tiết hơn.Nó cho thấy thời gian bán hủy trong huyết tương dài hơn so với các lần truy cập khác (Hình 3d và Hình bổ sung 7), và thật thú vị, peptide này chứa dư lượng cysteine ​​​​ở đầu C.Gần đây, người ta đã chứng minh rằng việc bổ sung cysteine ​​vào peptide có thể cải thiện các đặc tính dược động học của chúng bằng cách liên kết với albumin 29 .Điều này hiện chưa được biết đối với peptide #2077 và cần nghiên cứu thêm.Một số peptide cho thấy sự phụ thuộc vào hóa trị trong quá trình làm giàu CSF (dữ liệu không được hiển thị), điều này có thể liên quan đến hình dạng bề mặt được hiển thị của capsid T7.Hệ thống T7 mà chúng tôi sử dụng cho thấy 5-15 bản sao của mỗi peptide trên mỗi hạt thể thực khuẩn.IHC đã được thực hiện trên các dòng vô tính của phage chì được tiêm tĩnh mạch vào vỏ não của chuột (Hình bổ sung 8).Dữ liệu cho thấy ít nhất ba bản sao (số 2002, số 2009 và số 2077) đã tương tác với BBB.Vẫn còn phải xác định liệu tương tác BBB này dẫn đến sự tích tụ CSF hay sự di chuyển của các bản sao này trực tiếp đến BCSFB.Điều quan trọng, chúng tôi cho thấy rằng các peptide được chọn vẫn giữ được khả năng vận chuyển CSF của chúng khi được tổng hợp và liên kết với hàng hóa protein.Liên kết của các peptide N-terminal biotatin hóa với SA về cơ bản lặp lại các kết quả thu được với các dòng vô tính phage tương ứng của chúng trong máu và dịch não tủy (Hình 3e).Cuối cùng, chúng tôi chỉ ra rằng peptit chì #2077 có thể thúc đẩy hoạt động não bộ của chất ức chế peptit đánh dấu biotin của BACE1 kết hợp với SA, gây ra tác dụng dược lực học rõ rệt trong CNS bằng cách giảm đáng kể nồng độ Abeta40 trong CSF (Hình 4).Chúng tôi không thể xác định bất kỳ tương đồng nào trong cơ sở dữ liệu bằng cách thực hiện tìm kiếm tương đồng trình tự peptide của tất cả các lần truy cập.Điều quan trọng cần lưu ý là kích thước của thư viện T7 xấp xỉ 109, trong khi kích thước thư viện lý thuyết cho 12-mer là 4 x 1015. Do đó, chúng tôi chỉ chọn một phần nhỏ không gian đa dạng của thư viện peptide 12-mer, điều này có thể có nghĩa là có thể xác định các peptide được tối ưu hóa hơn bằng cách đánh giá không gian trình tự liền kề của các lần truy cập được xác định này.Theo giả thuyết, một trong những lý do tại sao chúng tôi không tìm thấy bất kỳ chất tương đồng tự nhiên nào của các peptide này có thể là do quá trình tiến hóa bị loại bỏ để ngăn chặn sự xâm nhập không kiểm soát của một số mô típ peptide vào não.
Kết hợp lại với nhau, kết quả của chúng tôi cung cấp cơ sở cho công việc trong tương lai để xác định và mô tả chi tiết hơn các hệ thống vận chuyển của hàng rào mạch máu não in vivo.Thiết lập cơ bản của phương pháp này dựa trên chiến lược lựa chọn chức năng không chỉ xác định các dòng vô tính có đặc tính liên kết mạch máu não mà còn bao gồm một bước quan trọng trong đó các dòng vô tính thành công có hoạt động nội tại để vượt qua các rào cản sinh học in vivo vào ngăn CNS.là làm sáng tỏ cơ chế vận chuyển của các peptide này và sở thích của chúng để liên kết với vi mạch đặc hiệu cho vùng não.Điều này có thể dẫn đến việc phát hiện ra các con đường mới để vận chuyển BBB và các thụ thể.Chúng tôi hy vọng rằng các peptide được xác định có thể liên kết trực tiếp với các thụ thể mạch máu não hoặc với các phối tử tuần hoàn được vận chuyển qua BBB hoặc BCSFB.Các vectơ peptide có hoạt động vận chuyển CSF được phát hiện trong công việc này sẽ được nghiên cứu thêm.Chúng tôi hiện đang nghiên cứu tính đặc hiệu trong não của các peptide này để biết khả năng vượt qua BBB và/hoặc BCSFB của chúng.Những peptide mới này sẽ là những công cụ cực kỳ có giá trị để khám phá tiềm năng của các thụ thể hoặc con đường mới và để phát triển các nền tảng mới hiệu quả cao để cung cấp các đại phân tử, chẳng hạn như sinh học, cho não.
