Một số chủ đề khắc phục sự cố LC không bao giờ lỗi thời, vì có những vấn đề trong thực hành LC, ngay cả khi công nghệ thiết bị được cải thiện theo thời gian. Có nhiều cách mà các vấn đề có thể phát sinh trong hệ thống LC và dẫn đến hình dạng đỉnh kém. Khi các vấn đề liên quan đến hình dạng đỉnh phát sinh, danh sách ngắn các nguyên nhân có thể dẫn đến những kết quả này sẽ giúp đơn giản hóa trải nghiệm khắc phục sự cố của chúng tôi.
Thật thú vị khi viết chuyên mục “Khắc phục sự cố LC” này và suy nghĩ về các chủ đề mỗi tháng, vì một số chủ đề không bao giờ lỗi thời. Trong lĩnh vực nghiên cứu sắc ký, một số chủ đề hoặc ý tưởng nhất định trở nên lỗi thời khi chúng được thay thế bằng những ý tưởng mới hơn và tốt hơn, trong lĩnh vực khắc phục sự cố, kể từ khi bài viết khắc phục sự cố đầu tiên xuất hiện trên tạp chí này (Tạp chí LC vào thời điểm đó) vì một số chủ đề vẫn còn phù hợp) vào năm 1983(1). Trong vài năm qua, tôi đã tập trung một số phần Khắc phục sự cố LC vào các xu hướng đương đại ảnh hưởng đến sắc ký lỏng (LC) (ví dụ: so sánh tương đối về hiểu biết của chúng ta về tác động của áp suất đối với khả năng giữ lại [2] Những tiến bộ mới) Diễn giải của chúng tôi về kết quả LC và cách khắc phục sự cố bằng các thiết bị LC hiện đại. Trong phần của tháng này, tôi sẽ tiếp tục loạt bài (3) của mình, bắt đầu vào tháng 12 năm 2021, tập trung vào một số chủ đề “sống còn” của việc khắc phục sự cố LC — các yếu tố tuyệt vời đối với bất kỳ người khắc phục sự cố nào đều cần thiết, bất kể hệ thống chúng ta đang sử dụng có tuổi đời bao nhiêu. Chủ đề cốt lõi của loạt bài này có liên quan cao đến “Khắc phục sự cố LC Biểu đồ treo tường “Hướng dẫn” (4) treo trong nhiều phòng thí nghiệm. Đối với phần thứ ba của loạt bài này, tôi đã chọn tập trung vào các vấn đề liên quan đến hình dạng đỉnh hoặc đặc điểm đỉnh. Thật không thể tin được, biểu đồ treo tường liệt kê 44 nguyên nhân tiềm ẩn khác nhau gây ra hình dạng đỉnh kém! Chúng ta không thể xem xét tất cả các vấn đề này một cách chi tiết trong một bài viết, vì vậy trong phần đầu tiên về chủ đề này, tôi sẽ tập trung vào một số vấn đề mà tôi thấy thường xuyên nhất. Tôi hy vọng những người dùng LC trẻ và già sẽ tìm thấy một số mẹo và lời nhắc hữu ích về chủ đề quan trọng này.
Tôi thấy mình ngày càng trả lời các câu hỏi khắc phục sự cố bằng câu "mọi thứ đều có thể xảy ra". Câu trả lời này có vẻ dễ dàng khi xem xét các quan sát khó diễn giải, nhưng tôi thấy nó thường phù hợp. Với nhiều nguyên nhân có thể gây ra hình dạng đỉnh kém, điều quan trọng là phải giữ một tâm trí cởi mở khi xem xét vấn đề có thể là gì và có thể ưu tiên các nguyên nhân tiềm ẩn để bắt đầu nỗ lực khắc phục sự cố của chúng ta, tập trung vào những khả năng phổ biến nhất, điểm này rất quan trọng. có thể.
