Cảm ơn bạn đã ghé thăm Nature.com.Phiên bản trình duyệt bạn đang sử dụng có hỗ trợ CSS hạn chế.Để có trải nghiệm tốt nhất, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng trình duyệt cập nhật (hoặc tắt Chế độ tương thích trong Internet Explorer).Trong thời gian chờ đợi, để đảm bảo hỗ trợ liên tục, chúng tôi sẽ hiển thị trang web không có kiểu và JavaScript.
Sinh thiết lỏng (LB) là một khái niệm đang nhanh chóng trở nên phổ biến trong lĩnh vực y sinh.Khái niệm này chủ yếu dựa trên việc phát hiện các đoạn DNA ngoại bào lưu thông (ccfDNA), chủ yếu được giải phóng dưới dạng các đoạn nhỏ sau khi tế bào chết trong các mô khác nhau.Một tỷ lệ nhỏ các mảnh vỡ này bắt nguồn từ các mô hoặc sinh vật ngoại lai (ngoại lai).Trong công việc hiện tại, chúng tôi đã áp dụng khái niệm này cho trai, một loài canh gác được biết đến với khả năng lọc nước biển cao.Chúng tôi sử dụng khả năng của trai hoạt động như những bộ lọc tự nhiên để thu thập các đoạn DNA môi trường từ nhiều nguồn khác nhau để cung cấp thông tin về đa dạng sinh học của các hệ sinh thái ven biển.Kết quả của chúng tôi cho thấy tan máu vẹm chứa các đoạn DNA có kích thước rất khác nhau, từ 1 đến 5 kb.Giải trình tự bằng súng ngắn cho thấy một số lượng lớn các đoạn DNA có nguồn gốc từ vi sinh vật ngoại lai.Trong số đó, chúng tôi đã tìm thấy các đoạn DNA của vi khuẩn, vi khuẩn cổ và vi rút, bao gồm cả vi rút được biết là lây nhiễm nhiều loại vật chủ thường thấy trong các hệ sinh thái biển ven biển.Tóm lại, nghiên cứu của chúng tôi chứng minh rằng khái niệm LB áp dụng cho trai thể hiện một nguồn kiến ​​thức phong phú nhưng chưa được khám phá về sự đa dạng của vi sinh vật trong hệ sinh thái ven biển.
Tác động của biến đổi khí hậu (BĐKH) đối với đa dạng sinh học của các hệ sinh thái biển là một lĩnh vực nghiên cứu đang phát triển nhanh chóng.Sự nóng lên toàn cầu không chỉ gây ra những căng thẳng sinh lý quan trọng mà còn đẩy giới hạn tiến hóa của sự ổn định nhiệt của các sinh vật biển, ảnh hưởng đến môi trường sống của một số loài, khiến chúng phải tìm kiếm những điều kiện thuận lợi hơn [1, 2].Ngoài việc ảnh hưởng đến tính đa dạng sinh học của metazoans, CC còn phá vỡ sự cân bằng mong manh của các tương tác giữa vật chủ và vi sinh vật.Chứng rối loạn vi khuẩn này gây ra mối đe dọa nghiêm trọng đối với hệ sinh thái biển vì nó làm cho các sinh vật biển dễ bị nhiễm mầm bệnh truyền nhiễm hơn [3, 4].Người ta tin rằng SS đóng một vai trò quan trọng trong việc gây ra cá chết hàng loạt, đây là một vấn đề nghiêm trọng đối với việc quản lý các hệ sinh thái biển toàn cầu [5, 6].Đây là một vấn đề quan trọng do các tác động kinh tế, sinh thái và dinh dưỡng của nhiều loài sinh vật biển.Điều này đặc biệt đúng đối với động vật hai mảnh vỏ sống ở vùng cực, nơi tác động của CK diễn ra ngay lập tức và nghiêm trọng hơn [6, 7].Trên thực tế, các loài hai mảnh vỏ như Mytilus spp.được sử dụng rộng rãi để theo dõi tác động của BĐKH đối với các hệ sinh thái biển.Không có gì đáng ngạc nhiên, một số lượng tương đối lớn các dấu ấn sinh học đã được phát triển để theo dõi sức khỏe của chúng, thường sử dụng phương pháp hai cấp liên quan đến các dấu ấn sinh học chức năng dựa trên hoạt động của enzyme hoặc chức năng của tế bào như khả năng sống của tế bào và hoạt động thực bào [8].Các phương pháp này cũng bao gồm phép đo nồng độ của các chỉ số áp suất cụ thể tích tụ trong các mô mềm sau khi hấp thụ một lượng lớn nước biển.Tuy nhiên, khả năng lọc cao và hệ thống tuần hoàn bán hở của động vật hai mảnh vỏ tạo cơ hội phát triển các dấu ấn sinh học tan máu mới bằng cách sử dụng khái niệm sinh thiết lỏng (LB), một phương pháp tiếp cận đơn giản và ít xâm lấn để quản lý bệnh nhân.mẫu máu [9, 10].Mặc dù một số loại phân tử tuần hoàn có thể được tìm thấy trong LB của con người, nhưng khái niệm này chủ yếu dựa trên phân tích trình tự DNA của các đoạn DNA ngoại bào (ccfDNA) tuần hoàn trong huyết tương.Trên thực tế, sự hiện diện của