Cảm ơn bạn đã truy cập Nature.com. Bạn đang sử dụng phiên bản trình duyệt có hỗ trợ CSS hạn chế. Để có trải nghiệm tốt nhất, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng trình duyệt đã cập nhật (hoặc tắt Chế độ tương thích trong Internet Explorer). Ngoài ra, để đảm bảo hỗ trợ liên tục, chúng tôi hiển thị trang web không có kiểu dáng và JavaScript.
Hiển thị một vòng quay gồm ba slide cùng một lúc. Sử dụng các nút Trước và Tiếp theo để di chuyển qua ba slide cùng một lúc hoặc sử dụng các nút thanh trượt ở cuối để di chuyển qua ba slide cùng một lúc.
Các bào quan thần kinh tự lắp ráp đại diện cho một nền tảng in vitro đầy hứa hẹn để mô hình hóa sự phát triển và bệnh tật của con người. Tuy nhiên, các organoid thiếu khả năng kết nối tồn tại trong cơ thể sống, điều này hạn chế sự trưởng thành và ngăn cản sự tích hợp với các mạch khác kiểm soát hành vi. Ở đây, chúng tôi chỉ ra rằng các organoid vỏ não có nguồn gốc từ tế bào gốc của con người được cấy ghép vào vỏ não cảm giác somatosensory của chuột sơ sinh phát triển các loại tế bào trưởng thành tích hợp vào các mạch liên quan đến cảm giác và động lực. MRI cho thấy sự phát triển của organoid sau khi cấy ghép ở một số dòng tế bào gốc và động vật, trong khi phân tích lõi đơn cho thấy sự tiến triển của quá trình hình thành vỏ não và sự xuất hiện của chương trình phiên mã phụ thuộc vào hoạt động. Thật vậy, các tế bào thần kinh vỏ não được cấy ghép biểu hiện các đặc tính hình thái, khớp thần kinh và màng bên trong phức tạp hơn so với các tế bào tương ứng trong ống nghiệm, cho phép phát hiện các khiếm khuyết của tế bào thần kinh ở những bệnh nhân mắc hội chứng Timothy. Việc theo dõi giải phẫu và chức năng đã chỉ ra rằng các bào quan được cấy ghép nhận được các đầu vào thalamocortical và corticocortical, và các bản ghi hoạt động thần kinh in vivo cho thấy các đầu vào này có thể tạo ra phản ứng cảm giác trong các tế bào của con người. Cuối cùng, các cơ quan vỏ não kéo dài các sợi trục khắp não chuột và hoạt động quang di truyền của chúng dẫn đến hành vi tìm kiếm phần thưởng. Do đó, các tế bào thần kinh vỏ não người được cấy ghép sẽ trưởng thành và tham gia vào các mạch của vật chủ kiểm soát hành vi. Chúng tôi hy vọng phương pháp này sẽ tạo điều kiện phát hiện các kiểu hình cấp độ sợi trong các tế bào có nguồn gốc từ bệnh nhân mà không thể phát hiện bằng các phương tiện khác.
Bộ não con người đang phát triển là một quá trình tự tổ chức đáng chú ý trong đó các tế bào tăng sinh, biệt hóa, di chuyển và kết nối để hình thành các mạch nơ-ron chức năng được tinh chỉnh hơn nữa thông qua trải nghiệm cảm giác. Một vấn đề chính trong việc hiểu sự phát triển của não người, đặc biệt là trong bối cảnh bệnh tật, là việc thiếu khả năng tiếp cận mô não. Các bào quan tự tổ chức, bao gồm các cơ quan vỏ não người (hCO; còn được gọi là khối cầu vỏ não người), có thể tạo ra 2,3,4,5,6. Tuy nhiên, một số hạn chế hạn chế ứng dụng rộng rãi hơn của chúng trong việc hiểu sự phát triển và hoạt động của các mạch thần kinh. Đặc biệt, không rõ liệu sự trưởng thành của hCO có bị hạn chế bởi sự vắng mặt của một số đầu vào vi mô và cảm giác có trong cơ thể sống hay không. Ngoài ra, vì hCO không được tích hợp vào các mạch có thể tạo ra kết quả hành vi, nên tiện ích của chúng trong việc mô hình hóa các rối loạn thần kinh tâm thần phức tạp về mặt di truyền và hành vi hiện đang bị hạn chế.
Việc cấy ghép hCO vào não sống nguyên vẹn có thể khắc phục những hạn chế này. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng các tế bào thần kinh của con người được cấy ghép vào vỏ não của loài gặm nhấm có thể sống sót, chiếu và giao tiếp với các tế bào gặm nhấm7,8,9,10,11,12. Tuy nhiên, các thí nghiệm này thường được thực hiện trên động vật trưởng thành, điều này có thể hạn chế sự tích hợp synap và sợi trục. Ở đây, chúng tôi mô tả một mô hình cấy ghép trong đó chúng tôi cấy ghép hCO 3D có nguồn gốc từ các tế bào hiPS vào vỏ não cảm giác cơ thể chính (S1) của những con chuột bị suy giảm miễn dịch ở giai đoạn đầu của quá trình phát triển dẻo. Các tế bào thần kinh hCO (t-hCO) được cấy ghép trải qua quá trình trưởng thành đáng kể, nhận các đầu vào từ vỏ não đồi thị và vỏ não-vỏ não gây ra phản ứng cảm giác và mở rộng các đường chiếu sợi trục vào não chuột để thúc đẩy hành vi tìm kiếm phần thưởng. Quá trình trưởng thành kéo dài của t-hCO đã tiết lộ các khiếm khuyết về tế bào thần kinh ở những bệnh nhân mắc hội chứng Timothy (TS), một rối loạn di truyền nghiêm trọng do đột biến ở kênh canxi CaV1.2 loại L nhạy cảm với điện áp (được mã hóa bởi CACNA1C).
Để nghiên cứu các tế bào thần kinh vỏ não của con người trong các mạch in vivo, chúng tôi đã cấy ghép lập thể hCO 3D nguyên vẹn vào S1 của những con chuột athymic sau sinh sớm (ngày thứ 3-7 sau sinh) (Hình 1a và dữ liệu mở rộng của Hình 1a-c). Tại thời điểm này, các nhánh trục vỏ não và vỏ não vẫn chưa hoàn thành sự chi phối S1 của chúng (tham khảo 13). Do đó, phương pháp này được thiết kế để tối đa hóa sự tích hợp t-hCO trong khi giảm thiểu tác động lên các mạch nội sinh. Để hình dung vị trí của t-hCO ở động vật sống, chúng tôi đã thực hiện tái tạo não MRI có trọng số T2 của chuột 2-3 tháng sau khi cấy ghép (Hình 1b và dữ liệu mở rộng, Hình 1d). t-hCO được quan sát dễ dàng và các phép đo thể tích t-hCO tương tự như các phép đo được tính toán từ các lát cắt cố định (Dữ liệu mở rộng Hình 1d,e; P > 0,05). t-hCO được quan sát dễ dàng và các phép đo thể tích t-hCO tương tự như các phép đo được tính toán từ các lát cắt cố định (Dữ liệu mở rộng Hình 1d,e; P > 0,05). t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезов (расширенные данные, рис. 1d, e; P> 0,05). t-hCO được quan sát dễ dàng và các phép đo t-hCO thể tích tương tự như các phép đo được tính toán cho các phần cố định (dữ liệu mở rộng, Hình 1d, e; P > 0,05).很容易观察到t-hCO,并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P > 0.05)。很容易观察到t-hCO,并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезов (расширенные данные, рис. 1d, e; P> 0,05). t-hCO được quan sát dễ dàng và các phép đo t-hCO thể tích tương tự như các phép đo được tính toán cho các phần cố định (dữ liệu mở rộng, Hình 1d, e; P > 0,05).Chúng tôi đã xác định t-hCO ở 81% số động vật được cấy ghép khoảng 2 tháng sau khi cấy ghép (n = 72 động vật; hCO từ 10 dòng tế bào hiPS; dòng tế bào hiPS trong Bảng bổ sung 1). Trong số này, 87% nằm ở vỏ não (Hình 1c). Bằng cách thực hiện quét MRI nối tiếp tại nhiều thời điểm trên cùng một con chuột được cấy ghép, chúng tôi thấy thể tích t-hCO tăng gấp chín lần trong vòng 3 tháng (Hình 1d và dữ liệu mở rộng, Hình 1f). Động vật được cấy ghép có tỷ lệ sống sót cao (74%) sau 12 tháng sau khi cấy ghép (dữ liệu mở rộng, Hình 1g và Bảng bổ sung 2) và không phát hiện thấy suy giảm vận động hoặc trí nhớ rõ ràng, chứng thần kinh đệm hoặc điện não đồ (EEG). Dữ liệu Hình 1g và bảng bổ sung 2). 1h–m và 3e).
a, Sơ đồ thiết kế thử nghiệm. hCO có nguồn gốc từ tế bào hiPS được cấy ghép vào S1 của chuột nhắt trắng sơ sinh vào ngày 30-60 của quá trình biệt hóa. b, Hình ảnh MRI ngang và vành đai có trọng số T2 cho thấy t-hCO ở S1 2 tháng sau khi cấy ghép. Thanh tỷ lệ, 2 mm. c, Định lượng tỷ lệ thành công của ghép được hiển thị cho từng dòng tế bào hiPS (n = 108, các số trong thanh biểu thị lượng t-hCO trên mỗi dòng tế bào hIPS) và vị trí vỏ não hoặc dưới vỏ não (n = 88). d, Hình ảnh MRI của động mạch vành (bên trái; thanh tỷ lệ, 3 mm) và tái tạo thể tích 3D tương ứng (thanh tỷ lệ, 3 mm) cho thấy sự gia tăng t-hCO sau 3 tháng. e, Đánh giá các kiểu t-hCO trong vỏ não chuột. Thanh tỷ lệ, 1 mm. f, Hình ảnh miễn dịch tế bào hóa học đại diện của t-hCO được hiển thị từ trên cùng bên trái sang phải (trong quá trình biệt hóa): PPP1R17 (4 tháng tuổi), NeuN (8 tháng tuổi), SOX9 và GFAP (8 tháng tuổi), PDGFRα; (8 tháng), MAP2 (8 tháng) và IBA1 (8 tháng). Thanh tỷ lệ, 20 µm. Đồng biểu hiện của HNA chỉ ra các tế bào có nguồn gốc từ con người. g, snRNA-seq: Hình ảnh giảm chiều đa tạp và chiếu thống nhất (UMAP) của tất cả các nhân t-hCO chất lượng cao sau khi tích hợp Seurat (n = 3 mẫu t-hCO, n = 2 dòng tế bào hiPS). Tế bào hình sao, các tế bào của dòng tế bào hình sao; cyc prog, tiền thân lưu hành; GluN DL, tế bào thần kinh glutamatergic sâu; GluN DL/SP, tế bào thần kinh glutamatergic sâu và dưới lớp; GluN UL, tế bào thần kinh glutamatergic lớp trên; tế bào ít nhánh, tế bào ít nhánh; OPC, tế bào tiền thân của tế bào ít sợi nhánh; RELN, tế bào thần kinh reelin. h, Phân tích làm giàu thuật ngữ Gene Ontology (GO) của các gen được điều chỉnh tăng đáng kể (P điều chỉnh < 0,05, thay đổi gấp > 2, được thể hiện ở ít nhất 10% nhân) trong các tế bào thần kinh glutamatergic t-hCO so với các tế bào thần kinh glutamatergic hCO. h, Phân tích làm giàu thuật ngữ Gene Ontology (GO) của các gen được điều chỉnh tăng đáng kể (P điều chỉnh < 0,05, thay đổi gấp > 2, được thể hiện ở ít nhất 10% nhân) trong các tế bào thần kinh glutamatergic t-hCO so với các tế bào thần kinh glutamatergic hCO. h, Анализ обогащения терминов Gene Ontology (GO) для генов со значительной активацией (скорректированный P <0,05, кратность изменения > 2, экспрессия по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO. h, Phân tích làm giàu thuật ngữ Gene Ontology (GO) đối với các gen có hoạt hóa đáng kể (P điều chỉnh <0,05, thay đổi gấp >2, biểu hiện ở ít nhất 10% nhân) trong tế bào thần kinh glutamatergic t-hCO so với tế bào thần kinh glutamatergic hCO. h,与hCO 谷氨酸能神经元相比,t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调整后P < 0,05,倍数变化> 2. 在至少10% 的细胞核中表达)的基因本体论(GO) 术语富集分析。 h , 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 , t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 （后 后 p <0,05 , 变化变化> 2 , 至少 10% 的 核中 表达) 基因 基因 基因 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的的 的本体论(GO) 术语富集分析。 h, гены значительно активизировались (скорректированный P <0,05, кратность изменения> 2, экспрессируется по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO Онтологический (GO) анализ đó là lý do tại sao. h, các gen được điều chỉnh tăng đáng kể (P điều chỉnh < 0,05, thay đổi gấp > 2, được biểu hiện ở ít nhất 10% nhân) trong các tế bào thần kinh glutamatergic t-hCO so với các tế bào thần kinh glutamatergic hCO Phân tích bản thể (GO) của thuật ngữ làm giàu.Đường chấm chấm biểu thị giá trị aq là 0,05. i, hình ảnh UMAP của các loại tế bào GluN trong t-hCO sử dụng chuyển nhãn từ bộ dữ liệu vỏ não vận động người lớn tham chiếu 22 snRNA-seq. CT — tế bào vỏ não, ET — tế bào ngoài não, IT — tế bào não trước bên trong, NP — hình chiếu gần.