Tạo lỗ cho bể chứa nước lớn (CM) bằng cách sử dụng sửa đổi phương pháp đã mô tả trước đó.Những con chuột Wistar (200-350 g) đã gây mê được đặt trên một thiết bị định vị lập thể và một đường rạch ở giữa được thực hiện trên phần da đầu đã được cạo và chuẩn bị vô trùng để lộ hộp sọ.Khoan hai lỗ ở khu vực của khung trên và vặn chặt các vít cố định vào các lỗ.Một lỗ bổ sung đã được khoan ở đỉnh chẩm bên để dẫn hướng lập thể của ống thông thép không gỉ vào CM.Bôi xi măng nha khoa xung quanh ống thông và cố định bằng vít.Sau khi quang hóa và đông cứng xi măng, vết thương ngoài da được đóng lại bằng chỉ khâu siêu cứng 4/0.Việc đặt ống thông đúng cách được xác nhận bằng sự rò rỉ dịch não tủy (CSF) tự phát.Đưa chuột ra khỏi thiết bị định vị lập thể, được chăm sóc hậu phẫu và kiểm soát cơn đau thích hợp, đồng thời để chuột hồi phục trong ít nhất một tuần cho đến khi quan sát thấy dấu hiệu của máu trong dịch não tủy.Chuột Wistar (Crl:WI/Han) được lấy từ sông Charles (Pháp).Tất cả chuột được giữ trong điều kiện không có mầm bệnh cụ thể.Tất cả các thí nghiệm trên động vật đã được Văn phòng Thú y của Thành phố Basel, Thụy Sĩ phê duyệt và được thực hiện theo Giấy phép Động vật số 2474 (Đánh giá Vận chuyển Não Chủ động bằng cách Đo lường Mức độ của các Ứng viên Trị liệu trong Dịch não tủy và Não của Chuột).
Nhẹ nhàng giữ cho chuột tỉnh táo với ống thông CM trong tay.Loại bỏ Datura khỏi ống thông và thu thập 10 µl dịch não tủy chảy tự nhiên.Vì độ bền của ống thông cuối cùng đã bị tổn hại nên chỉ những mẫu dịch não tủy trong suốt không có bằng chứng về sự nhiễm bẩn hoặc đổi màu của máu mới được đưa vào nghiên cứu này.Song song, khoảng 10–20 μl máu được lấy từ một vết rạch nhỏ ở đầu đuôi vào các ống chứa heparin (Sigma-Aldrich).CSF và máu được thu thập tại các thời điểm khác nhau sau khi tiêm phage T7 vào tĩnh mạch.Khoảng 5–10 μl chất lỏng đã bị loại bỏ trước khi mỗi mẫu CSF được thu thập, tương ứng với thể tích chết của ống thông.