DNA tuần hoàn trong huyết tương người đã được biết đến từ giữa thế kỷ 20 [11], nhưng chỉ trong những năm gần đây, sự ra đời của các phương pháp giải trình tự thông lượng cao đã dẫn đến chẩn đoán lâm sàng dựa trên ccfDNA.Sự hiện diện của các đoạn DNA tuần hoàn này một phần là do sự giải phóng thụ động DNA bộ gen (nhân và ty thể) sau khi tế bào chết. Ở những người khỏe mạnh, nồng độ ccfDNA thường thấp (<10 ng/mL) nhưng có thể tăng 5–10 lần ở những bệnh nhân mắc các bệnh lý khác nhau hoặc bị căng thẳng, dẫn đến tổn thương mô. Ở những người khỏe mạnh, nồng độ ccfDNA thường thấp (<10 ng/mL) nhưng có thể tăng 5–10 lần ở những bệnh nhân mắc các bệnh lý khác nhau hoặc bị căng thẳng, dẫn đến tổn thương mô. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаься в 5–10 раз у больных с различной патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к пов реждению тканей. Ở những người khỏe mạnh, nồng độ cccDNA thường thấp (<10 ng/mL), nhưng nó có thể tăng 5–10 lần ở những bệnh nhân mắc các bệnh lý khác nhau hoặc bị căng thẳng dẫn đến tổn thương mô.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而导致组织损伤。在健康个体中，ccfdna的浓度较低（（<10 ng/ml）但在各种病理或承受压力患者中可增加 5-10倍，从而组织。。。损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-1 0 раз у пациентов с различными патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. Nồng độ ccfDNA thường thấp (<10 ng/ml) ở những người khỏe mạnh, nhưng có thể tăng gấp 5-10 lần ở những bệnh nhân mắc các bệnh lý hoặc căng thẳng khác nhau, dẫn đến tổn thương mô.Kích thước của các đoạn ccfDNA rất khác nhau, nhưng thường nằm trong khoảng từ 150 đến 200 bp.[12].Phân tích ccfDNA tự tạo ra, tức là ccfDNA từ các tế bào chủ bình thường hoặc đã biến đổi, có thể được sử dụng để phát hiện các thay đổi di truyền và biểu sinh có trong bộ gen nhân và/hoặc ty thể, từ đó giúp các bác sĩ lâm sàng lựa chọn các liệu pháp nhắm mục tiêu phân tử cụ thể [13].Tuy nhiên, ccfDNA có thể được lấy từ các nguồn ngoại lai như ccfDNA từ các tế bào của thai nhi trong thời kỳ mang thai hoặc từ các cơ quan được cấy ghép [14,15,16,17].ccfDNA cũng là nguồn thông tin quan trọng để phát hiện sự hiện diện của axit nucleic của tác nhân lây nhiễm (ngoại lai), cho phép phát hiện không xâm lấn các bệnh nhiễm trùng lan rộng không xác định được bằng cấy máu, tránh sinh thiết xâm lấn mô bị nhiễm bệnh [18].Các nghiên cứu gần đây đã thực sự chỉ ra rằng máu người chứa một nguồn thông tin phong phú có thể được sử dụng để xác định mầm bệnh vi rút và vi khuẩn, và khoảng 1% ccfDNA được tìm thấy trong huyết tương người có nguồn gốc ngoại lai [19].Những nghiên cứu này chứng minh rằng tính đa dạng sinh học của hệ vi sinh vật tuần hoàn của một sinh vật có thể được đánh giá bằng cách sử dụng phân tích ccfDNA.Tuy nhiên, cho đến gần đây, khái niệm này chỉ được sử dụng ở người và ở mức độ thấp hơn ở các động vật có xương sống khác [20, 21].
Trong bài báo hiện tại, chúng tôi sử dụng tiềm năng LB để phân tích ccfDNA của Aulacomya atra, một loài phía nam thường được tìm thấy ở Quần đảo Kerguelen cận Nam Cực, một nhóm đảo trên đỉnh một cao nguyên rộng lớn hình thành cách đây 35 triệu năm.Sự phun trào núi lửa.Sử dụng một hệ thống thử nghiệm trong ống nghiệm, chúng tôi phát hiện ra rằng các đoạn DNA trong nước biển nhanh chóng được trai hấp thụ và đi vào ngăn tan máu.Giải trình tự bằng súng ngắn đã chỉ ra rằng ccfDNA tan huyết của vẹm chứa các đoạn DNA có nguồn gốc riêng và không phải của chính nó, bao gồm vi khuẩn cộng sinh và các đoạn DNA từ quần xã sinh vật điển hình của hệ sinh thái ven biển núi lửa lạnh.Hemolymph ccfDNA cũng chứa các trình tự vi-rút có nguồn gốc từ vi-rút có phạm vi vật chủ khác nhau.Chúng tôi cũng tìm thấy các đoạn DNA từ động vật đa bào như cá xương, hải quỳ, tảo và côn trùng.Tóm lại, nghiên cứu của chúng tôi chứng minh rằng khái niệm LB có thể được áp dụng thành công cho động vật không xương sống ở biển để tạo ra một kho gen phong phú trong hệ sinh thái biển.
