Một số chủ đề khắc phục sự cố LC không bao giờ lỗi thời, vì có những vấn đề trong thực tiễn LC, ngay cả khi công nghệ thiết bị được cải thiện theo thời gian. Có nhiều cách mà các sự cố có thể phát sinh trong hệ thống LC và kết thúc ở dạng đỉnh kém. Khi các vấn đề liên quan đến hình dạng đỉnh phát sinh, một danh sách ngắn các nguyên nhân có thể dẫn đến những kết quả này giúp đơn giản hóa trải nghiệm khắc phục sự cố của chúng tôi.
Thật thú vị khi viết chuyên mục “Khắc phục sự cố LC” này và suy nghĩ về các chủ đề mỗi tháng, bởi vì một số chủ đề không bao giờ lỗi mốt. Trong khi trong lĩnh vực nghiên cứu sắc ký, một số chủ đề hoặc ý tưởng trở nên lỗi thời khi chúng được thay thế bằng những ý tưởng mới hơn và tốt hơn, thì trong lĩnh vực khắc phục sự cố, kể từ khi bài báo khắc phục sự cố đầu tiên xuất hiện trên tạp chí này (Tạp chí LC vào thời điểm đó) vì một số chủ đề vẫn còn phù hợp) vào năm 1983(1). Trong vài năm qua, tôi đã tập trung vào một số phần Khắc phục sự cố LC về các xu hướng đương đại ảnh hưởng đến sắc ký lỏng ography (LC) (ví dụ: so sánh tương đối về hiểu biết của chúng tôi về tác động của áp suất đối với việc lưu giữ [2] Những tiến bộ mới) Diễn giải của chúng tôi về kết quả LC và cách khắc phục sự cố bằng các công cụ LC hiện đại. Trong phần tháng này, tôi sẽ tiếp tục loạt bài của mình (3), bắt đầu vào tháng 12 năm 2021, tập trung vào một số chủ đề “sống và chết” của khắc phục sự cố LC — các yếu tố cần thiết cho bất kỳ trình khắc phục sự cố nào, bất kể hệ thống chúng ta đang sử dụng ở độ tuổi nào. Chủ đề chính của loạt bài này rất liên quan đến LCGC Biểu đồ treo tường nổi tiếng "Hướng dẫn khắc phục sự cố LC" (4) được treo trong nhiều phòng thí nghiệm. Đối với phần thứ ba của loạt bài này, tôi đã chọn tập trung vào các vấn đề liên quan đến hình dạng đỉnh hoặc các đặc điểm của đỉnh. Thật đáng kinh ngạc, biểu đồ treo tường liệt kê 44 nguyên nhân tiềm ẩn khác nhau dẫn đến hình dạng đỉnh kém! Chúng ta không thể xem xét chi tiết tất cả các vấn đề này trong một bài viết, vì vậy trong phần đầu tiên của chủ đề này, tôi sẽ tập trung vào một số vấn đề tôi thấy thường xuyên nhất. Tôi hy vọng người dùng LC trẻ và già sẽ tìm thấy một số lời khuyên và lời nhắc hữu ích về chủ đề quan trọng này.
Tôi thấy mình ngày càng trả lời các câu hỏi khắc phục sự cố bằng câu "mọi thứ đều có thể xảy ra". Câu trả lời này có vẻ dễ dàng khi xem xét các quan sát khó diễn giải, nhưng tôi thấy nó thường phù hợp. Với nhiều nguyên nhân có thể gây ra hình dạng đỉnh kém, điều quan trọng là phải cởi mở khi xem xét vấn đề có thể là gì và có thể ưu tiên các nguyên nhân tiềm ẩn để bắt đầu nỗ lực khắc phục sự cố của chúng tôi, tập trung vào những khả năng phổ biến nhất đó, điểm này rất quan trọng.có thể.