Các thư viện được tạo bằng cách sử dụng vectơ T7Select 10-3b như được mô tả trong hướng dẫn sử dụng hệ thống T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996).Tóm lại, một đoạn chèn DNA 12-mer ngẫu nhiên được tổng hợp theo định dạng sau:
Codon NNK được sử dụng để tránh codon dừng kép và biểu hiện quá mức axit amin trong phần chèn.N là tỷ lệ cân bằng được trộn thủ công của từng nucleotide và K là tỷ lệ cân bằng được trộn thủ công của các nucleotide adenine và cytosine.Các vùng sợi đơn được chuyển thành DNA sợi kép bằng cách ủ tiếp với dNTP (Novagen) và enzyme Klenow (New England Biolabs) trong dung dịch đệm Klenow (New England Biolabs) trong 3 giờ ở 37°C.Sau phản ứng, DNA sợi kép được thu hồi bằng kết tủa EtOH.DNA thu được được tiêu hóa bằng các enzyme cắt giới hạn EcoRI và HindIII (cả hai đều từ Roche).Đoạn chèn (QIAquick, Qiagen) đã được phân tách và tinh chế (T4 ligase, New England Biolabs) sau đó được nối trong khung vào một vec tơ T7 đã phân cắt trước sau axit amin 348 của gen capsid 10B.Phản ứng thắt được ủ ở 16° C. trong 18 giờ trước khi đóng gói trong ống nghiệm.Quá trình đóng gói thể thực khuẩn trong ống nghiệm được thực hiện theo hướng dẫn đi kèm với bộ nhân bản T7Select 10-3b (Novagen) và dung dịch đóng gói được khuếch đại một lần để ly giải bằng cách sử dụng Escherichia coli (BLT5615, Novagen).Lysate được ly tâm, chuẩn độ và đông lạnh ở -80° C. dưới dạng dung dịch gốc glycerol.
Khuếch đại PCR trực tiếp các vùng biến đổi của thể thực khuẩn được khuếch đại trong canh thang hoặc đĩa bằng cách sử dụng mồi hợp nhất 454/Roche-amplicon độc quyền.Đoạn mồi hợp nhất phía trước chứa các trình tự nằm bên cạnh vùng biến đổi (NNK) 12 (dành riêng cho mẫu), Bộ điều hợp GS FLX Titanium A và chuỗi khóa thư viện bốn cơ sở (TCAG) (Hình bổ sung 1a):
Lớp mồi dung hợp ngược cũng chứa biotin được gắn vào các hạt bắt giữ và GS FLX Titanium Adapter B cần thiết để khuếch đại dòng vô tính trong quá trình PCR nhũ tương:
Sau đó, các bộ khuếch đại được xử lý bằng phương pháp phóng hỏa 454/Roche theo giao thức 454 GS-FLX Titanium.Đối với giải trình tự Sanger thủ công (Máy phân tích DNA Hitachi 3730 xl của Application Biosystems), DNA của thể thực khuẩn T7 được khuếch đại bằng PCR và giải trình tự bằng các cặp mồi sau:
Các phần chèn từ các mảng riêng lẻ đã được khuếch đại PCR bằng cách sử dụng Bộ công cụ DNA polymerase bắt đầu nhanh của Roche (theo hướng dẫn của nhà sản xuất).Thực hiện khởi động nóng (10 phút ở 95°C) và 35 chu kỳ tăng tốc (50 giây ở 95°C, 1 phút ở 50°C và 1 phút ở 72°C).
Thể thực khuẩn từ các thư viện, thể thực khuẩn dại, thể thực khuẩn được giải cứu từ CSF và máu, hoặc các dòng vô tính riêng lẻ được khuếch đại trong Escherichia coli BL5615 trong môi trường TB (Sigma Aldrich) hoặc trong các đĩa 500 cm2 (Thermo Science) trong 4 giờ ở 37°C.Thể thực khuẩn được chiết xuất từ ​​​​các đĩa bằng cách rửa các đĩa bằng dung dịch đệm Tris-EDTA (Fluka Analytical) hoặc bằng cách thu thập các mảng bằng đầu pipet vô trùng.Thể thực khuẩn được phân lập từ dịch nổi nuôi cấy phía trên hoặc dung dịch đệm chiết bằng một vòng kết tủa polyetylen glycol (PEG 8000) (Promega) và được tạo huyền phù lại trong dung dịch đệm Tris-EDTA.