Mytilus platensis (M. platensis) và Aulacomya atra (A. atra) trưởng thành (dài 55-70 mm) được thu thập từ các bờ đá liên triều của Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E.).Quần đảo Kerguelen vào tháng 12 năm 2018. Những con vẹm xanh trưởng thành khác (Mytilus spp.) được lấy từ một nhà cung cấp thương mại (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Canada) và đặt trong bể sục khí được kiểm soát nhiệt độ (4°C) chứa 10–20 L nước muối nhân tạo 32‰.(muối biển nhân tạo Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, USA).Đối với mỗi thí nghiệm, chiều dài và trọng lượng của từng vỏ được đo.
Giao thức truy cập mở miễn phí cho chương trình này có sẵn trực tuyến (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).Tóm lại, tan máu LB được thu thập từ cơ kẻ bắt cóc như mô tả [22].Dịch tan máu được làm trong bằng cách ly tâm ở 1200×g trong 3 phút, phần nổi phía trên được đông lạnh (-20°C) cho đến khi sử dụng.Để phân lập và tinh chế cfDNA, các mẫu (1,5-2,0 ml) được rã đông và xử lý bằng cách sử dụng bộ cfDNA NucleoSnap (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.ccfDNA được bảo quản ở -80°C cho đến khi phân tích thêm.Trong một số thí nghiệm, ccfDNA đã được phân lập và tinh chế bằng cách sử dụng Bộ điều tra DNA QIAamp (QIAGEN, Toronto, Ontario, Canada).DNA tinh khiết được định lượng bằng xét nghiệm PicoGreen tiêu chuẩn.Sự phân bố đoạn của ccfDNA đã phân lập được phân tích bằng điện di mao quản bằng máy phân tích sinh học Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) bằng cách sử dụng Bộ DNA có độ nhạy cao.Thử nghiệm được thực hiện bằng cách sử dụng 1 μl mẫu ccfDNA theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Để giải trình tự các đoạn ccfDNA tan máu, Génome Québec (Montreal, Quebec, Canada) đã chuẩn bị các thư viện súng ngắn bằng cách sử dụng bộ Illumina DNA Mix của bộ Illumina MiSeq PE75.Một bộ chuyển đổi tiêu chuẩn (BioO) đã được sử dụng.Các tệp dữ liệu thô có sẵn từ Lưu trữ trình tự đọc NCBI (SRR8924808 và SRR8924809).Chất lượng đọc cơ bản được đánh giá bằng FastQC [23].Trimmomatic [24] đã được sử dụng để cắt bộ điều hợp và đọc chất lượng kém.Các lần đọc súng ngắn với các đầu được ghép nối đã được FLASH hợp nhất thành các lần đọc đơn lẻ dài hơn với độ chồng lấp tối thiểu là 20 bp để tránh sự không khớp [25]. Các lần đọc đã hợp nhất được chú thích bằng BLASTN bằng cách sử dụng cơ sở dữ liệu Phân loại NCBI hai mảnh vỏ (giá trị e < 1e−3 và 90% tương đồng) và che giấu các chuỗi có độ phức tạp thấp được thực hiện bằng cách sử dụng DUST [26]. Các lần đọc đã hợp nhất được chú thích bằng BLASTN bằng cách sử dụng cơ sở dữ liệu Phân loại NCBI hai mảnh vỏ (giá trị e < 1e−3 và 90% tương đồng) và che giấu các chuỗi có độ phức tạp thấp được thực hiện bằng cách sử dụng DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчатых моллюсков NCBI (значение e < 1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием BỤI [26]. Các lần đọc tổng hợp được chú thích bằng BLASTN bằng cách sử dụng cơ sở dữ liệu phân loại hai mảnh vỏ NCBI (giá trị e < 1e-3 và 90% tương đồng) và mặt nạ trình tự có độ phức tạp thấp được thực hiện bằng DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读数，并使用DUST [26] 进行低复杂度序列的掩蔽。使用双壳类 ncbi分类（（（<1e-3和90%同源）用用用注释合并读数，并使用 bụi [26]进行复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных двустворчатых моллюсков NCBI (значение e <1e-3 và 90% гомологии), а маскирование последователь ностей низкой сложности было выполнено с использованием BỤI [26]. Các lần đọc tổng hợp được chú thích bằng BLASTN bằng cách sử dụng cơ sở dữ liệu phân loại hai mảnh vỏ NCBI (giá trị e <1e-3 và tương đồng 90%) và mặt nạ trình tự có độ phức tạp thấp được thực hiện bằng DUST [26].Các lần đọc được chia thành hai nhóm: liên quan đến trình tự hai mảnh vỏ (ở đây được gọi là tự đọc) và không liên quan (không tự đọc).Hai nhóm được tập hợp riêng biệt bằng MEGAHIT để tạo các đường viền [27].Trong khi đó, sự phân bổ phân loại của các lần đọc microbiome ngoài hành tinh được phân loại bằng Kraken2 [28] và được biểu thị bằng đồ họa bằng biểu đồ hình tròn Krona trên Galaxy [29, 30].Các kmer tối ưu được xác định là kmers-59 từ các thí nghiệm sơ bộ của chúng tôi. Sau đó, các đường viền tự được xác định bằng cách căn chỉnh với BLASTN (cơ sở dữ liệu NCBI hai mảnh vỏ, giá trị e <1e−10 và tương đồng 60%) cho chú thích cuối cùng. Sau đó, các đường viền tự được xác định bằng cách căn chỉnh với BLASTN (cơ sở dữ liệu NCBI hai mảnh vỏ, giá trị e <1e−10 và tương đồng 60%) cho chú thích cuối cùng. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двуст ворчатых моллюсков NCBI, значение e <1e-10 và гомология 60%). Sau đó, các đường viền tự được xác định bằng cách khớp với BLASTN (cơ sở dữ liệu hai mảnh vỏ NCBI, giá trị e <1e-10 và tương đồng 60%) cho chú thích cuối cùng.