Một bước quan trọng trong bất kỳ bài tập khắc phục sự cố nào — nhưng tôi nghĩ là một bước bị đánh giá thấp — là nhận ra rằng có một vấn đề cần được giải quyết. Nhận ra rằng có một vấn đề thường có nghĩa là nhận ra rằng những gì xảy ra với công cụ khác với kỳ vọng của chúng ta, được hình thành bởi lý thuyết, kiến ​​thức thực nghiệm và kinh nghiệm (5). "Hình dạng đỉnh" được đề cập ở đây thực sự không chỉ đề cập đến hình dạng của đỉnh (đối xứng, không đối xứng, trơn tru, mịn, cạnh trước, đuôi, v.v.), mà còn đề cập đến chiều rộng. Kỳ vọng của chúng ta về hình dạng đỉnh thực tế rất đơn giản. Lý thuyết (6) hỗ trợ tốt cho kỳ vọng trong sách giáo khoa rằng, trong hầu hết các trường hợp, các đỉnh sắc ký phải đối xứng và tuân theo hình dạng của phân phối chuẩn Gauss, như thể hiện trong Hình 1a. Những gì chúng ta mong đợi từ chiều rộng đỉnh là một vấn đề phức tạp hơn và chúng ta sẽ thảo luận về chủ đề này trong một bài viết trong tương lai. Các hình dạng đỉnh khác trong Hình 1 cho thấy một số khả năng khác có thể được quan sát — nói cách khác, một số cách mọi thứ có thể diễn ra không ổn. Trong phần còn lại của phần này, chúng ta sẽ dành thời gian thảo luận về một số ví dụ cụ thể về những tình huống có thể dẫn đến những hình dạng này.
Đôi khi, các đỉnh không được quan sát thấy trong sắc ký đồ, nơi chúng được mong đợi sẽ được rửa giải. Biểu đồ tường ở trên chỉ ra rằng việc không có đỉnh (giả sử mẫu thực sự chứa chất phân tích mục tiêu ở nồng độ đủ để khiến phản ứng của máy dò đủ để nhìn thấy nó trên nhiễu) thường liên quan đến một số vấn đề về thiết bị hoặc điều kiện pha động không chính xác (nếu quan sát thấy). các đỉnh, thường là quá "yếu"). Danh sách ngắn các vấn đề tiềm ẩn và giải pháp trong danh mục này có trong Bảng I.
Như đã đề cập ở trên, câu hỏi về mức độ mở rộng đỉnh nên được chấp nhận trước khi chú ý và cố gắng khắc phục là một chủ đề phức tạp mà tôi sẽ thảo luận trong một bài viết trong tương lai. Theo kinh nghiệm của tôi, việc mở rộng đỉnh đáng kể thường đi kèm với sự thay đổi đáng kể về hình dạng đỉnh và hiện tượng đuôi đỉnh phổ biến hơn so với trước đỉnh hoặc tách đỉnh. Tuy nhiên, các đỉnh đối xứng danh nghĩa cũng bị mở rộng, có thể do một số lý do khác nhau:
Mỗi vấn đề này đã được thảo luận chi tiết trong các số trước của Troubleshooting LC và độc giả quan tâm đến các chủ đề này có thể tham khảo các bài viết trước để biết thông tin về nguyên nhân gốc rễ và các giải pháp tiềm năng cho các vấn đề này. Xem thêm chi tiết.
Đuôi đỉnh, mặt đỉnh và tách đỉnh đều có thể do hiện tượng hóa học hoặc vật lý gây ra, và danh sách các giải pháp tiềm năng cho những vấn đề này rất khác nhau, tùy thuộc vào việc chúng ta đang giải quyết vấn đề hóa học hay vật lý. Thông thường, bằng cách so sánh các đỉnh khác nhau trong sắc ký đồ, bạn có thể tìm ra manh mối quan trọng về thủ phạm. Nếu tất cả các đỉnh trong sắc ký đồ có hình dạng tương tự nhau, thì nguyên nhân rất có thể không phải là vật lý. Nếu chỉ có một hoặc một vài đỉnh bị ảnh hưởng, nhưng phần còn lại trông ổn, thì nguyên nhân rất có thể là hóa chất.