Thể thực khuẩn được khuếch đại đã trải qua 2-3 vòng loại bỏ nội độc tố bằng cách sử dụng hạt loại bỏ nội độc tố (Miltenyi Biotec) trước khi tiêm tĩnh mạch (IV) (500 μl/con).Trong vòng đầu tiên, các phage 2×1012 đã được giới thiệu;trong phage thứ hai, 2×1010;trong vòng lựa chọn thứ ba và thứ tư, 2 × 109 phage trên mỗi động vật.Hàm lượng thể thực khuẩn trong CSF và các mẫu máu được thu thập tại các thời điểm được chỉ định được xác định bằng cách đếm mảng bám theo hướng dẫn của nhà sản xuất (hướng dẫn sử dụng hệ thống T7Select).Lựa chọn thể thực khuẩn được thực hiện bằng cách tiêm tĩnh mạch các thư viện tinh khiết vào tĩnh mạch đuôi hoặc bằng cách tiêm lại thể thực khuẩn được chiết xuất từ ​​CSF từ vòng lựa chọn trước đó và các lần thu hoạch tiếp theo được thực hiện sau 10 phút, 30 phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút, 180 phút và 240 phút tương ứng với mẫu máu và CSF.Tổng cộng có bốn vòng quét in vivo đã được tiến hành trong đó hai nhánh được chọn được lưu trữ và phân tích riêng trong ba vòng lựa chọn đầu tiên.Tất cả các thể thực khuẩn chèn được chiết xuất từ ​​CSF từ hai vòng lựa chọn đầu tiên đều phải trải qua quá trình đốt cháy 454/Roche, trong khi tất cả các dòng vô tính được chiết xuất từ ​​CSF từ hai vòng lựa chọn cuối cùng đều được giải trình tự thủ công.Tất cả các thể thực khuẩn máu từ vòng lựa chọn đầu tiên cũng phải trải qua quá trình phát quang 454/Roche.Để tiêm các dòng vô tính của thể thực khuẩn, các thể thực khuẩn đã chọn được khuếch đại trong E. coli (BL5615) trên các đĩa 500 cm2 ở 37°C trong 4 giờ.Các dòng vô tính được chọn riêng lẻ và giải trình tự thủ công đã được nhân giống trong môi trường TB.Sau khi chiết xuất thể thực khuẩn, tinh chế và loại bỏ nội độc tố (như mô tả ở trên), 2×1010 thể thực khuẩn/con trong 300 μl được tiêm tĩnh mạch vào một tĩnh mạch đuôi.
Tiền xử lý và lọc định tính dữ liệu trình tự.Dữ liệu thô 454/Roche đã được chuyển đổi từ định dạng bản đồ luồng tiêu chuẩn nhị phân (sff) sang định dạng Pearson con người có thể đọc được (fasta) bằng phần mềm của nhà cung cấp.Việc xử lý thêm trình tự nucleotide được thực hiện bằng các chương trình và tập lệnh C độc quyền (gói phần mềm chưa được phát hành) như được mô tả bên dưới.Việc phân tích dữ liệu sơ cấp bao gồm các quy trình lọc nhiều giai đoạn nghiêm ngặt.Để lọc ra các lần đọc không chứa trình tự DNA chèn 12 giờ hợp lệ, các lần đọc được căn chỉnh tuần tự thành nhãn bắt đầu (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), nhãn dừng (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) và chèn nền (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) bằng cách sử dụng bài kiểm tra Needleman-Wunsch toàn cầu.căn chỉnh cho phép tối đa 2 điểm không nhất quán trên mỗi căn chỉnh31.Do đó, các lượt đọc không có thẻ bắt đầu và thẻ dừng cũng như các lượt đọc có chứa phần chèn nền, tức là, sắp xếp vượt quá số lượng không khớp cho phép, đã bị xóa khỏi thư viện.Đối với các lần đọc còn lại, trình tự DNA N-mer kéo dài từ dấu bắt đầu và kết thúc trước dấu dừng đã được loại bỏ khỏi trình tự đọc ban đầu và được xử lý thêm (sau đây gọi là "chèn").Sau khi dịch đoạn chèn, phần sau codon kết thúc đầu tiên ở đầu 5′ của đoạn mồi được loại bỏ khỏi đoạn chèn.Ngoài ra, các nucleotide dẫn đến codon không hoàn thiện ở đầu 3′ của đoạn mồi cũng bị loại bỏ.Để loại trừ các phần chèn chỉ chứa trình tự nền, các phần chèn đã dịch bắt đầu bằng mẫu axit amin “PAG” cũng bị loại bỏ.Các peptit có độ dài sau dịch mã nhỏ hơn 3 axit amin đã bị xóa khỏi thư viện.Cuối cùng, loại bỏ dư thừa trong nhóm chèn và xác định tần suất của từng lần chèn duy nhất.Kết quả của phân tích này bao gồm một danh sách các trình tự nucleotide (phần chèn) và tần số (đọc) của chúng (Hình bổ sung 1c và 2).