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）对齐来识别自身重叠群以行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставл ения с BLASTN (do NCBI для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). Sau đó, các đường viền tự được xác định cho chú thích cuối cùng bằng cách khớp với BLASTN (cơ sở dữ liệu hai mảnh vỏ NCBI, giá trị e <1e-10 và tương đồng 60%). Song song, các nhóm không phải của nhóm được chú thích bằng BLASTN (cơ sở dữ liệu nt NCBI, giá trị e <1e−10 và tương đồng 60%). Song song, các nhóm không phải của nhóm được chú thích bằng BLASTN (cơ sở dữ liệu nt NCBI, giá trị e <1e−10 và tương đồng 60%). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 và гомология 60%). Song song, các nhóm nước ngoài được chú thích bằng BLASTN (cơ sở dữ liệu NT NCBI, giá trị e <1e-10 và tương đồng 60%).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (ба за данных nt NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%). Song song, các nhóm không phải của nhóm tự được chú thích bằng BLASTN (cơ sở dữ liệu nt NCBI, giá trị e <1e-10 và tương đồng 60%). BLASTX cũng được tiến hành trên các đường viền không phải của chính nó bằng cách sử dụng cơ sở dữ liệu NCBI protein nr và RefSeq (giá trị e <1e−10 và tương đồng 60%). BLASTX cũng được tiến hành trên các đường viền không phải của chính nó bằng cách sử dụng cơ sở dữ liệu NCBI protein nr và RefSeq (giá trị e <1e−10 và tương đồng 60%). BLASTX được sử dụng trên phần mềm BLASTX trên на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и Ref Seq NCBI (значение e <1e-10 и гомология 60%). BLASTX cũng được thực hiện trên các đường viền không tự sử dụng cơ sở dữ liệu protein nr và RefSeq NCBI (giá trị e <1e-10 và tương đồng 60%).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）。还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）。 BLASTX có thể được sử dụng bởi các ứng dụng trên nền tảng và RefSeq NC BI (значение e <1e-10 и гомология 60%). BLASTX cũng được thực hiện trên các đường viền không tự sử dụng cơ sở dữ liệu protein nr và RefSeq NCBI (giá trị e <1e-10 và tương đồng 60%).Nhóm BLASTN và BLASTX của các đường viền không tự đại diện cho các đường viền cuối cùng (xem tệp bổ sung).
Các đoạn mồi được sử dụng cho PCR được liệt kê trong Bảng S1.Taq DNA polymerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) đã được sử dụng để khuếch đại gen mục tiêu ccfDNA.Các điều kiện phản ứng sau đây đã được sử dụng: biến tính ở 95°C trong 3 phút, 95°C trong 1 phút, đặt nhiệt độ ủ trong 1 phút, kéo dài ở 72°C trong 1 phút, 35 chu kỳ và cuối cùng là 72°C trong vòng 10 phút..Các sản phẩm PCR được phân tách bằng điện di trong gel agarose (1,5%) có chứa SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) ở 95 V.
Trai (Mytilus spp.) được thích nghi trong 500 ml nước biển có oxy (32 PSU) trong 24 giờ ở 4°C.DNA plasmid chứa đoạn chèn mã hóa trình tự galectin-7 cDNA của người (số gia nhập NCBI L07769) đã được thêm vào lọ ở nồng độ cuối cùng là 190 μg/μl.Trai được ủ trong cùng điều kiện mà không bổ sung DNA là đối chứng.Bể đối chứng thứ ba chứa DNA không có vẹm.Để theo dõi chất lượng DNA trong nước biển, các mẫu nước biển (20 μl; ba lần lặp lại) được lấy từ mỗi bể vào thời điểm được chỉ định.Để truy xuất nguồn gốc DNA plasmid, vẹm LB đã được thu hoạch vào những thời điểm được chỉ định và được phân tích bằng qPCR và ddPCR.Do hàm lượng muối cao trong nước biển, các phần dịch chiết được pha loãng trong nước chất lượng PCR (1:10) trước tất cả các xét nghiệm PCR.
PCR giọt kỹ thuật số (ddPCR) được thực hiện bằng giao thức BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Canada).Sử dụng cấu hình nhiệt độ để xác định nhiệt độ tối ưu (Bảng S1).Vật rơi được tạo bằng trình tạo vật rơi QX200 (BioRad).ddPCR được thực hiện như sau: 95°C trong 5 phút, 50 chu kỳ 95°C trong 30 giây và nhiệt độ ủ nhất định trong 1 phút và 72°C trong 30 giây, 4°C trong 5 phút và 90°C trong vòng 5 phút.Số lượng giọt và phản ứng dương tính (số lượng bản sao/µl) được đo bằng đầu đọc giọt QX200 (BioRad).Các mẫu có ít hơn 10.000 giọt bị từ chối.Kiểm soát mẫu không được thực hiện mỗi khi chạy ddPCR.
qPCR được thực hiện bằng cách sử dụng mồi cụ thể của Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) và LGALS7.Tất cả PCR định lượng được thực hiện trong 20 μl bằng cách sử dụng Bộ công cụ PCR xanh QuantiFast SYBR (QIAGEN).qPCR được bắt đầu với thời gian ủ 15 phút ở 95°C, sau đó là 40 chu kỳ ở 95°C trong 10 giây và ở 60°C trong 60 giây với một lần thu thập dữ liệu.Các đường cong nóng chảy được tạo ra bằng cách sử dụng các phép đo liên tiếp ở 95°C trong 5 giây, 65°C trong 60 giây và 97°C khi kết thúc qPCR.Mỗi qPCR được thực hiện ba lần, ngoại trừ các mẫu đối chứng.