Sau đó, chúng tôi đánh giá cấu trúc tế bào và thành phần tế bào tổng thể của t-hCO. Nhuộm kháng thể các tế bào nội mô chuột cho thấy sự mạch hóa với t-hCO, trong khi nhuộm IBA1 cho thấy sự hiện diện của microglia chuột trong toàn bộ mô ghép (Hình 1f và dữ liệu mở rộng, Hình 3c, d). Nhuộm miễn dịch cho thấy các tế bào dương tính với kháng nguyên hạt nhân người (HNA) đồng biểu hiện PPP1R17 (tiền thân vỏ não), NeuN (nơ-ron), SOX9 và GFAP (tế bào có nguồn gốc từ tế bào thần kinh đệm) hoặc PDGFRα (tiền thân của oligodendrocyte) (Hình 1f). Để nghiên cứu thành phần tế bào của t-hCO ở độ phân giải tế bào đơn, chúng tôi đã thực hiện giải trình tự RNA lõi đơn (snRNA-seq) sau khoảng 8 tháng biệt hóa. Lọc số lượng lớn và loại bỏ nhân chuột đã tạo ra 21.500 bản đồ đơn nhân người chất lượng cao (Hình 1g và dữ liệu mở rộng, Hình 4a, b). Các kiểu biểu hiện của các dấu hiệu loại tế bào điển hình đã xác định các cụm của các lớp tế bào vỏ não chính, bao gồm các tế bào thần kinh glutamatergic sâu và nông, các tế bào tiền thân lưu thông, các tế bào ít nhánh và dòng tế bào hình sao (Hình 1g, dữ liệu mở rộng, Hình 4c và Bảng bổ sung 3). Miễn dịch nhuộm đối với SATB2 và CTIP2 cho thấy rằng mặc dù có sự hiện diện của các phân nhóm vỏ não, t-hCO không cho thấy sự phân tầng giải phẫu rõ ràng (dữ liệu mở rộng, Hình 3a). snRNA-seq hCO phù hợp giai đoạn tạo ra các lớp tế bào tương tự nhau, với một vài ngoại lệ, bao gồm sự vắng mặt của các tế bào ít nhánh và sự hiện diện của các tế bào thần kinh GABAergic, điều này có thể phản ánh các điều kiện thuận lợi trong ống nghiệm đã được báo cáo trước đây đối với các tế bào tiền thân bên15 (dữ liệu mở rộng, Hình 4f – i và Bảng bổ sung 4). Phân tích biểu hiện gen khác biệt cho thấy sự khác biệt đáng kể trong các tế bào thần kinh glutamatergic giữa t-hCO và hCO (Bảng bổ sung 5), bao gồm kích hoạt các bộ gen liên quan đến sự trưởng thành của tế bào thần kinh như tín hiệu synap, định vị nhánh cây và hoạt động kênh có cổng điện áp (Hình 1h và Bảng bổ sung 5). bảng 6). Theo đó, các tế bào thần kinh glutamatergic t-hCO vỏ não biểu hiện sự trưởng thành phiên mã nhanh hơn.
Để làm sáng tỏ liệu những thay đổi phiên mã này trong t-hCO có liên quan đến sự khác biệt về hình thái giữa hCO trong ống nghiệm và t-hCO trong cơ thể sống hay không, chúng tôi đã tái tạo hCO và hCO chứa biocytin phù hợp giai đoạn trong các lát cắt cấp tính sau 7–8 tháng biệt hóa. Các tế bào thần kinh hCO (Hình 2a). Các tế bào thần kinh t-hCO lớn hơn đáng kể, có đường kính thân tế bào gấp 1,5 lần, số lượng sợi nhánh gấp đôi và tổng chiều dài sợi nhánh tăng gấp sáu lần so với hCO trong ống nghiệm (Hình 2b). Ngoài ra, chúng tôi quan sát thấy mật độ gai sợi nhánh cao hơn đáng kể ở các tế bào thần kinh t-hCO so với các tế bào thần kinh hCO (Hình 2c). Điều này cho thấy các tế bào thần kinh t-hCO trải qua quá trình kéo dài và phân nhánh sợi nhánh rộng rãi, kết hợp với sự tăng sinh tế bào liên tục, có thể góp phần vào sự phát triển mạnh mẽ của t-hCO sau khi cấy ghép (Hình 1d và Dữ liệu mở rộng Hình 1f). Điều này thúc đẩy chúng tôi nghiên cứu các đặc tính điện sinh lý. Điện dung màng cao hơn tám lần (dữ liệu mở rộng, Hình 8d), điện thế màng trạng thái nghỉ phân cực cao hơn (khoảng 20 mV) và tiêm dòng điện gây ra tốc độ kích thích tối đa cao hơn ở tế bào thần kinh t-hCO so với tế bào thần kinh hCO. trong ống nghiệm (Hình 2d), e), phù hợp với các đặc điểm hình thái lớn hơn và phức tạp hơn của t-hCO. Ngoài ra, tần suất các sự kiện dòng điện sau synap kích thích tự phát (EPSC) cao hơn đáng kể ở tế bào thần kinh t-hCO (Hình 2f), cho thấy mật độ gai dendrit tăng lên được quan sát thấy ở tế bào thần kinh t-hCO có liên quan đến khả năng kích thích chức năng. khớp thần kinh tình dục. Chúng tôi đã xác nhận tính chất chưa trưởng thành của tế bào thần kinh hCO trong ống nghiệm bằng cách ghi lại tế bào thần kinh glutamatergic được gắn nhãn (dữ liệu mở rộng, Hình 6a-c).
a, Tái tạo 3D các tế bào thần kinh hCO và t-hCO chứa đầy biocytin sau 8 tháng biệt hóa. b, Định lượng các đặc điểm hình thái (n = 8 tế bào thần kinh hCO, n = 6 tế bào thần kinh t-hCO; **P = 0,0084, *P = 0,0179 và ***P < 0,0001). b, Định lượng các đặc điểm hình thái (n = 8 tế bào thần kinh hCO, n = 6 tế bào thần kinh t-hCO; **P = 0,0084, *P = 0,0179 và ***P < 0,0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 и *** P <0,0001). b, định lượng các đặc điểm hình thái (n=8 tế bào thần kinh hCO, n=6 tế bào thần kinh t-hCO; **P=0,0084, *P=0,0179 và ***P<0,0001). b,形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元,n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084,*P = 0,0179 和***P < 0,0001)。 b,形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元,n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084,*P = 0,0179 和***P < 0,0001)。 б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 и *** P <0,0001). b, định lượng các đặc điểm hình thái (n=8 tế bào thần kinh hCO, n=6 tế bào thần kinh t-hCO; **P=0,0084, *P=0,0179 và ***P<0,0001).c, Tái tạo 3D các nhánh nhánh dendritic hCO và t-hCO sau 8 tháng biệt hóa. Các dấu hoa thị màu đỏ chỉ ra các gai dendritic được cho là. Định lượng mật độ gai dendritic (n = 8 tế bào thần kinh hCO, n = 6 tế bào thần kinh t-hCO; **P = 0,0092). d, Định lượng điện thế màng nghỉ (n = 25 tế bào thần kinh hCO, n = 16 tế bào thần kinh t-hCO; ***P < 0,0001). d, Định lượng điện thế màng nghỉ (n = 25 tế bào thần kinh hCO, n = 16 tế bào thần kinh t-hCO; ***P < 0,0001). d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, định lượng điện thế màng khi nghỉ (n = 25 tế bào thần kinh hCO, n = 16 tế bào thần kinh t-hCO; ***P < 0,0001). d,静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元,n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001)。 d,静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元,n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001)。 d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, định lượng điện thế màng khi nghỉ (n = 25 tế bào thần kinh hCO, n = 16 tế bào thần kinh t-hCO; ***P < 0,0001). e, Sự kích hoạt tiềm năng hoạt động lặp đi lặp lại trong hCO và t-hCO được tạo ra bằng cách tăng cường tiêm dòng điện và định lượng tốc độ kích hoạt tối đa (n = 25 tế bào thần kinh hCO, n = 16 tế bào thần kinh t-hCO; ***P < 0,0001). e, Sự kích hoạt tiềm năng hoạt động lặp đi lặp lại trong hCO và t-hCO được tạo ra bằng cách tăng cường tiêm dòng điện và định lượng tốc độ kích hoạt tối đa (n = 25 tế bào thần kinh hCO, n = 16 tế bào thần kinh t-hCO; ***P < 0,0001). e, повторное возбуждение потенциала действия в hCO и t-hCO, вызванное увеличением тока, и количественная оценка người bán hàng возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, sự tái kích hoạt tiềm năng hoạt động trong hCO và t-hCO được gây ra bởi sự gia tăng dòng điện và định lượng tốc độ kích hoạt tối đa (n = 25 tế bào thần kinh hCO, n = 16 tế bào thần kinh t-hCO; *** P < 0,0001). e,通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电,以及最大放电率的量化（n = 25 个hCO神经元,n = 16 个t-hCO 神经元；***P < 0,0001)。 E , 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 , 以及 最 大 的 量化 （（n = 25 个 hco神经 , n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0,0001) 。 e, повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO и t-hCO, вызванное увеличением подачи тока, и количественная оценка максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, sự kích hoạt lặp đi lặp lại của các điện thế hoạt động hCO và t-hCO được tạo ra bởi nguồn cung cấp dòng điện tăng lên và định lượng tốc độ kích hoạt tối đa (n = 25 tế bào thần kinh hCO, n = 16 tế bào thần kinh t-hCO; *** P < 0,0001). f, EPSC tự phát (sEPSC) trong tế bào thần kinh hCO và t-hCO sau 8 tháng biệt hóa và định lượng tần suất các sự kiện synap (n = 25 tế bào thần kinh hCO, n = 17 tế bào thần kinh t-hCO; ***P < 0,0001). f, EPSC tự phát (sEPSC) trong tế bào thần kinh hCO và t-hCO sau 8 tháng biệt hóa và định lượng tần suất các sự kiện synap (n = 25 tế bào thần kinh hCO, n = 17 tế bào thần kinh t-hCO; ***P < 0,0001). f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев дифференцировки và количественная оценка частоты синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). f, EPSC tự phát (sEPSC) trong tế bào thần kinh hCO và t-hCO sau 8 tháng biệt hóa và định lượng tỷ lệ sự kiện synap (n=25 tế bào thần kinh hCO, n=17 tế bào thần kinh t-hCO; ***P<0,0001). f,分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs),以及突触事件频率的量化（n = 25 hCO神经元,n = 17 t-hCO 神经元；***P < 0,0001) . f,分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs),以及突触事件频率的量匼（n = 25 hCO神率的量匼(n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P < 0,0001) . f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев дифференцировки và количественная оценка частоты синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). f, EPSC tự phát (sEPSC) trong tế bào thần kinh hCO và t-hCO sau 8 tháng biệt hóa và định lượng tỷ lệ sự kiện synap (n = 25 tế bào thần kinh hCO, n = 17 tế bào thần kinh t-hCO; *** P <0,0001).Đối với bf, hCO và t-hCO ở dòng 1208-2 được lấy từ cùng một mẻ phân biệt được duy trì song song. g, Phân tích làm giàu bộ gen (kiểm định chính xác Fisher một chiều) của các gen được điều chỉnh tăng đáng kể (P điều chỉnh < 0,05, thay đổi gấp > 2, được biểu hiện ở ít nhất 10% nhân) trong các tế bào thần kinh glutamatergic t-hCO so với các tế bào thần kinh glutamatergic hCO có bộ gen của cả gen phụ thuộc hoạt động phản ứng sớm (ERG) và phản ứng muộn (LRG) được xác định từ nghiên cứu trên chuột in vivo16 và LRG đặc hiệu ở người từ các tế bào thần kinh in vitro17. g, Phân tích làm giàu bộ gen (kiểm định chính xác Fisher một chiều) của các gen được điều chỉnh tăng đáng kể (P điều chỉnh < 0,05, thay đổi gấp > 2, được biểu hiện ở ít nhất 10% nhân) trong các tế bào thần kinh glutamatergic t-hCO so với các tế bào thần kinh glutamatergic hCO có bộ gen của cả gen phụ thuộc hoạt động phản ứng sớm (ERG) và phản ứng muộn (LRG) được xác định từ nghiên cứu trên chuột in vivo16 và LRG đặc hiệu ở người từ các tế bào thần kinh in vitro17. g, анализ обогащения набора генов (односторонний точный критерий Фишера) генов со значительной активацией (скорректированный P <0,05, кратность изменения > 2, экспрессия по меньшей мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO наборы генов как раннего (ERG), так и позднего (LRG) генов, зависящих от активности, идентифицированных в исследовании на мышах in vivo16, và специфических для человека LRG из нейронов in vitro17. g, phân tích sự làm giàu bộ gen (kiểm định chính xác Fisher một đuôi) của các gen có hoạt hóa đáng kể (P điều chỉnh <0,05, thay đổi gấp >2, biểu hiện ở ít nhất 10% nhân) trong các tế bào thần kinh glutamatergic t-hCO so với các bộ tế bào thần kinh glutamatergic hCO của cả gen phụ thuộc vào hoạt động sớm (ERG) và muộn (LRG) được xác định ở chuột sống16 và LRG đặc hiệu ở người từ các tế bào thần kinh trong ống nghiệm17. g,t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比,t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0.05,倍数变化>2,在至少10%的细胞核中表达)的基因集富集分析（单侧F isher精确检验)从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特异性LRG。 g , t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 , t-hco 谷氨酸 神经 元 上调 （调整 后 p <0,05 , 倍数> 2 , 至少 至少 10%的 细胞 核中 表达) 的 集富集 分析 （单侧 ngư dân 精确） 体内 小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的 基因组 16 和 神经元神经元 17 中 中 17 中 17的人类特异性LRG。 g, глутаматергические нейроны t-hCO были значительно активизированы по сравнению сравнению с глутаматергическими нейронами hCO (скорректированный P<0,05, кратность изменения> 2, không có 10% Анализ обогащения набора генов (односторонний точный тест Фишера) раннего ответа (ERG) và позднего гены, зависящие от активности ответа (LRG), идентифицированные в исследованиях на мышах in vivo16 và neuйронах in ống nghiệm17. LRG, специфичные для человека. g, các tế bào thần kinh glutamatergic t-hCO được điều chỉnh tăng đáng kể so với các tế bào thần kinh glutamatergic hCO (P điều chỉnh <0,05, thay đổi gấp >2, ít nhất 10% Phân tích làm giàu gen phản ứng sớm (ERG) và phản ứng muộn (kiểm định chính xác Fisher một đuôi) các gen phụ thuộc vào hoạt động phản ứng (LRG) được xác định ở chuột sống16 và tế bào thần kinh trong ống nghiệm17 Các LRG đặc hiệu ở người.Đường chấm chấm biểu thị giá trị P đã hiệu chỉnh Bonferroni là 0,05. h, biểu hiện gen GluN (gói giả và tỷ lệ của từng gen) được điều chỉnh tăng đáng kể trong các bản sao snRNA-seq của gen LRG trong tế bào thần kinh glutamatergic t-hCO. i, nhuộm miễn dịch cho thấy biểu hiện SCG2 trong tế bào thần kinh t-hCO (phía trên) và hCO (phía dưới). Mũi tên trắng chỉ vào tế bào SCG2+. Thanh tỷ lệ, 25 µm. Dữ liệu được thể hiện dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn.