Nhóm các đoạn chèn DNA N-mer theo độ tương tự trình tự: Để loại bỏ các lỗi trình tự đặc hiệu 454/Roche (chẳng hạn như các vấn đề với phần mở rộng homopolyme trình tự) và loại bỏ các phần thừa ít quan trọng hơn, các đoạn chèn trình tự DNA N-mer đã lọc trước đó được sắp xếp theo độ tương đồng.các lần chèn (cho phép tối đa 2 cơ sở không khớp) bằng cách sử dụng thuật toán lặp được định nghĩa như sau: các lần chèn trước được sắp xếp theo tần suất của chúng (cao nhất đến thấp nhất) và nếu chúng giống nhau, theo sắp xếp phụ theo độ dài (dài nhất đến ngắn nhất) ).Do đó, các lần chèn thường xuyên nhất và dài nhất sẽ xác định “nhóm” đầu tiên.Tần số nhóm được đặt thành tần số chính.Sau đó, mỗi lần chèn còn lại trong danh sách đã sắp xếp đã được cố gắng thêm vào nhóm bằng cách căn chỉnh Needleman-Wunsch theo cặp.Nếu số lần không khớp, thêm hoặc xóa trong một căn chỉnh không vượt quá ngưỡng 2, thì một lần chèn sẽ được thêm vào nhóm và tần suất tổng thể của nhóm được tăng lên theo tần suất lần thêm đó.Các phụ trang được thêm vào một nhóm được đánh dấu là đã sử dụng và không được xử lý thêm.Nếu không thể thêm trình tự chèn vào một nhóm đã tồn tại, thì trình tự chèn được sử dụng để tạo một nhóm mới với tần suất chèn thích hợp và được đánh dấu là đã sử dụng.Quá trình lặp lại kết thúc khi mỗi trình tự chèn đã được sử dụng để tạo thành một nhóm mới hoặc có thể được đưa vào một nhóm đã tồn tại.Rốt cuộc, các phần chèn được nhóm bao gồm các nucleotide cuối cùng được dịch thành các chuỗi peptide (thư viện peptide).Kết quả của phân tích này là một tập hợp các lần chèn và tần số tương ứng của chúng tạo nên số lần đọc liên tiếp (Hình bổ sung 2).
Tạo Motif: Dựa trên danh sách các peptit duy nhất, một thư viện đã được tạo ra chứa tất cả các mẫu axit amin có thể có (aa) như hình bên dưới.Mỗi mẫu có thể có độ dài 3 được chiết xuất từ ​​peptit và mẫu nghịch đảo của nó được thêm vào cùng với một thư viện họa tiết chung chứa tất cả các mẫu (tripeptide).Các thư viện có họa tiết lặp đi lặp lại cao đã được sắp xếp theo trình tự và loại bỏ phần thừa.Sau đó, đối với mỗi tripeptide trong thư viện họa tiết, chúng tôi đã kiểm tra sự hiện diện của nó trong thư viện bằng các công cụ tính toán.Trong trường hợp này, tần suất của peptit chứa tripeptide mô-đun tìm thấy được thêm vào và gán cho mô-đun trong thư viện mô-đun (“số lượng mô-đun”).Kết quả của việc tạo mô-đun là một mảng hai chiều chứa tất cả các lần xuất hiện của tripeptide (mô-đun) và các giá trị tương ứng của chúng, là số lần đọc trình tự dẫn đến mô-đun tương ứng khi các lần đọc được lọc, nhóm và dịch.Các chỉ số như được mô tả chi tiết ở trên.