Vì trai được biết đến với tốc độ lọc cao, nên trước tiên chúng tôi đã điều tra xem liệu chúng có thể lọc và giữ lại các đoạn DNA có trong nước biển hay không.Chúng tôi cũng quan tâm đến việc liệu những mảnh vỡ này có tích tụ trong hệ thống bạch huyết bán mở của chúng hay không.Chúng tôi đã giải quyết vấn đề này bằng thực nghiệm bằng cách truy tìm số phận của các đoạn DNA hòa tan được thêm vào bể vẹm xanh.Để tạo điều kiện theo dõi các đoạn DNA, chúng tôi đã sử dụng DNA plasmid ngoại lai (không phải của chính mình) có chứa gen galectin-7 của con người.ddPCR truy tìm các đoạn DNA plasmid trong nước biển và trai.Kết quả của chúng tôi cho thấy rằng nếu lượng đoạn DNA trong nước biển tương đối ổn định theo thời gian (tối đa 7 ngày) khi không có trai, thì khi có trai, mức này gần như biến mất hoàn toàn trong vòng 8 giờ (Hình 1a, b).Các đoạn DNA ngoại sinh dễ dàng được phát hiện trong vòng 15 phút trong dịch nội van và tan máu (Hình 1c).Những mảnh vỡ này vẫn có thể được phát hiện trong vòng 4 giờ sau khi tiếp xúc.Hoạt động lọc này đối với các đoạn DNA có thể so sánh với hoạt động lọc của vi khuẩn và tảo [31].Những kết quả này cho thấy trai có thể lọc và tích lũy DNA ngoại lai trong khoang chất lỏng của chúng.
Nồng độ tương đối của DNA plasmid trong nước biển khi có (A) hoặc vắng mặt (B) trai, được đo bằng ddPCR.Trong A, kết quả được thể hiện dưới dạng phần trăm, với các đường viền của hộp đại diện cho phần trăm thứ 75 và 25.Đường cong logarit phù hợp được hiển thị bằng màu đỏ và khu vực được tô màu xám biểu thị khoảng tin cậy 95%.Trong B, đường màu đỏ biểu thị giá trị trung bình và đường màu xanh biểu thị khoảng tin cậy 95% cho nồng độ.C Tích lũy DNA plasmid trong dịch tan huyết và van của trai ở các thời điểm khác nhau sau khi bổ sung DNA plasmid.Kết quả được trình bày dưới dạng bản sao tuyệt đối được phát hiện/mL (±SE).
Tiếp theo, chúng tôi đã điều tra nguồn gốc của ccfDNA trong vẹm được thu thập từ các bãi hến trên Quần đảo Kerguelen, một nhóm đảo xa xôi có ảnh hưởng hạn chế của con người.Với mục đích này, cccDNA từ tan máu vẹm đã được phân lập và tinh chế bằng các phương pháp thường được sử dụng để tinh chế cccDNA của con người [32, 33].Chúng tôi nhận thấy rằng nồng độ ccfDNA tan máu trung bình ở vẹm nằm trong phạm vi microgam/ml tan máu thấp (xem Bảng S2, Thông tin bổ sung).Phạm vi nồng độ này lớn hơn nhiều so với ở người khỏe mạnh (thấp nanogam trên mililit), nhưng trong một số trường hợp hiếm hoi, ở bệnh nhân ung thư, mức ccfDNA có thể đạt tới vài microgam trên mililit [34, 35].Một phân tích về sự phân bố kích thước của ccfDNA tan máu cho thấy những đoạn này có kích thước khác nhau rất nhiều, nằm trong khoảng từ 1000 bp đến 1000 bp.lên đến 5000 bp (Hình 2).Các kết quả tương tự cũng thu được khi sử dụng QIAamp Investigator Kit dựa trên silica, một phương pháp thường được sử dụng trong khoa học pháp y để nhanh chóng phân lập và tinh chế DNA bộ gen từ các mẫu DNA nồng độ thấp, bao gồm cả ccfDNA [36].
Điện di ccfDNA đại diện của tan máu trai.Được chiết xuất bằng Bộ huyết tương NucleoSnap (trên cùng) và Bộ điều tra DNA QIAamp.Biểu đồ violon B cho thấy sự phân bố nồng độ ccfDNA tan máu (±SE) ở vẹm.Các đường màu đen và đỏ tương ứng đại diện cho phần tư trung bình và phần tư thứ nhất và thứ ba.