Dựa trên hoạt động tăng lên của t-hCO được quan sát thấy trong các lát cắt ex vivo, snRNA-seq cho thấy sự điều hòa tăng phụ thuộc vào hoạt động của các bản sao gen trong t-hCO so với hCO trong ống nghiệm. Các tế bào thần kinh t-hCO glutamatergic biểu hiện mức độ cao hơn của các gen điều chỉnh hoạt động đáp ứng muộn (Hình 2g, h), được tìm thấy trong các nghiên cứu trước đây ở tế bào thần kinh chuột và người16,17. Ví dụ, BDNF18, SCG2 và OSTN, một gen điều chỉnh hoạt động đặc hiệu của loài linh trưởng, cho thấy sự biểu hiện tăng lên ở các tế bào thần kinh t-hCO so với các tế bào thần kinh hCO (Hình 2g-i). Do đó, các tế bào thần kinh t-hCO biểu hiện các đặc điểm trưởng thành được tăng cường so với các tế bào thần kinh hCO thông qua các phân tích phiên mã, hình thái và chức năng.
Để đánh giá sâu hơn mối liên hệ giữa sự trưởng thành của t-hCO với sự phát triển của não người, chúng tôi đã tiến hành so sánh transcriptomic của các loại tế bào vỏ não của thai nhi và người lớn19,20 và người lớn21,22 cũng như dữ liệu mở rộng về biểu hiện gen vỏ não23 trong quá trình phát triển (dữ liệu mở rộng, Hình 5). ). với công trình trước đó24 , trạng thái trưởng thành của hCO và transcriptome t-hCO toàn cầu ở tháng thứ 7–8 của quá trình biệt hóa về cơ bản phù hợp với thời gian phát triển trong cơ thể sống và tương đương nhất với giai đoạn cuối của thai nhi (Dữ liệu mở rộngHình 5a). Đáng chú ý, chúng tôi đã quan sát thấy sự trưởng thành của transcriptome tăng lên ở t-hCO so với hCO cùng độ tuổi, cũng như sự kích hoạt transcriptome liên quan đến quá trình hình thành synap, hình thành sao và tạo myelin (dữ liệu mở rộng, Hình 5b-d). Ở cấp độ tế bào, chúng tôi tìm thấy bằng chứng về phân nhóm vỏ não mỏng hơn ở t-hCO, với các cụm tế bào thần kinh glutamatergic chồng lấn với các phân nhóm tế bào thần kinh L2/3, L5 và L6 của người lớn (Hình 1i). Ngược lại, sự chồng chéo cụm giữa các tế bào thần kinh t-hCO glutamatergic và các tế bào thần kinh vỏ não của thai nhi bị hạn chế hơn vào giữa thai kỳ (dữ liệu mở rộng, Hình 5e-j). Để xác định xem các tế bào thần kinh t-hCO có chức năng tương tự như các tế bào thần kinh vỏ não mới sau sinh của con người hay không, chúng tôi đã thực hiện các bản ghi điện sinh lý và tái tạo giải phẫu các tế bào thần kinh tháp L2/3 của con người trong các phần sắc nét của vỏ não sau sinh của con người (dữ liệu mở rộng, Hình 7a). Các đặc tính điện sinh lý của các tế bào thần kinh tháp L2/3 tương tự như các đặc tính của các tế bào thần kinh tháp t-hCO (dữ liệu mở rộng, Hình 7e). Về mặt hình thái, các tế bào thần kinh L2/3 từ các mẫu người sau sinh giống với t-hCO hơn là hCO, mặc dù các tế bào L2/3 dài hơn, chứa nhiều nhánh hơn nhìn chung và có mật độ gai cao hơn (Hình 3g và dữ liệu mở rộng, Hình 7b-). G).
a, cấy ghép hCO do dòng tế bào kiểm soát và tế bào hiPS TS tạo ra vào chuột sơ sinh. b, tái tạo 3D các tế bào thần kinh t-hCO chứa biocytin sau 8 tháng biệt hóa. c, định lượng chiều dài trung bình của nhánh cây (n = 19 tế bào thần kinh kiểm soát, n = 21 tế bào thần kinh TS; **P = 0,0041). d, Các nhánh dendrit được tái tạo 3D từ t-hCO đối chứng và TS sau 8 tháng biệt hóa và định lượng mật độ gai dendrit (n = 16 tế bào thần kinh đối chứng, n = 21 tế bào thần kinh TS, ***P < 0,0001). d, Các nhánh dendrit được tái tạo 3D từ t-hCO đối chứng và TS sau 8 tháng biệt hóa và định lượng mật độ gai dendrit (n = 16 tế bào thần kinh đối chứng, n = 21 tế bào thần kinh TS, ***P < 0,0001). d, 3D-реконструкция дендритных ветвей из контроля и TS t-hCO через 8 tháng дифференцировки и количественная оценка плотности дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, Tái tạo 3D các nhánh dendrit từ đối chứng và t-hCO TS sau 8 tháng biệt hóa và định lượng mật độ gai dendrit (n=16 tế bào thần kinh đối chứng, n=21 tế bào thần kinh TS, ***P<0,0001). d,分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支,以及树突棘密度的量化（n = 16个对照神经元,n = 21 个TS 神经元,***P < 0,0001)。 d , 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 密度 量化 （n = 16 个 神经元 , n = 21 个 ts 神经 , *** p <0,0001 )。 d, 3D-реконструкция дендритных ветвей контроля и TS t-hCO через 8 tháng 10 năm 2019 оценка плотности дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, Tái tạo 3D các nhánh dendrit kiểm soát và TS t-hCO sau 8 tháng biệt hóa và định lượng mật độ gai dendrit (n=16 tế bào thần kinh kiểm soát, n=21 tế bào thần kinh TS, ***P<0,0001).Dấu hoa thị màu đỏ biểu thị các gai dendrit giả định. e, EPSC tự phát trong các tế bào thần kinh kiểm soát và TS t-hCO sau 8 tháng biệt hóa. f, biểu đồ tần suất tích lũy và định lượng tần suất và biên độ của các sự kiện synap (n = 32 tế bào thần kinh kiểm soát, n = 26 tế bào thần kinh TS; **P = 0,0076 và P = 0,8102). g, Phân tích Scholl về tế bào thần kinh TS và tế bào thần kinh kiểm soát trong hCO và t-hCO. Các đường đứt nét cho thấy các tế bào thần kinh tháp L2/3 sau sinh của con người để so sánh (n = 24 tế bào thần kinh kiểm soát t-hCO, n = 21 tế bào thần kinh t-hCO TS, n = 8 tế bào thần kinh kiểm soát hCO và n = 7 tế bào thần kinh hCO TS). Dữ liệu được thể hiện dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn
Khả năng của t-hCO trong việc sao chép các đặc điểm hình thái và chức năng của tế bào thần kinh vỏ não người ở mức độ cao đã thúc đẩy chúng tôi khám phá liệu t-hCO có thể được sử dụng để phát hiện kiểu hình bệnh hay không. Chúng tôi tập trung vào TS, một rối loạn phát triển thần kinh nghiêm trọng do đột biến tăng chức năng trong gen mã hóa CaV1.2, khởi phát phiên mã gen phụ thuộc hoạt động trong tế bào thần kinh. Chúng tôi đã lấy hCO từ ba bệnh nhân TS mang đột biến thay thế phổ biến nhất (p.G406R) và ba đối chứng (Hình 3a). Sau khi cấy ghép, chúng tôi thấy rằng hình thái của nhánh cây thần kinh đã thay đổi ở các tế bào thần kinh TS so với đối chứng (Hình 3b và dữ liệu mở rộng, Hình 8a, b), với số lượng nhánh cây thần kinh chính tăng gấp đôi và chiều dài trung bình tăng lên và chiều dài nhánh cây thần kinh giảm đi (Hình 3c và dữ liệu mở rộng, Hình 8c). Điều này có liên quan đến mật độ gai tăng lên và tần suất EPSC tự phát tăng lên ở TS so với tế bào thần kinh đối chứng (Hình 3d–f và dữ liệu mở rộng, Hình 8g). Phân tích sâu hơn cho thấy các mô hình phân nhánh dendrit bất thường trong t-hCO TS so với đối chứng, nhưng không có trong TS hCO trong ống nghiệm ở giai đoạn phân hóa tương tự (Hình 3g). Điều này phù hợp với các báo cáo trước đây của chúng tôi về sự co lại của dendrit phụ thuộc vào hoạt động trong TS và làm nổi bật khả năng của nền tảng cấy ghép này trong việc phát hiện các kiểu hình bệnh trong cơ thể sống.
Sau đó, chúng tôi hỏi mức độ các tế bào t-hCO được tích hợp chức năng vào S1 của chuột. S1 ở loài gặm nhấm nhận được các đầu vào synap mạnh từ các nhân đồi thị bụng và sau cùng bên, cũng như các vỏ não vận động và cảm giác thân thể thứ cấp cùng bên, và S1 đối diện (Hình 4a). Để khôi phục lại kiểu chi phối thần kinh, chúng tôi đã lây nhiễm hCO bằng virus dại-dG-GFP/AAV-G và cấy ghép hCO vào chuột S1 sau 3 ngày. Chúng tôi quan sát thấy biểu hiện GFP dày đặc trong các tế bào thần kinh của S1 cùng bên và hạch nền bụng 7–14 ngày sau khi cấy ghép (Hình 4b, c). Ngoài ra, nhuộm kháng thể của dấu hiệu đồi thị netrin G1 cho thấy sự hiện diện của các đầu cuối đồi thị trong t-hCO (Hình 4d, e). Để đánh giá liệu các đường dẫn truyền hướng tâm này có thể gây ra phản ứng synap trong các tế bào t-hCO hay không, chúng tôi đã thực hiện ghi chép toàn bộ tế bào từ các tế bào người trong các phần sắc nét của lớp vỏ não đồi thị. Kích thích điện vào S1 của chuột, bao trong, chất trắng, các sợi gần t-hCO hoặc kích hoạt quang di truyền các đầu tận cùng đồi thị biểu hiện opsin trong các EPSC có độ trễ ngắn do t-hCO gây ra trong các tế bào thần kinh t-hCO tiếp xúc với chất đối kháng thụ thể AMPA NBQX. (Hình 4f, g và dữ liệu mở rộng, Hình 9a–g). Những dữ liệu này chứng minh rằng t-hCO được tích hợp về mặt giải phẫu vào não chuột và có thể được kích hoạt bởi mô vật chủ chuột.