Nguyên nhân hóa học của hiện tượng đuôi đỉnh quá phức tạp để thảo luận ngắn gọn ở đây. Độc giả quan tâm có thể tham khảo ấn bản gần đây của “LC Troubleshooting” để thảo luận sâu hơn (10). Tuy nhiên, một điều dễ dàng để thử là giảm khối lượng chất phân tích được tiêm và xem hình dạng đỉnh có cải thiện không. Nếu vậy, thì đây là một manh mối tốt cho thấy vấn đề là “quá tải khối lượng”. Trong trường hợp này, phương pháp phải được giới hạn ở việc tiêm các khối lượng chất phân tích nhỏ hoặc phải thay đổi các điều kiện sắc ký để có thể thu được hình dạng đỉnh tốt ngay cả khi tiêm các khối lượng lớn hơn.
Ngoài ra còn có nhiều lý do vật lý tiềm ẩn cho hiện tượng đuôi đỉnh. Độc giả quan tâm đến thảo luận chi tiết về các khả năng có thể tham khảo một số báo gần đây khác của “Khắc phục sự cố LC” (11). Một trong những nguyên nhân vật lý phổ biến hơn gây ra đuôi đỉnh là kết nối kém tại một điểm giữa kim phun và đầu dò (12). Một ví dụ cực đoan được thể hiện trong Hình 1d, thu được trong phòng thí nghiệm của tôi cách đây vài tuần. Trong trường hợp này, chúng tôi đã xây dựng một hệ thống với một van phun mới mà chúng tôi chưa từng sử dụng trước đây và lắp đặt một vòng tiêm thể tích nhỏ có vòng đệm đã được đúc trên một mao quản bằng thép không gỉ. Sau một số thí nghiệm khắc phục sự cố ban đầu, chúng tôi nhận ra rằng độ sâu của cổng trong stato van phun sâu hơn nhiều so với độ sâu mà chúng tôi từng sử dụng, dẫn đến một thể tích chết lớn ở đáy cổng. Vấn đề này có thể dễ dàng giải quyết bằng cách thay thế vòng tiêm bằng một ống khác, chúng tôi có thể điều chỉnh vòng đệm đến vị trí thích hợp để loại bỏ thể tích chết ở đáy cổng.
Mặt trận đỉnh như thể hiện trong Hình 1e cũng có thể do các vấn đề vật lý hoặc hóa học gây ra. Một nguyên nhân vật lý phổ biến của cạnh trước là lớp hạt của cột không được đóng gói tốt hoặc các hạt đã được sắp xếp lại theo thời gian. Cũng giống như đuôi đỉnh do hiện tượng vật lý này gây ra, cách tốt nhất để khắc phục điều này là thay thế cột và tiếp tục. Về cơ bản, hình dạng đỉnh cạnh trước có nguồn gốc hóa học thường phát sinh từ những gì chúng ta gọi là điều kiện lưu giữ "không tuyến tính". Trong điều kiện lý tưởng (tuyến tính), lượng chất phân tích được pha tĩnh giữ lại (do đó, hệ số lưu giữ) có liên quan tuyến tính với nồng độ chất phân tích trong cột. Về mặt sắc ký, điều này có nghĩa là khi khối lượng chất phân tích được tiêm vào cột tăng lên, đỉnh sẽ cao hơn nhưng không rộng hơn. Mối quan hệ này bị phá vỡ khi hành vi lưu giữ không tuyến tính và các đỉnh không chỉ cao hơn mà còn rộng hơn khi khối lượng được tiêm nhiều hơn. Ngoài ra, hình dạng không tuyến tính xác định hình dạng của các đỉnh sắc ký, dẫn đến các cạnh trước hoặc sau. Cũng giống như quá tải khối lượng gây ra đuôi đỉnh (10), sự dẫn đầu đỉnh do sự lưu giữ phi tuyến tính cũng có thể được chẩn đoán bằng cách giảm khối lượng chất phân tích được tiêm. Nếu hình dạng đỉnh được cải thiện, phương pháp phải được sửa đổi để không vượt quá chất lượng tiêm gây ra cạnh dẫn đầu hoặc các điều kiện sắc ký phải được thay đổi để giảm thiểu hành vi này.