Khoảng 1% ccfDNA ở người và động vật linh trưởng có nguồn gốc ngoại lai [21, 37].Với hệ thống tuần hoàn bán mở của hai mảnh vỏ, nước biển giàu vi sinh vật và sự phân bố kích thước của ccfDNA vẹm, chúng tôi đã đưa ra giả thuyết rằng ccfDNA tan máu vẹm có thể chứa một lượng DNA vi khuẩn phong phú và đa dạng.Để kiểm tra giả thuyết này, chúng tôi đã giải trình tự ccfDNA tan máu từ các mẫu Aulacomya atra được thu thập từ Quần đảo Kerguelen, thu được hơn 10 triệu lượt đọc, 97,6% trong số đó đã vượt qua kiểm soát chất lượng.Các bài đọc sau đó được phân loại theo các nguồn tự và không tự sử dụng cơ sở dữ liệu hai mảnh vỏ BLASTN và NCBI (Hình S1, Thông tin bổ sung).
Ở người, cả DNA hạt nhân và ty thể đều có thể được giải phóng vào máu [38].Tuy nhiên, trong nghiên cứu hiện tại, không thể mô tả chi tiết DNA bộ gen hạt nhân của vẹm, do bộ gen A. atra chưa được giải trình tự hoặc mô tả.Tuy nhiên, chúng tôi có thể xác định một số đoạn ccfDNA có nguồn gốc từ chính chúng tôi bằng thư viện hai mảnh vỏ (Hình S2, Thông tin bổ sung).Chúng tôi cũng xác nhận sự hiện diện của các đoạn DNA có nguồn gốc từ chính chúng tôi bằng cách khuếch đại PCR trực tiếp các gen A. atra đã được giải trình tự (Hình 3).Tương tự, do bộ gen của ty thể A. atra có sẵn trong cơ sở dữ liệu công cộng, người ta có thể tìm thấy bằng chứng về sự hiện diện của các đoạn ccfDNA của ty thể trong tan máu của A. atra.Sự hiện diện của các đoạn DNA ty thể đã được xác nhận bằng khuếch đại PCR (Hình 3).
Nhiều gen ty thể khác nhau đã có mặt trong tan máu của A. atra (chấm đỏ – số chứng khoán: SRX5705969) và M. platensis (chấm xanh lam – số chứng khoán: SRX5705968) được khuếch đại bằng PCR.Hình phỏng theo Breton và cộng sự, 2011 B Khuếch đại dịch nổi tan máu từ A. atra Được lưu trữ trên giấy FTA.Sử dụng đục lỗ 3 mm để thêm trực tiếp vào ống PCR chứa hỗn hợp PCR.
Với hàm lượng vi sinh vật phong phú trong nước biển, ban đầu chúng tôi tập trung vào đặc tính của trình tự DNA vi sinh vật trong tan máu.Để làm điều này, chúng tôi sử dụng hai chiến lược khác nhau.Chiến lược đầu tiên sử dụng Kraken2, một chương trình phân loại trình tự dựa trên thuật toán có thể xác định trình tự vi sinh vật với độ chính xác tương đương với BLAST và các công cụ khác [28].Hơn 6719 lượt đọc được xác định là có nguồn gốc từ vi khuẩn, trong khi 124 và 64 lần lượt là từ vi khuẩn cổ và vi rút (Hình 4).Các đoạn DNA vi khuẩn phong phú nhất là Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) và Bacteroidetes (17%) (Hình 4a).Sự phân bố này phù hợp với các nghiên cứu trước đây về hệ vi sinh vật biển của vẹm xanh [39, 40].Gammaproteobacteria là lớp Proteobacteria chính (44%), bao gồm nhiều Vibrionales (Hình 4b).Phương pháp ddPCR đã xác nhận sự hiện diện của các đoạn DNA Vibrio trong ccfDNA của A. atra tan máu (Hình 4c) [41].Để có thêm thông tin về nguồn gốc vi khuẩn của ccfDNA, một phương pháp bổ sung đã được thực hiện (Hình S2, Thông tin bổ sung). Trong trường hợp này, các lần đọc chồng chéo được tập hợp thành các lần đọc kết thúc ghép nối và được phân loại là có nguồn gốc tự thân (hai mảnh vỏ) hoặc không phải của chính mình bằng cách sử dụng BLASTN và giá trị e là 1e−3 và điểm cắt có tương đồng >90%. Trong trường hợp này, các lần đọc chồng chéo được tập hợp thành các lần đọc kết thúc ghép nối và được phân loại là có nguồn gốc tự thân (hai mảnh vỏ) hoặc không phải của chính mình bằng cách sử dụng BLASTN và giá trị e là 1e−3 và điểm cắt có tương đồng >90%. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были к лассифицированы как собственные (двустворчатые моллюски) hay còn gọi là с испок ьзованием BLASTN và значения e 1e-3 và отсечения с гомологией> 90%. Trong trường hợp này, các lần đọc trùng lặp được thu thập dưới dạng các lần đọc kết thúc theo cặp và được phân loại là bản địa (hai mảnh vỏ) hoặc không phải bản gốc bằng cách sử dụng BLASTN và giá trị e là 1e-3 và bị cắt với tương đồng> 90%.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值和>90% 同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在这种情况下，重叠读数组装为配末端读数，使用使用使用 blastn和1e-3的的值和>90% 同源性的分类自身（双壳类）非自身。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классиф ицированы как собственные (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с испоЎ ьзованием значений e BLASTN и 1e-3 và порога гомологии> 90%. Trong trường hợp này, các lần đọc chồng chéo được thu thập dưới dạng các lần đọc kết thúc theo cặp và được phân loại là riêng (hai mảnh vỏ) hoặc không nguyên bản bằng cách sử dụng các giá trị e BLASTN và 1e-3 và ngưỡng tương đồng >90%.Do bộ gen của A. atra chưa được giải trình tự nên chúng tôi đã sử dụng chiến lược lắp ráp de novo của trình biên dịch MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS).Tổng cộng có 147.188 nhóm đã được xác định là phụ thuộc (hai mảnh vỏ) có nguồn gốc.Các đường viền này sau đó đã được phát nổ với các giá trị điện tử là 1e-10 bằng BLASTN và BLASTX.Chiến lược này cho phép chúng tôi xác định 482 đoạn không phải hai mảnh vỏ có trong A. atra ccfDNA.Hơn một nửa (57%) các đoạn DNA này được lấy từ vi khuẩn, chủ yếu từ các loài cộng sinh ở mang, bao gồm các loài cộng sinh sulfotrophic và từ các loài cộng sinh ở mang Solemya velum (Hình 5).