a, Sơ đồ của một thí nghiệm theo dõi bệnh dại. b, Biểu hiện GFP và STEM121 đặc hiệu ở người giữa t-hCO và vỏ não chuột (bảng trên). Biểu hiện GFP ở nhân nền bụng cùng bên (VB) của chuột (phía dưới bên trái) và S1 cùng bên (phía dưới bên phải). Thanh tỷ lệ, 50 µm. Các ô vuông màu đỏ biểu thị các vùng não nơi hình ảnh được chụp. c, định lượng các tế bào biểu hiện GFP (n = 4 con chuột). d, e — Các đầu mút đồi thị Netrin G1+ trong t-hCO. d cho thấy mặt cắt ngang chứa nhân t-hCO và VB. Thanh tỷ lệ, 2 mm. e cho thấy biểu hiện Netrin G1 và STEM121 ở tế bào thần kinh t-hCO (trái) và VB (phải). Thanh tỷ lệ, 50 µm. Đường chấm màu cam chỉ ra ranh giới t-hCO. f, g, Dấu vết hiện tại của tế bào thần kinh t-hCO sau khi kích thích điện ở chuột S1 (f) hoặc bao trong (g), có (màu tím) hoặc không có (màu đen) NBQX (trái). Biên độ EPSC có và không có NBQX (n = 6 tế bào thần kinh S1, *P = 0,0119; và n = 6 tế bào thần kinh bao trong, **P = 0,0022) (giữa). Tỷ lệ tế bào thần kinh t-hCO biểu hiện EPSC đáp ứng với kích thích điện ở chuột S1 (f) hoặc bao trong (g) (phải). aCSF, dịch não tủy nhân tạo. h, sơ đồ thí nghiệm hình ảnh 2P (trái). Biểu hiện GCaMP6 trong t-hCO (giữa). Thanh tỷ lệ, 100 µm. Khoảng thời gian huỳnh quang của GCaMP6 (phải). i, Điểm Z của huỳnh quang hoạt động tự phát. j, minh họa sơ đồ về kích thích ria mép. k, quỹ đạo huỳnh quang 2P có điểm z trong một lần thử nghiệm, căn chỉnh với độ lệch của râu tại thời điểm không (đường đứt nét) trong các tế bào mẫu. l, phản ứng điểm z trung bình theo quần thể của tất cả các tế bào căn chỉnh với độ lệch của râu tại thời điểm không (đường đứt nét) (màu đỏ) hoặc dấu thời gian được tạo ngẫu nhiên (màu xám). m. Sơ đồ thí nghiệm về đánh dấu quang học. n, Đường cong điện áp thô từ một tế bào t-hCO mẫu trong quá trình kích thích bằng tia laser xanh hoặc độ lệch của râu. Mũi tên màu đỏ chỉ ra các xung đầu tiên do ánh sáng gây ra (phía trên) hoặc do độ lệch của râu gây ra (phía dưới). Phần tô màu xám chỉ ra các giai đoạn độ lệch của râu. o, Dạng sóng ánh sáng đỉnh và phản ứng độ lệch của râu. p, các xung của một lần thử duy nhất, căn chỉnh với độ lệch của râu trong các tế bào của ví dụ. 0 chỉ ra độ lệch của râu (đường đứt nét). q, tốc độ bắn điểm z trung bình theo quần thể đối với tất cả các tế bào nhạy sáng, căn chỉnh với độ lệch của râu tại thời điểm không (đường đứt nét) (màu đỏ) hoặc dấu thời gian được tạo ngẫu nhiên (màu xám). r, Tỷ lệ các đơn vị nhạy sáng được điều chỉnh đáng kể bởi độ lệch của râu (n = 3 con chuột) (trái). Độ trễ điểm số z đỉnh (n = 3 con chuột; n = 5 (xanh lục nhạt), n = 4 (xanh lục đậm) và n = 4 (xanh lam) đơn vị điều chỉnh độ lệch của râu trên mỗi con chuột) (phải). Dữ liệu được thể hiện dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn
Sau đó, chúng tôi hỏi liệu t-hCO có thể được kích hoạt bởi các kích thích cảm giác trong cơ thể sống hay không. Chúng tôi đã cấy ghép hCO biểu hiện các chỉ số canxi được mã hóa di truyền GCaMP6 vào chuột S1. Sau 150 ngày, chúng tôi đã thực hiện phép đo quang sợi hoặc hình ảnh canxi hai photon (Hình 4h và dữ liệu mở rộng, Hình 10a). Chúng tôi thấy rằng các tế bào t-hCO biểu hiện hoạt động nhịp nhàng đồng bộ (Hình 4i, Dữ liệu mở rộng, Hình 10b và Video bổ sung 1). Để mô tả hoạt động đỉnh của t-hCO, chúng tôi đã thực hiện các bản ghi điện sinh lý ngoại bào ở những con chuột ghép được gây mê (dữ liệu mở rộng, Hình 10c-f). Chúng tôi đã tạo ra các tọa độ định vị từ hình ảnh MRI; do đó, các đơn vị được ghi lại này đại diện cho các tế bào thần kinh người được cho là, mặc dù riêng điện sinh lý không cho phép xác định loài xuất xứ. Chúng tôi đã quan sát thấy các đợt hoạt động đồng bộ (dữ liệu mở rộng, Hình 10d). Các đợt bùng phát kéo dài khoảng 460 ms và được ngăn cách bởi các khoảng thời gian im lặng khoảng 2 giây (dữ liệu mở rộng, Hình 10d, e). Các đơn vị riêng lẻ bắn trung bình khoảng ba vòng cho mỗi đợt bùng phát, chiếm khoảng 73% số đơn vị đã đăng ký cho mỗi đợt bùng phát. Các hoạt động của các đơn vị riêng lẻ có mối tương quan cao và các mối tương quan này cao hơn so với các đơn vị được xác định ở những con vật chưa tiêm vắc-xin được ghi lại trong cùng điều kiện (dữ liệu mở rộng, Hình 10f). Để mô tả thêm các phản ứng đột biến của các tế bào thần kinh có nguồn gốc từ người đã xác định, chúng tôi đã tiến hành các thí nghiệm gắn thẻ ánh sáng trên những con chuột được gây mê được cấy ghép hCO biểu hiện kênh cation nhạy sáng rhodopsin 2 (hChR2), qua đó các tế bào thần kinh t-hCO nhận dạng độ trễ ngắn (dưới 10 ms) để đáp ứng với các kích thích ánh sáng xanh (Hình 4m–o). Các tế bào thần kinh t-hCO biểu hiện các đợt hoạt động tự phát ở tần số tương tự như tần số quan sát được trong hình ảnh canxi, cũng như các bản ghi điện sinh lý được thực hiện trong t-hCO khi không có đánh dấu ánh sáng (dữ liệu mở rộng, Hình 10c-g). Không quan sát thấy hoạt động tự phát nào trong các giai đoạn tương ứng của hCO được ghi lại trong ống nghiệm. Để đánh giá xem t-hCO có thể được kích hoạt bởi các kích thích cảm giác hay không, chúng tôi đã làm lệch ria mép của chuột ra khỏi t-hCO trong thời gian ngắn (Hình 4j, m và dữ liệu mở rộng, Hình 10h, k). Theo các nghiên cứu trước đây8,10, một tập hợp con các tế bào t-hCO cho thấy hoạt động tăng lên để đáp ứng với sự lệch ria mép, điều này không được quan sát thấy khi dữ liệu được so sánh với các dấu thời gian ngẫu nhiên (Hình 4k–q và dữ liệu mở rộng, Hình 10h–q). Thật vậy, khoảng 54% các đơn vị đơn lẻ được gắn nhãn quang cho thấy tỷ lệ kích thích tăng đáng kể sau khi kích thích ria mép, đạt đỉnh ở khoảng 650 ms (Hình 4r). Tổng hợp lại, những dữ liệu này cho thấy t-hCO nhận được các đầu vào chức năng thích hợp và có thể được kích hoạt bởi các kích thích từ môi trường.
Sau đó, chúng tôi nghiên cứu xem liệu t-hCO có thể kích hoạt các mạch ở chuột để kiểm soát hành vi hay không. Đầu tiên, chúng tôi nghiên cứu xem các sợi trục của tế bào thần kinh t-hCO có chiếu vào các mô xung quanh của chuột hay không. Chúng tôi đã lây nhiễm hCO bằng một loại lentivirus mã hóa hChR2 hợp nhất với EYFP (hChR2-EYFP). Sau 110 ngày, chúng tôi quan sát thấy biểu hiện EYFP ở các vùng vỏ não cùng bên, bao gồm vỏ não thính giác, vận động và cảm giác somatosensory, cũng như ở các vùng dưới vỏ não, bao gồm thể vân, hồi hải mã và đồi thị (Hình 5a). Để đánh giá xem các đường chiếu hướng ra này có thể gây ra phản ứng synap ở tế bào chuột hay không, chúng tôi đã kích hoạt quang học các tế bào t-hCO biểu hiện hChR2-EYFP bằng cách ghi lại các tế bào vỏ não chuột trong các lát cắt não sắc nét. Kích hoạt các sợi trục t-hCO bằng ánh sáng xanh đã tạo ra các EPSC có độ trễ ngắn trong các tế bào thần kinh vỏ não hình chóp của chuột, bị chặn bởi NBQX (Hình 5b–g). Ngoài ra, những phản ứng này có thể bị tetrodotoxin (TTX) chặn lại và được phục hồi bởi 4-aminopyridine (4-AP), cho thấy rằng chúng được gây ra bởi các kết nối đơn synap (Hình 5e).
a, Sơ đồ theo dõi sợi trục (trái). Biểu hiện t-hCO EYFP (phải). Thanh tỷ lệ, 100 µm. A1, vỏ não thính giác, ACC, vỏ não vành trước, d. thể vân, thể vân lưng, HPC, hồi hải mã; Cơ hoành, vách ngăn bên, mPFC, vỏ não trước trán giữa, piri, vỏ não hình lê, v. thể vân, thể vân bụng, VPM, nhân ventropostmedial của đồi thị, VTA, vùng tegmental bụng. Các ô vuông màu đỏ biểu thị các vùng não nơi chụp ảnh. b, Sơ đồ thí nghiệm kích thích. c, d, Ví dụ về phản ứng của dòng điện quang do ánh sáng xanh gây ra (trên cùng) và điện áp (dưới cùng) ở người (c) EYFP+ t-hCO hoặc chuột (d) tế bào EYFP-. e, f, Dấu vết hiện tại của tế bào thần kinh chuột sau khi kích thích ánh sáng xanh của sợi trục t-hCO bằng TTX và 4-AR (xanh lá cây), TTX (xám) hoặc aCSF (đen) (e), có (tím) hoặc không có (đen) ) ) NBQX (e). g, độ trễ của phản ứng do ánh sáng xanh gây ra trong tế bào chuột (n = 16 tế bào); các thanh ngang biểu thị độ trễ trung bình (7,13 ms) (trái). Biên độ của EPSC kích thích ánh sáng được ghi lại có hoặc không có NBQX (n = 7 tế bào; ***P < 0,0001) (giữa). Biên độ của EPSC kích thích ánh sáng được ghi lại có hoặc không có NBQX (n = 7 tế bào; ***P < 0,0001) (giữa). Nếu bạn sử dụng EPSC, bạn có thể sử dụng nó hoặc NBQX (n = 7 điểm; ***P <0,0001) (в центре). Biên độ của EPSC cảm ứng ánh sáng được ghi lại có hoặc không có NBQX (n = 7 tế bào; ***P < 0,0001) (ở giữa).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001)（中）。使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001)（中）。 Nếu bạn sử dụng EPSC, bạn có thể sử dụng nó hoặc NBQX (n = 7 điểm; ***P <0,0001) (в центре). Biên độ của EPSC cảm ứng ánh sáng được ghi lại có hoặc không có NBQX (n = 7 tế bào; ***P < 0,0001) (ở giữa).Tỷ lệ tế bào chuột biểu hiện EPSC phản ứng với ánh sáng xanh (phải). h, Sơ đồ của nhiệm vụ hành vi. d0, ngày 0. i. Hiệu suất của động vật mẫu vào ngày 1 (trái) hoặc ngày 15 (phải) của quá trình đào tạo. Số lần liếm trung bình được thực hiện vào ngày 1 (bên trái) hoặc ngày 15 (bên phải, giữa) (n = 150 lần thử ánh sáng xanh, n = 150 lần thử ánh sáng đỏ; ***P < 0,0001). Số lần liếm trung bình được thực hiện vào ngày 1 (bên trái) hoặc ngày 15 (bên phải, giữa) (n = 150 lần thử ánh sáng xanh, n = 150 lần thử ánh sáng đỏ; ***P < 0,0001). Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) hoặc день 15 (в центре справа) (n = 150 испытаний с синим светом, n = 150 испытаний с красным светом; ***P <0,0001). Số lần liếm trung bình được thực hiện vào ngày 1 (bên trái) hoặc ngày 15 (giữa bên phải) (n = 150 lần thử ánh sáng xanh, n = 150 lần thử ánh sáng đỏ; ***P < 0,0001).第1 天（左)或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验,n = 150 次红光试验；***P < 0,0001)。第1 天（左)或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验,n = 150 次红光试验；***P < 0,001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) hoặc день 15 (в центре справа) (n = 150 испытаний с синим светом, n = 150 испытаний с красным светом; ***P <0,0001). Số lần liếm trung bình được thực hiện vào ngày 1 (bên trái) hoặc ngày 15 (giữa bên phải) (n = 150 lần thử ánh sáng xanh, n = 150 lần thử ánh sáng đỏ; ***P < 0,0001).Liếm tích lũy cho các thử nghiệm ánh sáng đỏ và xanh vào ngày 1 (giữa bên trái) hoặc ngày 15 (bên phải). NS, không đáng kể. j,k, Đặc điểm hành vi của tất cả các động vật được cấy ghép với t-hCO biểu hiện hChR2-EYFP (j) hoặc huỳnh quang đối chứng (k) vào ngày 1 hoặc ngày 15 (hChR2-EYFP: n = 9 con chuột, ** P = 0,0049; đối chứng: n = 9, P = 0,1497). l, Sự tiến triển của điểm ưu tiên (n = 9 hChR2, n = 9 đối chứng; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Sự tiến triển của điểm ưu tiên (n = 9 hChR2, n = 9 đối chứng; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Sự tiến triển của điểm ưu tiên (n = 9 hChR2, n = 9 đối chứng; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l,偏好评分的演变（n = 9 hChR2,n = 9 对照；**P < 0,001,***P < 0,0001)。 l,偏好评分的演变（n = 9 hChR2,n = 9 对照；**P < 0,001,***P < 0,0001)。 l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Sự tiến triển của điểm số ưu tiên (n = 9 hChR2, n = 9 đối chứng; **P < 0,001, ***P < 0,0001).m, biểu hiện FOS đáp ứng với hoạt hóa quang di truyền của t-hCO ở S1. Hình ảnh biểu hiện FOS (trái) và định lượng (n = 3 cho mỗi nhóm; *P < 0,05, **P < 0,01 và ***P < 0,001) (phải) được hiển thị. Hình ảnh biểu hiện FOS (trái) và định lượng (n = 3 cho mỗi nhóm; *P < 0,05, **P < 0,01 và ***P < 0,001) (phải) được hiển thị. Показаны изображения экспрессии FOS (слева) và количественного определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001) (справа). Hình ảnh biểu hiện FOS (trái) và định lượng (n = 3 cho mỗi nhóm; *P < 0,05, **P < 0,01 và ***P < 0,001) được hiển thị (phải).显示了FOS 表达（左)和量化（每组n = 3；*P < 0,05、**P < 0,01 和***P < 0,001）（右)的图像。显示了FOS 表达（左)和量化（每组n = 3；*P < 0,05、**P < 0,01 和***P < 0,001）（右)的图像。 Показаны изображения экспрессии FOS (слева) và количественного определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001) (справа). Hình ảnh biểu hiện FOS (trái) và định lượng (n = 3 cho mỗi nhóm; *P < 0,05, **P < 0,01 và ***P < 0,001) được hiển thị (phải).Thanh tỷ lệ, 100 µm. Dữ liệu được thể hiện dưới dạng trung bình ± sai số chuẩn của BLA, amidan đáy bên, MDT, nhân đồi thị lưng trong, PAG, chất xám quanh cống não.
Cuối cùng, chúng tôi hỏi liệu t-hCO có thể điều chỉnh hành vi của chuột hay không. Để kiểm tra điều này, chúng tôi đã cấy hCO biểu hiện hChR2-EYFP vào S1 và 90 ngày sau, chúng tôi cấy các sợi quang vào t-hCO để truyền ánh sáng. Sau đó, chúng tôi huấn luyện những con chuột bằng một mô hình điều hòa tác động đã được sửa đổi (Hình 5h). Chúng tôi đặt những con vật vào một buồng thử nghiệm hành vi và áp dụng ngẫu nhiên các kích thích laser màu xanh lam (473 nm) và đỏ (635 nm) trong 5 giây. Những con vật nhận được phần thưởng là nước nếu chúng liếm trong khi kích thích bằng ánh sáng xanh lam nhưng không liếm trong khi kích thích bằng ánh sáng đỏ. Vào ngày đầu tiên của quá trình huấn luyện, những con vật không biểu hiện sự khác biệt trong việc liếm khi được kích thích bằng ánh sáng xanh lam hoặc đỏ. Tuy nhiên, vào ngày thứ 15, những con vật được cấy hCO biểu hiện hChR2-EYFP cho thấy hành vi liếm tích cực hơn khi được kích thích bằng ánh sáng xanh lam so với kích thích bằng ánh sáng đỏ. Những thay đổi trong hành vi liếm này không được quan sát thấy ở động vật đối chứng được cấy ghép với hCO biểu hiện huỳnh quang đối chứng (tỷ lệ thành công trong học tập: hChR2 89%, EYFP 0%, Hình 5i-1 và Video bổ sung 2). Những dữ liệu này cho thấy rằng các tế bào t-hCO có thể kích hoạt các tế bào thần kinh ở chuột để kích thích hành vi tìm kiếm phần thưởng. Để tìm ra mạch thần kinh t-hCO nào ở chuột có thể tham gia vào những thay đổi về hành vi này, chúng tôi đã kích hoạt t-hCO bằng phương pháp quang di truyền ở những động vật được huấn luyện và thu thập các mô sau đó 90 phút. Miễn dịch mô hóa học cho thấy biểu hiện của protein FOS phụ thuộc vào hoạt động ở một số vùng não liên quan đến hành vi có động cơ, bao gồm vỏ não trước trán giữa, đồi thị giữa và chất xám quanh cống não, được biểu hiện ở động vật đối chứng không được kích thích hoặc ở động vật. gạo. 5m). Xét về tổng thể, những dữ liệu này cho thấy rằng t-hCO có thể điều chỉnh hoạt động của tế bào thần kinh ở chuột để thúc đẩy hành vi.