Đôi khi chúng ta quan sát thấy những gì có vẻ là đỉnh "chia tách", như thể hiện trong Hình 1f. Bước đầu tiên để giải quyết vấn đề này là xác định xem hình dạng đỉnh có phải do đồng rửa giải một phần (tức là sự hiện diện của hai hợp chất riêng biệt nhưng rửa giải gần nhau) hay không. Nếu thực sự có hai chất phân tích khác nhau rửa giải gần nhau, thì vấn đề là phải cải thiện độ phân giải của chúng (ví dụ, bằng cách tăng độ chọn lọc, khả năng giữ lại hoặc số lượng đĩa) và các đỉnh "chia tách" rõ ràng có liên quan đến hiệu suất vật lý không liên quan gì đến bản thân cột. Thông thường, manh mối quan trọng nhất cho quyết định này là liệu tất cả các đỉnh trong sắc ký đồ có biểu hiện hình dạng chia tách hay chỉ một hoặc hai đỉnh. Nếu chỉ có một hoặc hai đỉnh, thì có thể là vấn đề đồng rửa giải; nếu tất cả các đỉnh đều bị chia tách, thì có thể là vấn đề vật lý, rất có thể liên quan đến bản thân cột.
Các đỉnh chia tách liên quan đến các tính chất vật lý của chính cột thường là do các hạt frit đầu vào hoặc đầu ra bị chặn một phần hoặc sự sắp xếp lại các hạt trong cột, cho phép pha động chảy nhanh hơn pha động ở một số khu vực nhất định của quá trình hình thành kênh cột. ở các vùng khác (11). Đôi khi, có thể làm sạch các hạt frit bị tắc một phần bằng cách đảo ngược dòng chảy qua cột; tuy nhiên, theo kinh nghiệm của tôi, đây thường là giải pháp ngắn hạn chứ không phải dài hạn. Điều này thường gây tử vong đối với các cột hiện đại nếu các hạt kết hợp lại bên trong cột. Tại thời điểm này, tốt nhất là thay thế cột và tiếp tục.
Đỉnh trong Hình 1g, cũng từ một trường hợp gần đây trong phòng thí nghiệm của tôi, thường chỉ ra rằng tín hiệu quá cao đến mức đã đạt đến giới hạn cao của phạm vi phản hồi. Đối với các máy dò hấp thụ quang học (UV-vis trong trường hợp này), khi nồng độ chất phân tích rất cao, chất phân tích hấp thụ hầu hết ánh sáng đi qua ô dòng máy dò, để lại rất ít ánh sáng có thể phát hiện được. Trong những điều kiện này, tín hiệu điện từ máy dò quang bị ảnh hưởng rất nhiều bởi nhiều nguồn nhiễu khác nhau, chẳng hạn như ánh sáng đi lạc và "dòng điện tối", khiến tín hiệu có vẻ ngoài rất "mờ" và không phụ thuộc vào nồng độ chất phân tích. Khi điều này xảy ra, vấn đề thường có thể dễ dàng giải quyết bằng cách giảm thể tích tiêm chất phân tích—giảm thể tích tiêm, pha loãng mẫu hoặc cả hai.