Độ phong phú tương đối ở cấp độ loại.B Đa dạng vi sinh vật của hai ngành chính (Firmicutes và Proteobacteria).Khuếch đại đại diện của ddPCR C Vibrio spp.A. Các đoạn gen 16S rRNA (màu xanh) trong ba thể tan máu atra.
Tổng cộng có 482 đường viền được thu thập đã được phân tích.Hồ sơ chung về phân phối phân loại của các chú thích tiếp giáp metagenomic (sinh vật nhân sơ và sinh vật nhân chuẩn).B Phân phối chi tiết các đoạn DNA của vi khuẩn được xác định bởi BLASTN và BLASTX.
Phân tích Kraken2 cũng cho thấy ccfDNA của vẹm chứa các đoạn DNA lưu trữ, bao gồm các đoạn DNA của Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) và Thaurmarcheota (11%) (Hình 6a).Sự hiện diện của các đoạn DNA có nguồn gốc từ Euryarchaeota và Crenarchaeota, trước đây được tìm thấy trong cộng đồng vi sinh vật của trai California, không có gì đáng ngạc nhiên [42].Mặc dù Euryarchaeota thường liên quan đến các điều kiện khắc nghiệt, nhưng hiện nay người ta đã nhận ra rằng cả Euryarchaeota và Crenarcheota đều là những sinh vật nhân sơ phổ biến nhất trong môi trường đông lạnh ở biển [43, 44].Sự hiện diện của các vi sinh vật sinh mêtan trong trai không có gì đáng ngạc nhiên, dựa trên các báo cáo gần đây về sự rò rỉ khí mêtan trên diện rộng từ các vết rò rỉ dưới đáy Cao nguyên Kerguelen [45] và khả năng sinh khí mêtan do vi sinh vật có thể được quan sát thấy ngoài khơi Quần đảo Kerguelen [46].
Sự chú ý của chúng tôi sau đó chuyển sang đọc DNA của virus.Theo hiểu biết tốt nhất của chúng tôi, đây là nghiên cứu ngoài mục tiêu đầu tiên về hàm lượng vi rút trong trai.Đúng như dự đoán, chúng tôi đã tìm thấy các đoạn DNA của thể thực khuẩn (Caudovirales) (Hình 6b).Tuy nhiên, DNA của vi-rút phổ biến nhất đến từ một loại vi-rút nucleocytovirus, còn được gọi là vi-rút DNA lớn tế bào chất ở nhân (NCLDV), có bộ gen lớn nhất so với bất kỳ loại vi-rút nào.Trong ngành này, hầu hết các trình tự DNA thuộc về các họ Mimimidoviridae (58%) và Poxviridae (21%), có vật chủ tự nhiên bao gồm động vật có xương sống và động vật chân đốt, trong khi một tỷ lệ nhỏ các trình tự DNA này thuộc về tảo virus đã biết.Nhiễm tảo sinh vật nhân chuẩn biển.Các trình tự này cũng thu được từ virus Pandora, loại virus khổng lồ có kích thước bộ gen lớn nhất trong số các loại virus đã biết.Thật thú vị, phạm vi vật chủ được biết là bị nhiễm vi-rút, được xác định bằng trình tự ccfDNA tan máu, là tương đối lớn (Hình S3, Thông tin bổ sung).Nó bao gồm các loại virus lây nhiễm côn trùng như Baculoviridae và Iridoviridae, cũng như các loại virus lây nhiễm amip, tảo và động vật có xương sống.Chúng tôi cũng tìm thấy các trình tự phù hợp với bộ gen Pithovirus sibericum.Pitoviruses (còn được gọi là “virus zombie”) lần đầu tiên được phân lập từ lớp băng vĩnh cửu 30.000 năm tuổi ở Siberia [47].Do đó, kết quả của chúng tôi phù hợp với các báo cáo trước đây cho thấy rằng không phải tất cả các loài vi-rút hiện đại này đều đã tuyệt chủng [48] và những vi-rút này có thể có mặt trong các hệ sinh thái biển cận Bắc Cực xa xôi.
Cuối cùng, chúng tôi đã kiểm tra xem liệu chúng tôi có thể tìm thấy các đoạn DNA từ các động vật đa bào khác hay không.Tổng cộng có 482 nhánh nước ngoài đã được xác định bởi BLASTN và BLASTX với các thư viện nt, nr và RefSeq (bộ gen và protein).Kết quả của chúng tôi cho thấy rằng trong số các đoạn ccfDNA ngoại lai của động vật đa bào, DNA của xương xương chiếm ưu thế (Hình 5).Các đoạn DNA từ côn trùng và các loài khác cũng đã được tìm thấy.Một phần tương đối lớn của các đoạn DNA chưa được xác định, có thể là do số lượng lớn các loài sinh vật biển trong cơ sở dữ liệu gen không được trình bày đầy đủ so với các loài trên cạn [49].