Các cơ quan thần kinh đại diện cho một hệ thống đầy hứa hẹn để nghiên cứu sự phát triển và bệnh tật của con người trong ống nghiệm, nhưng chúng bị hạn chế bởi sự thiếu kết nối giữa các mạch tồn tại trong cơ thể sống. Chúng tôi đã phát triển một nền tảng mới trong đó chúng tôi cấy ghép hCO vào S1 của những con chuột sau sinh bị suy giảm miễn dịch để nghiên cứu sự phát triển và chức năng của tế bào người trong cơ thể sống. Chúng tôi đã chỉ ra rằng t-hCO phát triển các loại tế bào trưởng thành không được quan sát thấy trong ống nghiệm28 và t-hCO được tích hợp về mặt giải phẫu và chức năng vào não loài gặm nhấm. Việc tích hợp t-hCO vào các mạch thần kinh của loài gặm nhấm cho phép chúng tôi thiết lập mối liên hệ giữa hoạt động của tế bào người và hành vi của động vật được nghiên cứu, cho thấy rằng các tế bào thần kinh t-hCO có thể điều chỉnh hoạt động của tế bào thần kinh chuột để thúc đẩy các phản ứng hành vi.
Nền tảng mà chúng tôi mô tả có một số ưu điểm so với nghiên cứu trước đây về việc cấy ghép tế bào người vào não loài gặm nhấm. Đầu tiên, chúng tôi cấy ghép hCO vào vỏ não đang phát triển của những con chuột sau sinh giai đoạn đầu, điều này có thể tạo điều kiện cho sự tích hợp về mặt giải phẫu và chức năng. Thứ hai, việc theo dõi MRI t-hCO cho phép chúng tôi nghiên cứu vị trí ghép và sự phát triển ở động vật sống, cho phép chúng tôi tiến hành các nghiên cứu dài hạn trên nhiều động vật và thiết lập độ tin cậy của một số dòng tế bào hiPS. Cuối cùng, chúng tôi cấy ghép các cơ quan nguyên vẹn, thay vì các huyền phù tế bào đơn lẻ bị cô lập, ít gây hại cho tế bào người hơn và có thể thúc đẩy sự tích hợp và tạo ra các tế bào thần kinh vỏ não người trong não chuột.
Chúng tôi thừa nhận rằng mặc dù có những tiến bộ trong nền tảng này, các hạn chế về thời gian, không gian và giữa các loài vẫn ngăn cản sự hình thành các mạch thần kinh của con người với độ trung thực cao, ngay cả sau khi cấy ghép ở giai đoạn đầu phát triển. Ví dụ, không rõ liệu hoạt động tự phát được quan sát thấy trong t-hCO có biểu thị kiểu hình phát triển tương tự như hoạt động nhịp nhàng được quan sát thấy trong quá trình phát triển vỏ não hay không, hay liệu nó có phải do sự vắng mặt của các loại tế bào ức chế có trong t-hCO. Tương tự như vậy, không rõ mức độ thiếu phân lớp trong t-hCO ảnh hưởng đến kết nối chuỗi30 như thế nào. Các công trình trong tương lai sẽ tập trung vào việc tích hợp các loại tế bào khác như tế bào vi giao ở người, tế bào nội mô ở người và các tỷ lệ khác nhau của các tế bào thần kinh đệm GABAergic như được thể hiện bằng cách sử dụng lắp ráp 6 trong ống nghiệm, cũng như tìm hiểu cách tích hợp và xử lý thần kinh có thể xảy ra ở mức độ phiên mã, synap và hành vi của t-hCO bị thay đổi trong các tế bào lấy từ bệnh nhân.
Nhìn chung, nền tảng in vivo này đại diện cho một nguồn tài nguyên mạnh mẽ có thể bổ sung cho quá trình phát triển não người và nghiên cứu bệnh tật trong ống nghiệm. Chúng tôi dự đoán rằng nền tảng này sẽ cho phép chúng tôi khám phá ra các kiểu hình cấp độ sợi mới trong các tế bào có nguồn gốc từ bệnh nhân vốn khó nắm bắt và thử nghiệm các chiến lược điều trị mới.
Chúng tôi tạo ra hCO2.5 từ các tế bào HiPS như đã mô tả trước đây. Để bắt đầu sản xuất hCO từ các tế bào hiPS được nuôi cấy trên các lớp nuôi cấy, các khuẩn lạc nguyên vẹn của tế bào hiPS được lấy ra khỏi đĩa nuôi cấy bằng cách sử dụng dispase (0,35 mg/mL) và chuyển sang các nuôi cấy bằng nhựa có độ bám dính cực thấp chứa các đĩa có môi trường nuôi cấy tế bào hiPS. (Corning) bổ sung hai chất ức chế SMAD là dorsomorphine (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) và SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) và chất ức chế ROCK Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Trong 5 ngày đầu tiên, môi trường tế bào hiPS được thay đổi hàng ngày và dorsomorphine và SB-431542 được thêm vào. Vào ngày thứ sáu trong hệ thống treo, các khối cầu thần kinh được chuyển vào môi trường thần kinh có chứa neurobasal-A (10888, Life Technologies), chất bổ sung B-27 không có vitamin A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicillin và streptomycin (1:100, Life Technologies) và bổ sung yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGF; 20 ng ml−1; Hệ thống R&D) và yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi 2 (FGF2; 20 ng ml−1; Hệ thống R&D) cho đến ngày 24. Từ ngày 25 đến ngày 42, môi trường được bổ sung yếu tố dinh dưỡng thần kinh có nguồn gốc từ não (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) và neurotrophin 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) với môi trường thay đổi sau mỗi ngày. Vào ngày thứ sáu trong hệ thống treo, các khối cầu thần kinh được chuyển vào môi trường thần kinh có chứa neurobasal-A (10888, Life Technologies), chất bổ sung B-27 không có vitamin A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicillin và streptomycin (1:100, Life Technologies) và bổ sung yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGF; 20 ng ml−1; Hệ thống R&D) và yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi 2 (FGF2; 20 ng ml−1; Hệ thống R&D) cho đến ngày 24. Từ ngày 25 đến ngày 42, môi trường được bổ sung yếu tố dinh dưỡng thần kinh có nguồn gốc từ não (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) và neurotrophin 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) với môi trường thay đổi sau mỗi ngày.Vào ngày thứ sáu trong trạng thái huyền phù, các khối cầu thần kinh được chuyển sang môi trường thần kinh có chứa Neurobasal-A (10888, Life Technologies), chất bổ sung B-27 không có vitamin A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicillin.và стрептомицин (1:100, Life Technologies) và дополнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) và фактором роста фибробластов 2 (FGF2; 20 xu/mл; Hệ thống R&D) đến 24 tháng sau. và streptomycin (1:100, Life Technologies) và bổ sung thêm yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGF; 20 ng/ml; Hệ thống R&D) và yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi 2 (FGF2; 20 ng/ml; Hệ thống R&D) cho đến ngày 24.Từ ngày 25 đến ngày 42, yếu tố dinh dưỡng thần kinh có nguồn gốc từ não (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) và neurotrophin 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) được thêm vào môi trường, thay đổi môi trường hai ngày một lần.在悬浮的第6 天,将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888,Life Technologies),不含维生素A 的B-27 补充剂（12587,Life Công nghệ), GlutaMax（1:100,Công nghệ cuộc sống),青霉素的神经培养基中和链霉素（1:100,Life Công nghệ) Công nghệ mới nhất (EGF；20 ng ml-1；Hệ thống R&D) Hệ thống R&D天。在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 Neurobasal-a （10888 , Life Technologies) 不 含 维生素 a 的 b-27补充剂 （12587 , Life Technologies) Glutamax （1: 100 , Life TechNOGIS青霉素 的 神经 培养 基 中 链霉素 （（1: 100 , Life Technologies） 表皮 生长 因子 （（（20 ng ml-1 ； r & d Systems） 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 ng ml- 1；R&D Systems)直至第24天。 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейробазал-А (10888, Life Technologies), добавку В-27 без витамина А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин- нейтрализованный стрептомицин (1:100, Life Technologies) với добавлением эпидермального фактора роста (EGF; 20 нг мл-1; Hệ thống R&D) và фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг мл-1) 1; Vào ngày thứ 6, hỗn dịch neurosphere được chuyển sang chất bổ sung có chứa neurobasal-A (10888, Life Technologies), chất bổ sung B-27 không có vitamin A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), streptomycin trung hòa penicillin (1:100, Life Technologies) bổ sung yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGF; 20 ng ml-1; Hệ thống R&D) và yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1; Hệ thống R&D) đến ngày 24 tháng 12. Hệ thống R&D) cho đến ngày 24.Từ ngày 25 đến ngày 42, yếu tố dinh dưỡng thần kinh có nguồn gốc từ não (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) và yếu tố dinh dưỡng thần kinh 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) được thêm vào môi trường nuôi cấy cách ngày. Môi trường thay đổi một lần.Bắt đầu từ ngày thứ 43, hCO được duy trì trong môi trường neurobasal-A không bổ sung (NM; 1088022, Thermo Fisher) với môi trường thay đổi sau mỗi 4–6 ngày. Để thu được hCO từ các tế bào hiPS được nuôi cấy trong điều kiện không có chất nuôi cấy, các tế bào hiPS được ủ với Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) ở 37°C trong 7 phút, phân tách thành các tế bào đơn lẻ và được mạ trên các đĩa AggreWell 800 (34815, STEMCELL Technologies) với mật độ 3 × 106 tế bào đơn lẻ trên mỗi giếng trong môi trường Essential 8 bổ sung chất ức chế ROCK Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Sau 24 giờ, môi trường trong các giếng được hút lên và xuống vào môi trường chứa môi trường Essential 6 (A1516401, Life Technologies) bổ sung dorsomorphine (2,5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) và SB-431542 (10 μM; 1614). , Tocrida). Từ ngày 2 đến ngày 6, môi trường Essential 6 được thay thế hàng ngày bằng dorsomorphine và bổ sung SB-431542. Từ ngày thứ sáu, huyền phù cầu thần kinh được chuyển vào môi trường nền thần kinh và duy trì như mô tả ở trên.
Tất cả các quy trình trên động vật đều được thực hiện theo hướng dẫn chăm sóc động vật do Ủy ban quản lý chăm sóc động vật của Phòng thí nghiệm Đại học Stanford (APLAC) phê duyệt. Chuột RNU euthymic (rnu/+) mang thai được mua (Phòng thí nghiệm Charles River) hoặc nuôi nhốt. Động vật được nuôi theo chu kỳ sáng-tối 12 giờ với thức ăn và nước uống tùy ý. Chuột con khỏa thân (FOXN1–/–) từ ba đến bảy ngày tuổi được xác định bằng cách phát triển ria mép chưa trưởng thành trước khi tiêu hủy. Chó con (đực và cái) được gây mê bằng 2-3% isoflurane và được đặt trên khung định vị lập thể. Tiến hành khoan sọ với đường kính khoảng 2-3 mm phía trên S1 trong khi vẫn duy trì tính toàn vẹn của màng cứng. Sau đó, sử dụng kim 30-G (khoảng 0,3 mm) ngay bên ngoài vết rạch sọ để đâm thủng màng cứng. Sau đó, bôi HCO3 vào một màng parafilm mỏng 3×3 cm và loại bỏ phần môi trường thừa. Sử dụng ống tiêm Hamilton gắn vào kim 23 G, 45°, nhẹ nhàng hút hCO vào đầu xa nhất của kim. Sau đó lắp ống tiêm vào bơm tiêm được kết nối với thiết bị định vị lập thể. Sau đó, đặt đầu kim vào lỗ thủng rộng 0,3 mm đã tạo trước đó trên màng cứng (z = 0 mm) và thu hẹp ống tiêm 1–2 mm (z = khoảng –1,5 mm) cho đến khi kim nằm giữa màng cứng A. một lớp niêm phong dày đặc được hình thành. Sau đó, nâng ống tiêm lên giữa bề mặt vỏ não ở z = -0,5 mm và tiêm hCO với tốc độ 1-2 µl mỗi phút. Sau khi hoàn tất việc tiêm hCO, kim được rút ra với tốc độ 0,2-0,5 mm mỗi phút, da được khâu lại và chó con được đặt ngay lên miếng đệm sưởi ấm cho đến khi hồi phục hoàn toàn. Một số con vật đã được ghép cả hai bên.