Một bước quan trọng trong bất kỳ bài tập khắc phục sự cố nào — nhưng tôi cho là bị đánh giá thấp — là nhận ra rằng có vấn đề cần được giải quyết. Nhận ra rằng có vấn đề thường có nghĩa là nhận ra rằng những gì xảy ra với công cụ khác với mong đợi của chúng ta, vốn được định hình bởi lý thuyết, kiến ​​thức thực nghiệm và kinh nghiệm (5). “Hình dạng đỉnh” được đề cập ở đây thực sự không chỉ đề cập đến hình dạng của đỉnh (đối xứng, không đối xứng, nhẵn, mịn, cạnh đầu, đuôi, v.v.), mà còn liên quan đến chiều rộng. Kỳ vọng của chúng ta về hình dạng đỉnh thực tế rất đơn giản. (6) hỗ trợ tốt cho kỳ vọng trong sách giáo khoa rằng, trong hầu hết các trường hợp, các pic sắc ký phải đối xứng và phù hợp với hình dạng của phân bố Gaussian, như thể hiện trong Hình 1a. Những gì chúng ta mong đợi từ độ rộng của pic là một vấn đề phức tạp hơn và chúng ta sẽ thảo luận về chủ đề này trong một bài viết trong tương lai. Các hình dạng pic khác trong Hình 1 cho thấy một số khả năng khác có thể quan sát được—nói cách khác, một số cách mọi thứ có thể diễn ra sai. Trong phần còn lại của phần này, chúng ta sẽ dành thời gian thảo luận về một số ví dụ cụ thể về các tình huống có thể dẫn đến các loại hình dạng này.
Đôi khi, các pic hoàn toàn không được quan sát thấy trong sắc ký đồ nơi chúng dự kiến ​​sẽ được rửa giải. Biểu đồ trên tường cho thấy rằng việc không có pic (giả sử mẫu thực sự chứa chất cần phân tích ở nồng độ sẽ làm cho phản ứng của máy dò đủ để nhìn thấy nó trên nhiễu) thường liên quan đến một số vấn đề về thiết bị hoặc điều kiện pha động không chính xác (nếu có).các đỉnh, thường là quá “yếu”). Danh sách ngắn các vấn đề tiềm ẩn và các giải pháp trong danh mục này có thể được tìm thấy trong Bảng I.
Như đã đề cập ở trên, câu hỏi nên cho phép mở rộng đỉnh đến mức nào trước khi chú ý và cố gắng khắc phục nó là một chủ đề phức tạp mà tôi sẽ thảo luận trong một bài viết trong tương lai. Kinh nghiệm của tôi là việc mở rộng đỉnh đáng kể thường đi kèm với sự thay đổi đáng kể về hình dạng đỉnh và hiện tượng đuôi đỉnh phổ biến hơn so với đỉnh trước hoặc phân tách. Tuy nhiên, các đỉnh đối xứng trên danh nghĩa cũng được mở rộng, có thể do một vài lý do khác nhau gây ra:
Từng vấn đề này đã được thảo luận chi tiết trong các số trước của Khắc phục sự cố LC và độc giả quan tâm đến các chủ đề này có thể tham khảo các bài viết trước đó để biết thông tin về nguyên nhân gốc rễ và các giải pháp tiềm năng cho những vấn đề này.Thêm chi tiết.
Hiện tượng bám đuôi, tạo đỉnh và tách pic đều có thể do các hiện tượng hóa học hoặc vật lý gây ra và danh sách các giải pháp tiềm năng cho những vấn đề này rất khác nhau, tùy thuộc vào việc chúng ta đang xử lý vấn đề hóa học hay vật lý. Thông thường, bằng cách so sánh các pic khác nhau trong sắc ký đồ, bạn có thể tìm ra manh mối quan trọng về thủ phạm. Nếu tất cả các pic trong sắc ký đồ có hình dạng giống nhau thì nguyên nhân rất có thể không phải do vật lý. Nếu chỉ một hoặc một vài pic bị ảnh hưởng, nhưng các pic còn lại trông bình thường thì rất có thể nguyên nhân là do hóa chất.
Các nguyên nhân hóa học của việc tạo đuôi pic quá phức tạp để thảo luận ngắn gọn ở đây. Bạn đọc quan tâm có thể tham khảo vấn đề “Khắc phục sự cố LC” gần đây để thảo luận sâu hơn (10). Tuy nhiên, một điều dễ dàng để thử là giảm khối lượng của chất phân tích được bơm vào và xem hình dạng pic có cải thiện không. với khối lượng lớn hơn được tiêm.