Chuẩn hóa số lượng họa tiết và biểu đồ phân tán tương ứng: Số lượng họa tiết cho mỗi mẫu được chuẩn hóa bằng cách sử dụng
trong đó ni là số lượt đọc chứa chủ đề i.Do đó, vi đại diện cho tần suất phần trăm của số lần đọc (hoặc peptide) có chứa họa tiết i trong mẫu.Giá trị P cho số lượng họa tiết không chuẩn hóa được tính toán bằng phép thử chính xác của Fisher.Về biểu đồ tương quan của số lượng động cơ, mối tương quan của Spearman được tính toán bằng cách sử dụng số lượng động cơ đã chuẩn hóa với R.
Để trực quan hóa nội dung của các axit amin ở mỗi vị trí trong thư viện peptide, biểu đồ web 32, 33 (//weblogo.threeplusone.com) đã được tạo.Đầu tiên, hàm lượng axit amin ở mỗi vị trí của peptit 12-mer được lưu trữ trong ma trận 20×12.Sau đó, một bộ gồm 1000 peptit chứa hàm lượng axit amin tương đối giống nhau ở mỗi vị trí được tạo ở định dạng chuỗi fasta và được cung cấp làm đầu vào cho biểu trưng web 3, tạo ra biểu tượng đồ họa về hàm lượng axit amin tương đối ở mỗi vị trí.cho một thư viện peptide nhất định.Để trực quan hóa các bộ dữ liệu đa chiều, các bản đồ nhiệt đã được tạo bằng một công cụ được phát triển nội bộ trong R (biosHeatmap, gói R chưa được phát hành).Các chương trình dendro được trình bày trong bản đồ nhiệt được tính toán bằng phương pháp phân cụm theo cấp bậc của Ward với thước đo khoảng cách Euclide.Để phân tích thống kê dữ liệu chấm điểm họa tiết, giá trị P cho điểm không chuẩn hóa được tính bằng phép thử chính xác của Fisher.Giá trị P cho các bộ dữ liệu khác được tính bằng R bằng cách sử dụng t-test của Sinh viên hoặc ANOVA.
Các thể thực khuẩn vô tính được chọn và các thể thực khuẩn không chèn được tiêm vào tĩnh mạch qua tĩnh mạch đuôi (2 × 1010 thể thực khuẩn/động vật trong 300 μl PBS).Mười phút trước khi truyền dịch và cố định sau đó, các động vật tương tự đã được tiêm vào tĩnh mạch 100 μl lectin có nhãn DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177).60 phút sau khi tiêm thể thực khuẩn, chuột được truyền dịch qua tim với 50 ml PBS, sau đó là 50 ml 4% PFA/PBS.Các mẫu não cũng được cố định qua đêm trong 4% PFA/PBS và ngâm trong 30% sucrose qua đêm ở 4°C.Các mẫu được đông lạnh nhanh trong hỗn hợp OCT.Phân tích hóa mô miễn dịch của các mẫu đông lạnh được thực hiện ở nhiệt độ phòng trên các ca phẫu thuật lạnh 30 µm được chặn bằng 1% BSA và được ủ với các kháng thể đa dòng được đánh dấu FITC chống lại thể thực khuẩn T7 (Novus NB 600-376A) ở 4°C.Ủ qua đêm.Cuối cùng, các phần được rửa 3 lần bằng PBS và được kiểm tra bằng kính hiển vi laser đồng tiêu (Leica TCS SP5).
Tất cả các peptide có độ tinh khiết tối thiểu là 98% được tổng hợp bởi GenScript USA, được đánh dấu biotin và đông khô.Biotin được liên kết thông qua một bộ ba đệm glycine bổ sung ở đầu N.Kiểm tra tất cả các peptit bằng phép đo khối phổ.
Streptavidin (Sigma S0677) được trộn với lượng peptit ức chế BACE1 đánh dấu biotin, lượng thừa gấp 5 lần peptit ức chế BACE1 đánh dấu biotin, hoặc hỗn hợp (tỷ lệ 3:1) peptit ức chế BACE1 đánh dấu biotin và peptit ức chế BACE1 trong 5–10% DMSO/được ủ trong PBS.1 giờ ở nhiệt độ phòng trước khi tiêm.Peptide liên hợp Streptavidin được tiêm tĩnh mạch với liều 10 mg/kg vào một trong các tĩnh mạch đuôi của chuột có khoang não.