Tất cả các quy trình trên động vật đều được thực hiện theo hướng dẫn chăm sóc động vật được APLAC của Đại học Stanford chấp thuận. Chuột (hơn 60 ngày sau khi cấy ghép) được gây mê bằng 5% isoflurane và gây mê bằng 1-3% isoflurane trong quá trình chụp ảnh. Để trực quan hóa, máy quét lỗ khoan ngang được che chắn chủ động 7 Tesla Bruker (Bruker Corp.) với ổ đĩa gradient của International Electric Company (IECO), một miếng chèn gradient được che chắn có đường kính bên trong là 120 mm (600 mT/m, 1000 T/m/s) đã được sử dụng bằng cách sử dụng AVANCE. III, khả năng RF đa cuộn tám kênh và đa lõi, và nền tảng Paravision 6.0.1 đi kèm. Việc ghi được thực hiện bằng cách sử dụng cuộn RF thể tích tách rời chủ động có đường kính bên trong là 86 mm và cuộn RF làm mát bằng nhiệt độ thấp bốn kênh chỉ để thu. Axial 2D Turbo-RARE (thời gian lặp lại = 2500 ms, thời gian phản hồi = 33 ms, 2 lần trung bình) với 16 lần chụp lát cắt, độ dày lát cắt 0,6–0,8 mm, chứa 256 × 256 mẫu. Các tín hiệu được nhận bằng cuộn RF thể tích thu phát vuông góc có đường kính trong là 2 cm (Rapid MR International, LLC). Cuối cùng, sử dụng các hàm ước tính bề mặt Imaris (BitPlane) tích hợp để kết xuất 3D và phân tích thể tích. Một ca ghép thành công được định nghĩa là ca ghép mà trong đó các vùng tín hiệu MRI có trọng số T2 liên tục được hình thành ở bán cầu được ghép. Sự đào thải ghép được định nghĩa là một ca ghép không tạo ra các vùng tín hiệu MRI có trọng số T2 liên tục ở bán cầu được ghép. T-hCO dưới vỏ não bị loại khỏi các phân tích tiếp theo.
Để biểu hiện ổn định GCaMP6 trong hCO cho hình ảnh canxi hai photon, các tế bào hiPS đã bị nhiễm pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro sau đó chọn kháng sinh. Tóm lại, các tế bào được phân tách bằng EDTA và huyền phù trong 1 ml môi trường Essential 8 với mật độ khoảng 300.000 tế bào khi có polybrene (5 μg/ml) và 15 μl virus. Sau đó, các tế bào được ủ trong huyền phù trong 60 phút và gieo hạt với mật độ 50.000 tế bào trên mỗi giếng. Sau khi hợp lưu, các tế bào được xử lý bằng 5-10 μg ml-1 puromycin trong 5-10 ngày hoặc cho đến khi các khuẩn lạc ổn định xuất hiện. Nhiễm hCO cấp tính được thực hiện như đã mô tả trước đây5 với một số sửa đổi. Tóm lại, chuyển hCO ngày 30-45 vào các ống ly tâm siêu nhỏ Eppendorf 1,5 ml chứa 100 µl môi trường thần kinh. Sau đó, lấy ra khoảng 90 µl môi trường, thêm 3-6 µl lentivirus có nồng độ cao (từ 0,5 x 108 đến 1,2 x 109) vào ống và chuyển hCO vào tủ ấm trong 30 phút. Sau đó, thêm 90–100 µl môi trường vào mỗi ống và để lại các ống vào tủ ấm qua đêm. Ngày hôm sau, chuyển hCO vào môi trường nuôi cấy thần kinh mới trong các đĩa có độ bám dính thấp. Sau 7 ngày, chuyển hCO vào các đĩa đáy thủy tinh 24 giếng để quan sát và đánh giá chất lượng nhiễm trùng. VectorBuilder tạo ra pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE và pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE. Lentivirus được sử dụng trong hầu hết các thí nghiệm vì nó được tích hợp vào bộ gen vật chủ, cho phép biểu hiện gen báo cáo trong các dòng tế bào bị nhiễm. Để theo dõi bệnh dại, ngày 30-45 hCO được đồng nhiễm với rabies-ΔG-eGFP và AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (plasmid #67528, Addgene), rửa sạch trong 3 ngày và cấy ghép vào chuột ở S1 và duy trì in vivo trong 7-14 ngày.
Đối với miễn dịch mô học, động vật được gây mê và tưới máu xuyên tim bằng PBS sau đó là 4% paraformaldehyde (PFA trong PBS; Khoa học kính hiển vi điện tử). Não được cố định trong 4% PFA trong 2 giờ hoặc qua đêm ở 4°C, bảo quản đông lạnh trong 30% sucrose trong PBS trong 48-72 giờ và nhúng trong 1: 1, 30% sucrose: OCT (Hợp chất Tissue-Tek OCT 4583, Sakura Finetek) và các lát cắt vành đai được thực hiện ở 30 µm bằng máy đông lạnh (Leica). Đối với miễn dịch mô học của các lát cắt dày, động vật được tưới máu bằng PBS và não được mổ xẻ và cắt lát vành đai ở 300–400 µm bằng máy rung (Leica) và các lát cắt được cố định bằng 4% PFA trong 30 phút. Sau đó, các lát cắt đông lạnh hoặc lát dày được rửa bằng PBS, chặn trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng (10% huyết thanh lừa bình thường (NDS) và 0,3% Triton X-100 pha loãng trong PBS) và chặn bằng dung dịch chặn ở 4°C. – Ủ Các lát cắt đông lạnh được ủ qua đêm và các lát dày được ủ trong 5 ngày. Các kháng thể chính được sử dụng là: anti-NeuN (chuột, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (chuột cống, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (thỏ, 1:1.000; Z0334, Dako), anti-GFP (gà, 1:1.000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (chuột, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (thỏ, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (thỏ, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (thỏ, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (chuột, 1:50; ab9774, abcam), kháng SCG2 (thỏ, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), kháng SOX9 (dê, 1:500; AF3075, Hệ thống R&D), Netrin G1a (dê, 1:100; AF1166, Hệ thống R&D), kháng STEM121 (chuột, 1:200; Y40410, Takara Bio), kháng SATB2 (chuột, 1:50; ab51502, abcam), kháng GAD65/67 (thỏ, 1:400; ABN904, Millipore) và kháng IBA1 (dê, 1:100; ab5076, abcam). Các kháng thể chính được sử dụng là: anti-NeuN (chuột, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (chuột cống, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (thỏ, 1:1.000; Z0334, Dako), anti-GFP (gà, 1:1.000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (chuột, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (thỏ, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (thỏ, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (thỏ, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (chuột, 1:50; ab9774, abcam), kháng SCG2 (thỏ, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), kháng SOX9 (dê, 1:500; AF3075, Hệ thống R&D), Netrin G1a (dê, 1:100; AF1166, Hệ thống R&D), kháng STEM121 (chuột, 1:200; Y40410, Takara Bio), kháng SATB2 (chuột, 1:50; ab51502, abcam), kháng GAD65/67 (thỏ, 1:400; ABN904, Millipore) và kháng IBA1 (dê, 1:100; ab5076, abcam). Использовались следующие первичные антитела: анти-NuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (крысиные, 1:300; ab18465, abcam), анти-GFAP (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), анти- -GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мышь, 1:200; ab191181, abcam), анти-NeuN (кролик, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кролик, 1:200; sc-338, Санта-Круз), анти-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, Kháng thể Atlas), анти-RECA-1 (мышь, 1:50; ab9774, abcam), анти-SCG2 (кролик , 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (козий, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a (козий, 1:100; AF1166, Hệ thống R&D), анти-STEM121 (мышиный , 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) và анти-IBA1 (коза, 1 :100; аб5076, абкам). Các kháng thể chính được sử dụng là: anti-NeuN (chuột, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (chuột cống, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (thỏ, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP (gà, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (chuột, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (thỏ, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (thỏ, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (thỏ, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (chuột, 1:50; ab9774, abcam), kháng SCG2 (thỏ, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), kháng SOX9 (dê, 1:500; AF3075, Hệ thống R&D), netrin G1a (dê, 1:100; AF1166, Hệ thống R&D), kháng STEM121 (chuột, 1:200; Y40410, Takara Bio), kháng SATB2 (chuột, 1:50; ab51502, abcam), kháng GAD65/67 (thỏ, 1:400; ABN904, Millipore) và kháng IBA1 (dê, 1:100; ab5076, abkam).使用的一抗是:抗NeuN（小鼠,1:500；ab104224,abcam)抗CTIP2（大鼠,1:3 00；ab18465,abcam),抗GFAP（兔,1:1,000；Z0334,Dako,抗-GF P(鸡,1:1,000；GTX13970,GeneTex),抗HNA（小鼠,1:200；ab191181,abcam),抗NeuN（兔,1:500；ABN78,Millipore,抗PDGFRA（兔, , 1:100；20357-1-AP,Proteintech),抗SOX9（山羊,1:500；AF3075,Hệ thống R&D),Netrin G1a(山羊,1:100；AF1166,Hệ thống R&D),抗STEM121（小鼠, 1:200;使用的一抗是:抗NeuN(小鼠,1:500；ab104224,abcam)抗CTIP2（大鼠,1 :300；ab18465,abcam),抗GFAP（兔,1:1,000；Z0334,Dako,抗-GFP（鸡,1:1,000；GTX13970,GeneTex,抗HNA（小鼠,1:200；ab191181,abcam,抗NeuN（兔,1:500；ABN78,Millipore％弔,抗1: 200；sc-338,Santa Cruz,抗PPP1R17（兔,1:200；HPA047819,Atlas 抗体）,抗RECA-1（小鼠,1:50；ab9774,abcam),抗SCG2 100；20357-1-AP,Proteintech),抗SOX9（山羊,1:500；AF3075,Hệ thống R&D),Netrin G1a（山羊,1:100；AF1166,Hệ thống R&D）頏1:20, ;Y40410, Takara Bio), kháng thể chống SATB2 (chuột, 1:50; ab51502, abcam), kháng thể chống GAD65/67 (thỏ, 1:400; ABN904, Millipore) và kháng thể chống IBA1 (dê, 1:100; ab5076, abcam)。Các kháng thể chính được sử dụng là: anti-NeuN (chuột, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (chuột cống, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (thỏ, 1:1000; Z0334, Dako). , kháng GFP (gà, 1:1000; GTX13970, GeneTex), kháng HNA (chuột, 1:200; ab191181, abcam), kháng NeuN (thỏ, 1:500; ABN78, Millipore), kháng PDGFRA (thỏ, 1:200; sc-338, Santa Cruz), kháng PPP1R17 (thỏ, 1:200; HPA047819, kháng thể Atlas), kháng RECA-1 (chuột, 1:50; ab9774, abcam), kháng SCG2 (thỏ), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти -STEM121 (мышь, 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) и анти-IBA1 (коза, 1:100; аб5076, абкам). 20357-1-AP, Proteintech), kháng SOX9 (dê, 1:500; AF3075, Hệ thống R&D), Netrin G1a (dê, 1:100; AF1166, Hệ thống R&D), kháng STEM121 (chuột, 1:200; Y40410, Takara Bio), kháng SATB2 (chuột, 1:50; ab51502, abcam), kháng GAD65/67 (thỏ, 1:400; ABN904, Millipore) và kháng IBA1 (dê, 1:100; ab5076, abkam).Các lát cắt sau đó được rửa bằng PBS và ủ với kháng thể thứ cấp trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng (các lát cắt đông lạnh) hoặc qua đêm ở 4°C (các lát cắt dày). Kháng thể thứ cấp Alexa Fluor (Life Technologies) pha loãng 1:1000 trong dung dịch chặn đã được sử dụng. Sau khi rửa bằng PBS, các nhân được quan sát bằng Hoechst 33258 (Life Technologies). Cuối cùng, các phiến kính được đặt trên kính hiển vi có tấm phủ (Fisher Scientific) sử dụng Aquamount (Polysciences) và phân tích trên kính hiển vi huỳnh quang Keyence (máy phân tích BZ-X) hoặc kính hiển vi cộng hưởng từ Leica TCS SP8 (Las-X) trên hình ảnh. Các hình ảnh được xử lý bằng chương trình ImageJ (Fiji). Để định lượng tỷ lệ tế bào thần kinh của người trong t-hCO và vỏ não chuột, các hình ảnh hình chữ nhật rộng 387,5 μm đã được chụp ở tâm của t-hCO, tại hoặc gần rìa vỏ não chuột. Biên độ ghép được xác định bằng cách đánh giá những thay đổi về độ trong suốt của mô, nhân HNA+ và/hoặc sự hiện diện của huỳnh quang tự nhiên của mô. Trong mỗi hình ảnh, tổng số tế bào NeuN+ và HNA+ được chia cho tổng số tế bào NeuN+ trong cùng một khu vực. Để đảm bảo chỉ đếm được các tế bào có nhân trên mặt phẳng hình ảnh, chỉ đưa các tế bào cũng là Hoechst+ vào phép tính. Hai hình ảnh cách nhau ít nhất 1 mm được tính trung bình để giảm lỗi thống kê.
Một tuần trước khi thu thập mẫu, đặt động vật cấy ghép hCO (khoảng 8 tháng biệt hóa) vào phòng tối với ria được cắt tỉa để giảm thiểu kích thích giác quan. Việc phân lập nhân được thực hiện như đã mô tả trước đó, với một số sửa đổi. Tóm lại, t-hCO và hCO bị phá hủy bằng cách sử dụng phương pháp ly giải tế bào cơ học-chất tẩy rửa và máy nghiền mô thủy tinh 2 ml (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE). Sau đó, nhân thô được lọc ra bằng bộ lọc 40 µm và ly tâm ở 320 g trong 10 phút ở 4 °C trước khi thực hiện gradient mật độ sucrose. Sau bước ly tâm (320 g trong 20 phút ở 4 °C), các mẫu được huyền phù lại trong 0,04% BSA/PBS với việc bổ sung 0,2 đơn vị chất ức chế µl-1 RNase (40 u µl-1, AM2682, Ambion) và đi qua bộ lọc dòng chảy 40 µm. Các nhân tế bào đã phân ly sau đó được huyền phù lại trong PBS có chứa 0,02% BSA và nạp vào chip Crom Single Cell 3′ (ước tính thu hồi được 8.000 tế bào trên mỗi làn). Thư viện snRNA-seq được chuẩn bị bằng Bộ dụng cụ Chromium Single cell 3′ GEM, Thư viện & Gel Bead v3 (10x Genomics). Thư viện snRNA-seq được chuẩn bị bằng Bộ dụng cụ Chromium Single cell 3′ GEM, Thư viện & Gel Bead v3 (10x Genomics). Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью Chrome Single cell 3′ GEM, Thư viện & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Thư viện snRNA-seq được chuẩn bị bằng cách sử dụng Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Bộ thư viện & hạt gel v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Bộ thư viện & hạt gel v3 (10x Genomics) 制备的。 Библиотеку snRNA-seq готовили с использованием Crom Single Cell 3′ GEM, Thư viện & Bộ hạt gel v3 (10x Genomics). Thư viện snRNA-seq được chuẩn bị bằng cách sử dụng Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics).Các thư viện từ các mẫu khác nhau đã được tập hợp và giải trình tự bởi Admera Health trên NovaSeq S4 (Illumina).