Ngoài ra còn có nhiều lý do vật lý tiềm ẩn cho hiện tượng đuôi đỉnh. Độc giả quan tâm đến phần thảo luận chi tiết về các khả năng có thể tham khảo một số khác gần đây về "Khắc phục sự cố LC" (11). Một trong những nguyên nhân vật lý phổ biến hơn của hiện tượng đuôi đỉnh là kết nối kém tại một điểm giữa kim phun và máy dò (12). Một ví dụ điển hình được thể hiện trong Hình 1d, thu được trong phòng thí nghiệm của tôi cách đây vài tuần. Trong trường hợp này, chúng tôi đã xây dựng một hệ thống có van bơm mới mà chúng tôi chưa từng sử dụng trước đây và lắp đặt một vòng bơm thể tích nhỏ với một ống bao đã được đúc vào một mao quản bằng thép không gỉ. Sau một số thử nghiệm khắc phục sự cố ban đầu, chúng tôi nhận ra rằng độ sâu cổng trong stato van phun sâu hơn nhiều so với trước đây, dẫn đến một lượng lớn thể tích chết ở dưới cùng của cổng. Vấn đề này được giải quyết dễ dàng bằng cách thay thế vòng bơm bằng một ống khác, chúng ta có thể điều chỉnh ống gia cố đến vị trí thích hợp để loại bỏ thể tích chết ở dưới cùng của cổng.
Mặt trước của pic như trong Hình 1e cũng có thể do các vấn đề vật lý hoặc hóa học gây ra. Một nguyên nhân vật lý phổ biến của mép đầu ra là lớp hạt của cột không được nén chặt hoặc các hạt đã tổ chức lại theo thời gian. Đối với hiện tượng đuôi pic do hiện tượng vật lý này gây ra, cách tốt nhất để khắc phục điều này là thay cột và tiếp tục chạy. Về cơ bản, hình dạng đỉnh của mép đầu có nguồn gốc hóa học thường phát sinh từ cái mà chúng ta gọi là điều kiện lưu giữ "phi tuyến tính". Trong điều kiện lý tưởng (tuyến tính), lượng chất phân tích được giữ lại bởi chất phân tích pha tĩnh (do đó, hệ số lưu giữ) có liên quan tuyến tính với nồng độ của chất phân tích trong cột. Về mặt sắc ký, điều này có nghĩa là khi khối lượng chất phân tích được bơm vào cột tăng lên, pic sẽ cao hơn, nhưng không rộng hơn. Mối quan hệ này bị phá vỡ khi đặc tính lưu giữ không tuyến tính và các pic không chỉ trở nên cao hơn mà còn rộng hơn khi khối lượng được bơm vào nhiều hơn. 10), đạo trình pic gây ra bởi sự lưu giữ phi tuyến tính cũng có thể được chẩn đoán bằng cách giảm khối lượng chất phân tích được tiêm. Nếu hình dạng pic được cải thiện, phương pháp phải được sửa đổi để không vượt quá chất lượng tiêm gây ra cạnh đạo trình hoặc các điều kiện sắc ký phải được thay đổi để giảm thiểu hiện tượng này.
Đôi khi, chúng tôi quan sát thấy thứ dường như là một pic "tách", như thể hiện trong Hình 1f. Bước đầu tiên để giải quyết vấn đề này là xác định xem hình dạng của pic có phải là do quá trình đồng rửa giải một phần hay không (tức là, sự có mặt của hai hợp chất rửa giải riêng biệt nhưng gần nhau). Nếu thực sự có hai chất phân tích khác nhau rửa giải gần nhau, thì vấn đề là cải thiện độ phân giải của chúng (ví dụ: bằng cách tăng độ chọn lọc, khả năng lưu giữ hoặc số lượng đĩa) và các pic "tách" rõ ràng có liên quan đến Hiệu suất vật lý không liên quan gì đến bản thân cột. Thông thường, đầu mối quan trọng nhất để đưa ra quyết định này là liệu tất cả các pic trong sắc ký đồ có hình dạng phân tách hay chỉ một hoặc hai. Nếu chỉ có một hoặc hai pic, thì đó có thể là vấn đề về đồng rửa giải;nếu tất cả các đỉnh đều bị chia tách, thì đó có thể là sự cố vật lý, rất có thể liên quan đến chính cột đó.
Các pic phân tách liên quan đến tính chất vật lý của chính cột thường là do các frit đầu vào hoặc đầu ra bị chặn một phần, hoặc sự sắp xếp lại các hạt trong cột, cho phép pha động chảy nhanh hơn pha động ở một số vùng nhất định của sự hình thành kênh cột. Ở các vùng khác (11). Đôi khi, frit bị tắc một phần có thể được làm sạch bằng cách đảo ngược dòng chảy qua cột;tuy nhiên, theo kinh nghiệm của tôi, đây thường là giải pháp ngắn hạn hơn là dài hạn. Điều này thường gây nguy hiểm với các cột hiện đại nếu các hạt kết hợp lại trong cột. Tại thời điểm này, tốt nhất là thay cột và tiếp tục.