Trong trường phái sắc ký, chúng ta sử dụng tín hiệu đầu dò (tức là trục y trong sắc ký đồ) làm chỉ báo nồng độ chất phân tích trong mẫu. Vì vậy, có vẻ lạ khi thấy sắc ký đồ có tín hiệu dưới 0, vì cách giải thích đơn giản là điều này biểu thị nồng độ chất phân tích âm – tất nhiên là điều này không thể xảy ra về mặt vật lý. Theo kinh nghiệm của tôi, các đỉnh âm thường được quan sát thấy nhất khi sử dụng đầu dò hấp thụ quang học (ví dụ: UV-vis).
Trong trường hợp này, một đỉnh âm chỉ đơn giản có nghĩa là các phân tử rửa giải từ cột hấp thụ ít ánh sáng hơn so với chính pha động ngay trước và sau đỉnh. Điều này có thể xảy ra, ví dụ, khi sử dụng bước sóng phát hiện tương đối thấp (<230 nm) và các chất phụ gia pha động hấp thụ hầu hết ánh sáng ở các bước sóng này. Các chất phụ gia như vậy có thể là các thành phần dung môi pha động như methanol hoặc các thành phần đệm như axetat hoặc format. Trên thực tế, người ta có thể sử dụng các đỉnh âm để chuẩn bị đường cong hiệu chuẩn và thu được thông tin định lượng chính xác, do đó không có lý do cơ bản nào để tránh chúng (phương pháp này đôi khi được gọi là "phát hiện UV gián tiếp") (13). Tuy nhiên, nếu chúng ta thực sự muốn tránh hoàn toàn các đỉnh âm, trong trường hợp phát hiện độ hấp thụ, giải pháp tốt nhất là sử dụng bước sóng phát hiện khác để chất phân tích hấp thụ nhiều hơn pha động hoặc thay đổi thành phần của pha động để chúng hấp thụ ít ánh sáng hơn chất phân tích.
Các đỉnh âm cũng có thể xuất hiện khi sử dụng phương pháp phát hiện chiết suất (RI) khi chiết suất của các thành phần khác ngoài chất phân tích trong mẫu, chẳng hạn như ma trận dung môi, khác với chiết suất của pha động. Điều này cũng xảy ra với phương pháp phát hiện UV-vis, nhưng hiệu ứng này có xu hướng giảm đi so với phương pháp phát hiện RI. Trong cả hai trường hợp, các đỉnh âm có thể được giảm thiểu bằng cách kết hợp chặt chẽ hơn thành phần của ma trận mẫu với thành phần của pha động.
Trong phần ba về chủ đề cơ bản về khắc phục sự cố LC, tôi đã thảo luận về các tình huống trong đó hình dạng đỉnh quan sát được khác với hình dạng đỉnh mong đợi hoặc bình thường. Việc khắc phục sự cố hiệu quả các vấn đề như vậy bắt đầu bằng việc biết về hình dạng đỉnh mong đợi (dựa trên lý thuyết hoặc kinh nghiệm trước đây với các phương pháp hiện có), do đó, độ lệch so với các kỳ vọng này là rõ ràng. Các vấn đề về hình dạng đỉnh có nhiều nguyên nhân tiềm ẩn khác nhau (quá rộng, đuôi, cạnh trước, v.v.). Trong phần này, tôi sẽ thảo luận chi tiết về một số lý do mà tôi thấy thường xuyên nhất. Việc biết các chi tiết này cung cấp một nơi tốt để bắt đầu khắc phục sự cố, nhưng không nắm bắt được tất cả các khả năng. Độc giả quan tâm đến danh sách nguyên nhân và giải pháp chuyên sâu hơn có thể tham khảo biểu đồ tường "Hướng dẫn khắc phục sự cố LCGC".
(4) Biểu đồ treo tường “Hướng dẫn khắc phục sự cố LCGC”. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Phân tích dữ liệu và xử lý tín hiệu trong sắc ký (Elsevier, New York, NY, 1998), trang 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF và Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.