Mức độ biểu hiện gen cho mỗi mã vạch hạt nhân được cho là đã được định lượng bằng cách sử dụng gói phần mềm phân tích 10x Genomics CellRanger (phiên bản 6.1.2). Cụ thể, các lần đọc được khớp với sự kết hợp của bộ gen tham chiếu của người (GRCh38, Ensemble, phiên bản 98) và chuột (Rnor_6.0, Ensemble, phiên bản 100) được tạo bằng lệnh mkref và sử dụng count với lệnh –include-introns=TRUE để định lượng các lần đọc bao gồm được ánh xạ tới các vùng intron. Đối với các mẫu t-hCO, nhân tế bào người được xác định dựa trên yêu cầu thận trọng rằng ít nhất 95% tất cả các lần đọc được ánh xạ khớp với bộ gen người. Tất cả các phân tích tiếp theo đã được thực hiện trên một mảng mã vạch đã lọc đầu ra từ CellRanger bằng cách sử dụng gói R (phiên bản 4.1.2) Seurat (phiên bản 4.1.1)32.
Để đảm bảo chỉ có các nhân chất lượng cao được đưa vào phân tích tiếp theo, một quy trình lọc lặp lại đã được triển khai cho mỗi mẫu. Đầu tiên, các nhân chất lượng thấp với ít hơn 1000 gen duy nhất được tìm thấy và hơn 20% tổng số ty thể được xác định và loại bỏ. Sau đó, ma trận số gen thô được chuẩn hóa bằng hồi quy nhị thức âm tính được điều chỉnh bằng hàm sctransform(vst.flavor=”v2″), hàm này cũng xác định 3000 gen biến đổi nhiều nhất bằng các tham số mặc định. Giảm kích thước được thực hiện trên các gen biến đổi trên cùng bằng cách sử dụng Phân tích thành phần chính (PCA) với các tham số mặc định bằng cách sử dụng kích thước tập dữ liệu là 30 (dims = 30 được chọn dựa trên kiểm tra trực quan các vị trí đầu gối và được sử dụng cho tất cả các mẫu và phân tích tổng hợp). Sau đó, chúng tôi thực hiện một số vòng phân cụ lặp lại (độ phân giải = 1) để phân loại các gen dựa trên số lượng gen thấp bất thường (trung bình dưới phần trăm thứ 10), số lượng gen ty thể cao bất thường (trung bình trên phần trăm thứ 95) để xác định và loại bỏ các tế bào được cho là có chất lượng thấp. cụm và/hoặc tỷ lệ cao các cặp song sinh nghi ngờ được xác định bằng cách sử dụng gói DoubletFinder33 (điểm DoubletFinder trung bình trên phần trăm thứ 95). Các mẫu t-hCO (n = 3) và các mẫu hCO (n = 3) được tích hợp riêng biệt bằng cách sử dụng hàm IntegrateData với các thông số trên. Sau đó, một vòng lọc định tính khác của tập dữ liệu tích hợp được thực hiện như mô tả ở trên.
Sau khi loại bỏ các hạt nhân chất lượng thấp, tập dữ liệu tích hợp đã được nhóm lại (độ phân giải = 0,5) và nhúng vào mục đích trực quan hóa UMAP34. Các gen đánh dấu cho mỗi cụm được xác định bằng hàm FindMarkers với các tham số mặc định được tính toán từ dữ liệu biểu hiện gen được chuẩn hóa. Chúng tôi xác định và phân loại các lớp tế bào chính bằng cách kết hợp các tập dữ liệu tham chiếu vỏ não của thai nhi và người lớn với biểu hiện gen đánh dấu 19,20,21,35 và chú thích. Đặc biệt, các tiền chất lưu hành được xác định bằng biểu hiện của MKI67 và TOP2A. Các cụm tiền thân được xác định bằng sự vắng mặt của bản sao nguyên phân, sự chồng chéo cao với các cụm tiền thân thần kinh đệm đa năng được mô tả trong vỏ não thai nhi kỳ giữa muộn và biểu hiện EGFR và OLIG1. Chúng tôi sử dụng thuật ngữ tế bào hình sao để bao hàm một số trạng thái biệt hóa của tế bào hình sao, từ tế bào thần kinh đệm hướng tâm muộn đến sự trưởng thành của tế bào hình sao. Các cụm tế bào hình sao biểu hiện mức SLC1A3 và AQP4 cao và đã được chứng minh là có thể lập bản đồ với các phân nhóm tế bào thần kinh đệm hướng tâm của thai nhi và/hoặc tế bào hình sao trưởng thành. OPC biểu hiện PDGFRA và SOX10 trong khi oligodendrocytes biểu hiện các dấu hiệu myelin hóa (MOG và MYRF). Các tế bào thần kinh glutamatergic được xác định bằng sự hiện diện của các bản sao tế bào thần kinh (SYT1 và SNAP25), sự vắng mặt của các dấu hiệu GABAergic (GAD2) và biểu hiện của NEUROD6, SLC17A7, BCL11B hoặc SATB2. Các tế bào thần kinh GluN được chia thành các phân lớp trên (biểu hiện SATB2 và mất BCL11B) và sâu (biểu hiện BCL11B). Các tế bào thần kinh bản phụ (SP) được cho là biểu hiện các dấu hiệu SP18 đã biết như ST18 và SORCS1 ngoài các dấu hiệu GluN sâu. Các tế bào giống đám rối mạch mạc được xác định bằng biểu hiện TTR và các tế bào giống màng não biểu hiện các gen liên quan đến nguyên bào sợi và lập bản đồ các tế bào màng mềm/mạch máu của tập dữ liệu tham chiếu.
Phân tích khác biệt về biểu hiện gen giữa các phân lớp t-hCO và hCO đã được thực hiện bằng phương pháp giả lô mới được phát triển, được tái tạo trong các mẫu được triển khai bằng gói Libra R (phiên bản 1.0.0). Cụ thể, các thử nghiệm log-likelihood của edgeR (phiên bản 3.36.0, gói R) đã được thực hiện cho các nhóm bằng cách tính tổng số gen trong các tế bào cho một lớp tế bào nhất định cho mỗi lần sao chép mẫu. Đối với hình ảnh hóa bản đồ nhiệt, các giá trị chuẩn hóa trên một triệu (CPM) được tính bằng edgeR (hàm cpm()) và được chia tỷ lệ (để đạt được giá trị trung bình = 0, độ lệch chuẩn = 1). Phân tích làm giàu Gene Ontology (GO) của các gen GluN t-hCO được điều chỉnh tăng đáng kể đã được thực hiện (giá trị P đã hiệu chỉnh của Benjamin-Hochberg nhỏ hơn 0,05 được biểu hiện ở ít nhất 10% tế bào GluN t-hCO và sự thay đổi tăng gấp ít nhất 2 lần). được thực hiện bằng ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37. Chúng tôi sử dụng ứng dụng ToppFun với các tham số mặc định và báo cáo các giá trị P đã hiệu chỉnh Benjamini-Hochberg được tính toán từ các phép kiểm định siêu hình học có chú thích GO.
Để khớp các cụm snRNA-seq của chúng tôi với các cụm tế bào có chú thích từ các nghiên cứu tham chiếu về RNA-seq tế bào đơn nguyên phát hoặc snRNA-seq19,20,21,22 trưởng thành, chúng tôi đã áp dụng phương pháp tích hợp tập dữ liệu theo cặp. Chúng tôi đã sử dụng quy trình chuẩn hóa SCTransform (v2) trong Seurat để tích hợp và so sánh các cụm chồng chéo giữa các tập dữ liệu (sử dụng cùng các tham số như trên). Các tập dữ liệu riêng lẻ được chia thành tối đa 500 tế bào hoặc lõi ngẫu nhiên trên mỗi cụm gốc để tăng hiệu quả tính toán. Sử dụng phương pháp tương tự như đã mô tả trước đây, cụm chồng chéo được định nghĩa là tỷ lệ tế bào hoặc nhân trong mỗi cụm gộp lại chồng chéo với nhãn của cụm tham chiếu. Để phân loại GluN sâu hơn, chúng tôi đã sử dụng quy trình TransferData của Seurat cho dữ liệu tập hợp con GluN để gán nhãn tập dữ liệu tham chiếu cho các tế bào GluN của chúng tôi.
Để đánh giá trạng thái trưởng thành của bản sao toàn cầu của các mẫu t-hCO và hCO, chúng tôi đã so sánh các mẫu giả khối của mình với BrainSpan/psychENCODE23, bao gồm một chuỗi RNA lớn trải dài quá trình phát triển não người. Chúng tôi đã thực hiện PCA trên ma trận biểu hiện gen chuẩn hóa theo mẫu kết hợp từ các mẫu vỏ não 10 tuần sau khi thụ thai và sau đó, trong 5567 gen (cùng với dữ liệu của chúng tôi) trước đây được xác định là hoạt động trong các mẫu vỏ não BrainSpan (được định nghĩa là lớn hơn 50% về phương sai phát triển được giải thích theo độ tuổi bằng mô hình khối)38. Ngoài ra, chúng tôi đã thu được các gen liên quan đến các dấu hiệu bản sao chính của sự phát triển thần kinh bằng cách sử dụng phép phân tích ma trận không âm như đã mô tả trước đây. Trọng số mẫu được tính toán bằng quy trình phân tích ma trận không âm được biểu thị trên Hình 5b với dữ liệu mở rộng cho mỗi một trong năm dấu hiệu được mô tả bởi Zhu và cộng sự38. Một lần nữa, các dấu hiệu phiên mã phụ thuộc vào hoạt động được thu được từ các nghiên cứu đã công bố trước đây. Đặc biệt, ERG và LRG được điều chỉnh tăng đáng kể trong các tế bào thần kinh glutamatergic được xác định bằng bộ sưu tập snRNA-seq vỏ não thị giác chuột sau khi kích thích thị giác từ Bảng bổ sung 3 Hrvatin et al.16. LRG làm giàu ở người được lấy từ các nuôi cấy não thai nhi người được kích hoạt bằng KCl và thu hoạch 6 giờ sau khi kích thích, và các gen được lọc được điều chỉnh tăng đáng kể ở người nhưng không phải ở loài gặm nhấm (Bảng bổ sung 4). Phân tích làm giàu bộ gen bằng các bộ gen này được thực hiện bằng cách sử dụng thử nghiệm chính xác của Fisher một chiều.
Gây mê chuột bằng isoflurane, lấy não ra và đặt vào dung dịch sucrose lạnh (khoảng 4°C) có oxy (95% O2 và 5% CO2) để cắt lát có chứa: sucrose 234 mM, glucose 11 mM, NaHCO3 26 mM, KCl 2,5 mM, NaH2PO4 1,25 mM, MgSO4 10 mM và CaCl2 0,5 mM (khoảng 310 mOsm). Cắt lát não chuột theo vành đai (300–400 µm) có chứa t-hCO được thực hiện bằng máy cắt rung Leica VT1200 như đã mô tả trước đây39. Các lát cắt sau đó được chuyển đến buồng cắt có oxy hóa liên tục ở nhiệt độ phòng chứa aCSF được chuẩn bị từ: 10 mM glucose, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 và 126 mM NaCl (298 mOsm). ít nhất 45 phút trước khi ghi. Các lát cắt được ghi lại trong buồng ngâm, nơi chúng được tưới liên tục bằng aCSF (lọ 95% O2 và 5% CO2). Tất cả dữ liệu được ghi lại ở nhiệt độ phòng. Các tế bào thần kinh t-hCO được kết thúc bằng pipet thủy tinh borosilicate chứa dung dịch chứa 127 mM kali gluconat, 8 mM NaCl, 4 mM magie ATP, 0,3 mM natri GTP, 10 mM HEPES và 0,6 mM EGTA, pH 7,2, dung dịch bên trong được điều chỉnh bằng KOH (290 mOsm). Để phục hồi, biocytin (0,2%) được thêm vào dung dịch ghi.
Dữ liệu được thu thập bằng bộ khuếch đại MultiClamp 700B (Molecular Devices) và bộ số hóa Digidata 1550B (Molecular Devices), được lọc thông thấp ở 2 kHz, số hóa ở 20 kHz và được phân tích bằng Clampfit (Molecular Devices), Origin (OriginPro). 2021b, OriginLab). và các hàm MATLAB tùy chỉnh (Mathworks). Điện thế tiếp giáp được tính toán bằng JPCalc và các mục nhập được điều chỉnh theo giá trị tính toán là -14 mV. Hoạt động IV bao gồm một loạt các bước dòng điện theo các bước 10-25 pA, từ -250 đến 750 pA.
Đồi thị, chất trắng và các sợi hướng tâm S1 được kích thích điện trong các lát cắt đồi thị vỏ não trong quá trình ghi lại kẹp vá của các tế bào thần kinh hCO, như đã mô tả trước đây. Tóm lại, não được đặt trên một bàn in 3D nghiêng một góc 10° và mặt trước của não được cắt ở góc 35°. Sau đó, não được dán vào bề mặt cắt và cắt lát, bảo toàn các sợi trục nhô ra của đồi thị vỏ não. Các điện cực vonfram lưỡng cực (0,5 MΩ) được gắn trên một bộ vi điều khiển thứ hai và được định vị chiến lược để kích thích bốn vùng trên mỗi tế bào (bao trong, chất trắng, S1 và hCO). Ghi lại các phản ứng synap sau khi kích thích pha 300 µA ở tần số 0,03–0,1 Hz.