Đỉnh trong Hình 1g, cũng từ một ví dụ gần đây trong phòng thí nghiệm của riêng tôi, thường chỉ ra rằng tín hiệu cao đến mức nó đã đạt đến mức cao nhất của dải phản hồi. Đối với máy dò độ hấp thụ quang học (trong trường hợp này là UV-vis), khi nồng độ chất phân tích rất cao, chất phân tích sẽ hấp thụ hầu hết ánh sáng đi qua tế bào dòng của máy dò, để lại rất ít ánh sáng được phát hiện. có dạng “mờ” và không phụ thuộc vào nồng độ chất phân tích.Khi điều này xảy ra, vấn đề thường có thể được giải quyết dễ dàng bằng cách giảm thể tích tiêm chất phân tích—giảm thể tích tiêm, pha loãng mẫu hoặc cả hai.
Trong trường sắc ký, chúng tôi sử dụng tín hiệu máy dò (tức là trục y trong sắc ký đồ) làm chỉ báo nồng độ chất phân tích trong mẫu. Vì vậy, có vẻ kỳ lạ khi thấy sắc ký đồ có tín hiệu dưới 0, vì cách giải thích đơn giản là điều này biểu thị nồng độ chất phân tích âm – tất nhiên là không thể về mặt vật lý. Theo kinh nghiệm của tôi, các đỉnh âm thường được quan sát thấy nhất khi sử dụng máy dò độ hấp thụ quang (ví dụ: UV-vis).
Trong trường hợp này, pic âm đơn giản có nghĩa là các phân tử rửa giải từ cột hấp thụ ít ánh sáng hơn bản thân pha động ngay trước và sau pic. Ví dụ, điều này có thể xảy ra khi sử dụng các bước sóng phát hiện tương đối thấp (<230 nm) và các chất phụ gia pha động hấp thụ hầu hết ánh sáng ở các bước sóng này. Các chất phụ gia như vậy có thể là các thành phần dung môi pha động như metanol hoặc các thành phần đệm như axetat hoặc formate. Người ta thực sự có thể sử dụng các pic âm để chuẩn bị đường chuẩn và thu được thông tin định lượng chính xác, vì vậy không có lý do cơ bản nào để tránh chúng (điều này phương pháp đôi khi được gọi là “phát hiện tia cực tím gián tiếp”) (13). Tuy nhiên, nếu chúng ta thực sự muốn tránh hoàn toàn các đỉnh âm, trong trường hợp phát hiện độ hấp thụ, giải pháp tốt nhất là sử dụng bước sóng phát hiện khác để chất phân tích hấp thụ nhiều hơn pha động hoặc thay đổi thành phần của pha động để chúng hấp thụ ít ánh sáng hơn chất phân tích.
Các cực đại âm cũng có thể xuất hiện khi sử dụng phương pháp phát hiện chỉ số khúc xạ (RI) khi chỉ số khúc xạ của các thành phần không phải là chất phân tích trong mẫu, chẳng hạn như nền dung môi, khác với chỉ số khúc xạ của pha động. Điều này cũng xảy ra với phát hiện UV-vis, nhưng hiệu ứng này có xu hướng giảm đi so với phát hiện RI. Trong cả hai trường hợp, các cực đại âm có thể được giảm thiểu bằng cách kết hợp chặt chẽ hơn thành phần của nền mẫu với thành phần của pha động.
Trong phần ba về chủ đề cơ bản của khắc phục sự cố LC, tôi đã thảo luận các tình huống trong đó hình dạng đỉnh quan sát được khác với hình dạng đỉnh dự kiến ​​hoặc bình thường. Khắc phục hiệu quả các sự cố như vậy bắt đầu bằng kiến ​​thức về hình dạng đỉnh dự kiến ​​(dựa trên lý thuyết hoặc kinh nghiệm trước đó với các phương pháp hiện có), do đó, sai lệch so với những mong đợi này là hiển nhiên. Các vấn đề về hình dạng đỉnh có nhiều nguyên nhân tiềm ẩn khác nhau (quá rộng, đuôi, cạnh đầu, v.v.). khả năng. Độc giả quan tâm đến danh sách nguyên nhân và giải pháp chuyên sâu hơn có thể tham khảo biểu đồ treo tường “Hướng dẫn khắc phục sự cố LC” của LCGC.
(4) Biểu đồ treo tường LCGC “Hướng dẫn khắc phục sự cố LC”.https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Phân tích dữ liệu và xử lý tín hiệu trong sắc ký (Elsevier, New York, NY, 1998), trang 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF và Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev.907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.