Nồng độ của phức hợp streptavidin-peptide được đánh giá bằng ELISA.Các tấm microtiter Nunc Maxisorp (Sigma) được phủ qua đêm ở 4°C với kháng thể kháng streptavidin của chuột 1,5 μg/ml (Thermo, MA1-20011).Sau khi chặn (đệm chặn: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% gelatin, 1% BSA) ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ, rửa đĩa bằng 0,05% Tween-20/PBS (đệm rửa) trong 3 giây, mẫu CSF và huyết tương được thêm vào các giếng đã pha loãng với đệm chặn (huyết tương 1:10.000, CSF 1:115).Sau đó, đĩa này được ủ qua đêm ở 4°C với kháng thể phát hiện (1 μg/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239).Sau ba bước rửa, streptavidin được phát hiện bằng cách ủ trong dung dịch chất nền TMB (Roche) trong tối đa 20 phút.Sau khi ngừng hiện màu với H2SO4 1M, đo độ hấp thụ ở 450 nm.
Chức năng của phức hợp ức chế streptavidin-peptide-BACE1 được đánh giá bằng ELISA Aβ(1-40) theo giao thức của nhà sản xuất (Wako, 294-64701).Tóm lại, các mẫu Dịch não tủy được pha loãng trong chất pha loãng tiêu chuẩn (1:23) và ủ qua đêm ở 4°C trong các đĩa 96 giếng được phủ kháng thể bắt giữ BNT77.Sau năm bước rửa, kháng thể BA27 liên hợp với HRP đã được thêm vào và ủ trong 2 giờ ở 4° C., sau đó là năm bước rửa.Aβ(1–40) được phát hiện bằng cách ủ trong dung dịch TMB trong 30 phút ở nhiệt độ phòng.Sau khi ngừng hiện màu bằng dung dịch dừng, đo độ hấp thụ ở bước sóng 450 nm.Các mẫu huyết tương đã được chiết xuất pha rắn trước ELISA Aβ(1–40).Huyết tương được thêm vào 0,2% DEA (Sigma) trong các đĩa 96 giếng và ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.Sau khi rửa liên tục các tấm SPE (Oasis, 186000679) bằng nước và 100% metanol, các mẫu huyết tương được thêm vào các tấm SPE và tất cả chất lỏng được loại bỏ.Các mẫu được rửa (đầu tiên với 5% metanol sau đó 30% metanol) và rửa giải bằng 2% NH4OH/90% metanol.Sau khi làm khô dịch rửa giải ở 55°C trong 99 phút ở dòng N2 không đổi, các mẫu được khử trong chất pha loãng tiêu chuẩn và Aβ(1–40) được đo như mô tả ở trên.
Cách trích dẫn bài viết này: Urich, E. et al.Vận chuyển hàng hóa đến não bằng cách sử dụng các peptide vận chuyển được xác định in vivo.khoa học.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB và Moos T. Cung cấp thuốc đại phân tử đến não bằng liệu pháp nhắm mục tiêu.Tạp chí Hóa học Thần kinh 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., và Martinez-Martinez, P. Cung cấp các loại thuốc peptide và protein qua hàng rào máu não.Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Hàng rào máu não: nút cổ chai trong quá trình phát triển thuốc não.NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG và Byrd, A. Triển vọng cải thiện việc vận chuyển thuốc và nhắm mục tiêu đến não thông qua con đường đám rối màng đệm-CSF.Nghiên cứu Dược phẩm 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Hiện đại hóa dược phẩm sinh học với ngựa Trojan phân tử để cung cấp não.Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, vận chuyển peptide qua trung gian thụ thể WM qua hàng rào máu não.Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al.Tăng khả năng thâm nhập não và hiệu quả của các kháng thể trị liệu bằng cách sử dụng các con thoi phân tử đơn trị.Tế bào thần kinh 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al.Sự vận chuyển của thụ thể transferrin (TfR) xác định sự hấp thu của não đối với các biến thể ái lực của kháng thể TfR.J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).