Các tế bào thần kinh hCO biểu hiện hChR2 được kích hoạt ở bước sóng 480 nm và các xung ánh sáng do đèn LED (Prizmatix) tạo ra được áp dụng thông qua vật kính ×40 (0,9 NA; Olympus) để ghi lại biểu hiện hChR2 gần các tế bào. Đường kính trường chiếu sáng khoảng 0,5 mm và tổng công suất là 10-20 mW. Độ rộng xung được đặt thành 10 ms, tương ứng với xung được đưa ra trong quá trình thí nghiệm học tập hành vi. Nhiều tần số kích thích khác nhau đã được sử dụng, từ 1 đến 20 Hz, nhưng chỉ có xung đầu tiên của chuỗi được sử dụng để định lượng. Khoảng cách giữa các chuỗi thường dài hơn 30 giây để giảm thiểu tác động lên các con đường ức chế hoặc tạo điều kiện synap. Để kiểm tra xem phản ứng hChR2 có phải là đơn synap hay không, chúng tôi đã áp dụng TTX (1 μM) vào bồn cho đến khi phản ứng EPSC biến mất, sau đó áp dụng 4-aminopyridine (4-AP; 100 μM). Thông thường, phản ứng sẽ được trả về trong vòng vài phút, với độ trễ hơi dài hơn giữa thời điểm đèn LED phát sáng và thời điểm tạo ra EPSC. NBQX (10 μM) được sử dụng để kiểm tra xem phản ứng có được điều khiển bởi thụ thể AMPA hay không.
Các lát cắt hCO sắc nét được tạo ra như đã mô tả trước đó. Tóm lại, các lát cắt hCO được nhúng trong 4% agarose và chuyển vào các tế bào chứa 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 và 10 mM d-(+) -glucose thành Các lát cắt được cắt ở độ dày 200–300 µm ở nhiệt độ phòng bằng máy rung Leica VT1200 và lưu trữ trong ASF ở nhiệt độ phòng. Sau đó, quá trình ghi lại patch-camp của toàn bộ tế bào được thực hiện trên các lát cắt hCO dưới kính hiển vi SliceScope trực tiếp (Scientifica). Các lát cắt được tưới aCSF (95% O2 và 5% CO2) và các tín hiệu tế bào được ghi lại ở nhiệt độ phòng. Các tế bào thần kinh hCO được áp dụng bằng cách sử dụng một ống nhỏ giọt thủy tinh borosilicate chứa dung dịch chứa 127 mM kali gluconat, 8 mM NaCl, 4 mM magie ATP, 0,3 mM natri GTP, 10 mM HEPES và 0,6 mM EGTA, pH bên trong 7, 2, điều chỉnh bằng KOH (độ thẩm thấu 290). Để phục hồi, thêm 0,2% Biocytin vào dung dịch bên trong.
Dữ liệu được thu thập bởi Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices) bằng cách sử dụng bộ khuếch đại MultiClamp 700B (Molecular Devices) và bộ số hóa Digidata 1550B (Molecular Devices), được lọc thông thấp ở 2 kHz, số hóa ở 20 kHz và được phân tích bằng Clampfit (phiên bản 10.6) để phân tích, thiết bị phân tử) và các hàm MATLAB tùy chỉnh (MATLAB 2019b, Mathworks). Điện thế tiếp giáp được tính toán bằng JPCalc và các mục nhập được điều chỉnh theo điện thế tiếp giáp được tính toán là -14 mV. Hoạt động IV bao gồm một loạt các bước dòng điện theo các bước 5-10 pA từ -50 đến 250 pA.
Để tái tạo hình thái của các tế bào thần kinh bị chèn ép, 0,2% biocytin (Sigma-Aldrich) được thêm vào dung dịch bên trong. Các tế bào được mồi trong ít nhất 15 phút sau khi cắt. Sau đó, từ từ hút pipet trong 1–2 phút cho đến khi màng đã đăng ký được bịt kín hoàn toàn. Tiếp theo là quy trình sinh lý cắt, các phần được cố định qua đêm ở 4° C trong 4% PFA, rửa bằng PBS X3 và pha loãng 1:1000 bằng DyLight 549 hoặc DyLight 405 liên hợp với streptavidin (Vector Labs). Các tế bào chứa đầy biocytin (2%; Sigma-Aldrich) được dán nhãn trong quá trình ghi kẹp vá ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ. Sau đó, các phần được gắn trên các phiến kính hiển vi bằng Aquamount (Thermo Scientific) và quan sát vào ngày hôm sau trên kính hiển vi cộng hưởng từ Leica TCS SP8 bằng vật kính ngâm dầu có khẩu độ số ×40 1,3, độ phóng đại ×0,9–1,0, xy. Tốc độ lấy mẫu xấp xỉ 7 pixel trên một micron. Các ngăn xếp Z ở khoảng cách 1 µm được lấy tuần tự, và các khảm ngăn xếp z và khâu tự động dựa trên Leica được thực hiện để bao phủ toàn bộ cây dendritic của mỗi tế bào thần kinh. Sau đó, các tế bào thần kinh được theo dõi bán thủ công bằng giao diện neuTube 40 và các tệp SWC được tạo ra. Các tệp sau đó được tải lên plugin SimpleNeuriteTracer41 Fiji (ImageJ, phiên bản 2.1.0; NIH).
Mô vỏ não của con người được lấy với sự đồng ý có thông tin theo một giao thức được Hội đồng Đánh giá Thể chế của Đại học Stanford chấp thuận. Hai mẫu mô sau sinh của con người (3 và 18 tuổi) đã được lấy bằng cách cắt bỏ vỏ não trán (hồi trán giữa) như một phần của phẫu thuật điều trị động kinh kháng trị. Sau khi cắt bỏ, thu hoạch mô trong NMDG-aCSF lạnh có chứa: 92 mM NMDG, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM glucose, 2 mM thiourea, 5 mM natri ascorbate, 3 mM natri pyruvate, 0,5 mM CaCl2 · 4H2O và 10 mM MgSO4 · 7H2O. Chuẩn độ đến pH 7,3-7,4 bằng axit clohydric đậm đặc. Các mô được chuyển đến phòng xét nghiệm trong vòng 30 phút và các lát cắt ngang được thực hiện theo quy trình được mô tả ở trên.
Tất cả các quy trình trên động vật đều được thực hiện theo hướng dẫn chăm sóc động vật được APLAC của Đại học Stanford chấp thuận. Chuột (hơn 140 ngày sau khi ghép) được gây mê bằng 5% isoflurane và gây mê bằng 1-3% isoflurane trong khi phẫu thuật. Động vật được đặt trong khung định vị lập thể (Kopf) và buprenorphine giải phóng kéo dài (SR) được tiêm dưới da. Hộp sọ được phơi bày, làm sạch và 3-5 vít xương được đưa vào. Để nhắm mục tiêu vào t-hCO, chúng tôi đã tạo ra tọa độ định vị lập thể từ hình ảnh MRI. Một lỗ khoan được khoan tại vị trí quan tâm và các sợi (đường kính 400 µm, NA 0,48, Doric) được hạ xuống 100 µm bên dưới bề mặt hCO và cố định vào hộp sọ bằng xi măng nha khoa đóng rắn bằng tia UV (Relyx).
Ghi quang trắc sợi được thực hiện như đã mô tả trước đây42. Để ghi lại hoạt động tự phát, chuột được đặt trong lồng sạch và cáp vá sợi quang đường kính 400 µm (Doric) được kết nối với hệ thống thu thập dữ liệu quang trắc sợi quang được kết nối với cáp quang cấy ghép. Trong quá trình ghi lại hoạt động vận động trong 10 phút, các con vật được tự do khám phá lồng. Để ghi lại hoạt động được gợi ra, chuột (hơn 140 ngày sau khi cấy ghép) được gây mê bằng 5% isoflurane để gây mê và 1-3% isoflurane để duy trì. Đặt con vật vào khung định vị lập thể (Kopf) và cắt tỉa ria mép ở phía đối diện của t-hCO còn khoảng 2 cm và luồn qua lưới được kết nối với bộ truyền động áp điện (PI). Cáp vá sợi quang 400 µm (Doric) được kết nối với sợi được cấy ghép và kết nối với hệ thống thu thập dữ liệu. Các sợi ria ở phía đối diện của t-hCO sau đó bị lệch 50 lần (2 mm ở tần số 20 Hz, 2 giây cho mỗi lần trình bày) tại các thời điểm ngẫu nhiên bằng ổ áp điện trong khoảng thời gian ghi 20 phút. Sử dụng Gói hỗ trợ Arduino MATLAB để kiểm soát thời gian lệch bằng mã MATLAB tùy chỉnh. Các sự kiện được đồng bộ hóa với phần mềm thu thập dữ liệu bằng xung logic transistor-transistor (TTL).
Chuột (sau hơn 140 ngày sau khi ghép) được gây mê bằng 5% isoflurane và gây mê bằng 1-3% isoflurane trong khi phẫu thuật. Động vật được đặt trong khung định vị lập thể (Kopf) và buprenorphine SR và dexamethasone được tiêm dưới da. Hộp sọ được phơi bày, làm sạch và 3-5 vít xương được đưa vào. Để nhắm mục tiêu vào t-hCO, chúng tôi đã tạo ra các tọa độ định vị lập thể từ hình ảnh MRI. Một phẫu thuật mở hộp sọ tròn (đường kính khoảng 1 cm) đã được thực hiện bằng một mũi khoan tốc độ cao trực tiếp trên hCO được ghép. Khi xương mỏng nhất có thể, nhưng trước khi khoan xuyên qua toàn bộ xương, hãy sử dụng kẹp để loại bỏ đĩa đệm chậu còn nguyên vẹn để lộ t-hCO bên dưới. Phẫu thuật mở hộp sọ được đổ đầy nước muối vô trùng và một tấm kính che và một chốt đầu đặc biệt được gắn vào hộp sọ bằng xi măng nha khoa đóng rắn bằng tia cực tím (Relyx).
Chụp ảnh hai photon được thực hiện bằng kính hiển vi đa photon Bruker với vật kính Nikon LWD (×16, 0,8 NA). Chụp ảnh GCaMP6 được thực hiện ở 920 nm với độ phóng đại mặt phẳng z đơn 1,4x và trung bình 8x là 7,5 fps. Chuột được gây mê bằng 5% isoflurane và duy trì bằng 1-3% isoflurane. Chuột được đặt trong một vật cố định đầu được làm riêng và đặt dưới thấu kính. Đã thu được bản ghi nền về hoạt động vận động trong 3 phút. Trong quá trình ghi hình 20 phút, 50 lần thổi (mỗi lần dài 100 ms) được truyền ngẫu nhiên đến miếng đệm râu đối diện với t-hCO bằng cách sử dụng picospricer. Sử dụng Gói hỗ trợ Arduino MATLAB để kiểm soát thời gian bùng phát bằng mã MATLAB tùy chỉnh. Đồng bộ hóa các sự kiện với phần mềm thu thập dữ liệu (PrairieView 5.5) bằng xung TTL. Để phân tích, hình ảnh đã được hiệu chỉnh chuyển động xy bằng cách sử dụng hiệu chỉnh affine trong chương trình MoCo được triển khai tại Fiji. Trích xuất các dấu vết huỳnh quang từ từng tế bào bằng CNMF-E43. Huỳnh quang được trích xuất cho từng vùng quan tâm, chuyển đổi thành đường cong dF/F, sau đó chuyển đổi thành điểm số z.
Chuột (sau hơn 140 ngày sau ghép) được gây mê bằng 5% isoflurane và gây mê bằng 1-3% isoflurane trong khi phẫu thuật. Động vật được đặt trong khung định vị lập thể (Kopf) và buprenorphine SR và dexamethasone được tiêm dưới da. Các sợi ria ở phía đối diện của t-hCO được cắt thành khoảng 2 cm và luồn qua một lưới được kết nối với bộ truyền động áp điện. Hộp sọ được phơi bày và làm sạch. Một vít mài bằng thép không gỉ được gắn vào hộp sọ. Để nhắm mục tiêu vào t-hCO, chúng tôi đã tạo ra các tọa độ định vị lập thể từ hình ảnh MRI. Thực hiện một phẫu thuật cắt sọ tròn (đường kính khoảng 1 cm) bằng một mũi khoan tốc độ cao ngay phía trên t-hCO. Khi xương mỏng nhất có thể, nhưng trước khi khoan xuyên qua toàn bộ xương, hãy sử dụng kẹp để loại bỏ đĩa đệm chậu còn nguyên vẹn để lộ t-hCO bên dưới. Các tế bào riêng lẻ được ghi lại bằng đầu dò silicon mật độ cao 32 kênh hoặc 64 kênh (Cambridge Neurotech) được nối đất với các vít nối đất và được khuếch đại trước bằng bộ khuếch đại RHD (Intan). Sử dụng bộ điều khiển để hạ điện cực xuống vị trí mục tiêu thông qua đường rạch sọ, nơi chứa đầy dung dịch muối vô trùng. Việc thu thập dữ liệu được thực hiện ở tần số 30 kHz bằng hệ thống thu thập dữ liệu Open Ephys. Việc ghi chỉ tiếp tục khi chúng tôi phát hiện hoạt động tự phát nhịp điệu có mối tương quan cao ở hơn 10 kênh, điều này cho thấy các điện cực nằm trong ghép (dựa trên dữ liệu hình ảnh canxi hai photon). Đã thu được bản ghi nền trong 10 phút về hoạt động vận động. Sau đó, các sợi ria ở phía đối diện của t-hCO bị lệch 50 lần (2 mm ở tần số 20 Hz, 2 giây cho mỗi lần trình bày) ngẫu nhiên bằng ổ áp điện trong khoảng thời gian ghi 20 phút. Sử dụng Gói hỗ trợ MATLAB cho Arduino (MATLAB 2019b), kiểm soát thời gian lệch bằng mã MATLAB tùy chỉnh. Sử dụng xung TTL để đồng bộ hóa các sự kiện với phần mềm thu thập dữ liệu.
Đối với các thí nghiệm đánh dấu quang học, một dây vá quang 200 µm (Doric) được kết nối với tia laser 473 nm (Omicron) được kết nối với sợi quang 200 µm được đặt trên vết mổ sọ. Ngay trước đó, điều chỉnh công suất jumper thành 20 mW. Sử dụng bộ điều khiển để hạ điện cực xuống vị trí mục tiêu thông qua vết mổ sọ, nơi chứa đầy dung dịch muối vô trùng. Khi bắt đầu ghi, mười xung ánh sáng 473 nm (tần số 2 Hz, thời lượng xung 10 ms) đã được phát ra. Các tế bào nhạy sáng được định nghĩa là các tế bào biểu hiện phản ứng đột biến trong vòng 10 ms ánh sáng trong 70% hoặc nhiều hơn các lần thử nghiệm.