Trong bài báo hiện tại, chúng tôi áp dụng khái niệm LB cho vẹm, lập luận rằng trình tự bắn ccfDNA tan máu có thể cung cấp cái nhìn sâu sắc về thành phần của các hệ sinh thái ven biển.Cụ thể, chúng tôi phát hiện ra rằng 1) tan máu vẹm chứa nồng độ tương đối cao (mức microgam) của các đoạn DNA tuần hoàn tương đối lớn (~ 1-5 kb);2) các đoạn DNA này đều độc lập và không độc lập 3) Trong số các nguồn ngoại lai của các đoạn DNA này, chúng tôi đã tìm thấy DNA của vi khuẩn, vi khuẩn cổ và vi rút, cũng như DNA của các động vật đa bào khác;4) Sự tích tụ của các đoạn ccfDNA ngoại lai này trong tan máu xảy ra nhanh chóng và góp phần vào hoạt động lọc bên trong của trai.Tóm lại, nghiên cứu của chúng tôi chứng minh rằng khái niệm LB, cho đến nay chủ yếu được áp dụng trong lĩnh vực y sinh, mã hóa một nguồn kiến ​​thức phong phú nhưng chưa được khám phá có thể được sử dụng để hiểu rõ hơn về sự tương tác giữa các loài trọng điểm và môi trường của chúng.
Ngoài các loài linh trưởng, sự phân lập ccfDNA đã được báo cáo ở động vật có vú, bao gồm chuột, chó, mèo và ngựa [50, 51, 52].Tuy nhiên, theo hiểu biết của chúng tôi, nghiên cứu của chúng tôi là nghiên cứu đầu tiên báo cáo việc phát hiện và giải trình tự ccfDNA ở các loài sinh vật biển có hệ thống tuần hoàn mở.Đặc điểm giải phẫu và khả năng lọc này của vẹm có thể, ít nhất một phần, giải thích các đặc điểm kích thước khác nhau của các đoạn DNA lưu hành so với các loài khác.Ở người, hầu hết các đoạn DNA lưu thông trong máu là những đoạn nhỏ có kích thước từ 150 đến 200 bp.với cực đại là 167 bp [34, 53].Một phần nhỏ nhưng đáng kể của các đoạn DNA có kích thước từ 300 đến 500 bp và khoảng 5% dài hơn 900 bp.[54].Lý do cho sự phân bố kích thước này là nguồn ccfDNA chính trong huyết tương xảy ra do chết tế bào, do chết tế bào hoặc do hoại tử của các tế bào tạo máu lưu hành ở những người khỏe mạnh hoặc do quá trình chết theo chương trình của các tế bào khối u ở bệnh nhân ung thư (được gọi là DNA khối u lưu hành)., ctADN).Sự phân bố kích thước của ccfDNA tan máu mà chúng tôi tìm thấy ở vẹm dao động từ 1000 đến 5000 bp, cho thấy rằng ccfDNA của vẹm có nguồn gốc khác.Đây là một giả thuyết hợp lý, vì vẹm có hệ thống mạch bán mở và sống trong môi trường nước biển có chứa nồng độ cao DNA bộ gen của vi sinh vật.Trên thực tế, các thí nghiệm trong phòng thí nghiệm của chúng tôi sử dụng DNA ngoại sinh đã chỉ ra rằng trai tích lũy các đoạn DNA trong nước biển, ít nhất sau vài giờ chúng sẽ bị phân hủy sau khi tế bào hấp thu và/hoặc giải phóng và/hoặc lưu trữ trong các tổ chức khác nhau.Do sự hiếm có của các tế bào (cả sinh vật nhân sơ và sinh vật nhân chuẩn), việc sử dụng các ngăn nội bào sẽ làm giảm lượng ccfDNA từ các nguồn tự thân cũng như từ các nguồn ngoại lai.Xem xét tầm quan trọng của khả năng miễn dịch bẩm sinh hai mảnh vỏ và số lượng lớn các thực bào lưu hành, chúng tôi đã đưa ra giả thuyết thêm rằng ngay cả ccfDNA ngoại lai cũng được làm giàu trong các thực bào lưu hành tích lũy DNA ngoại lai khi ăn vi sinh vật và / hoặc các mảnh vụn của tế bào.Kết hợp lại với nhau, kết quả của chúng tôi cho thấy rằng ccfDNA tan máu hai mảnh vỏ là một kho lưu trữ thông tin phân tử duy nhất và củng cố vị thế của chúng như một loài trọng điểm.
Dữ liệu của chúng tôi chỉ ra rằng việc giải trình tự và phân tích các đoạn ccfDNA tan máu có nguồn gốc từ vi khuẩn có thể cung cấp thông tin chính về hệ vi khuẩn vật chủ và vi khuẩn có trong hệ sinh thái biển xung quanh.Các kỹ thuật giải trình tự bắn đã tiết lộ các trình tự của vi khuẩn cộng sinh A. atra mang sẽ bị bỏ sót nếu các phương pháp xác định 16S rRNA thông thường được sử dụng, một phần là do sai lệch của thư viện tham khảo.Trên thực tế, việc chúng tôi sử dụng dữ liệu LB được thu thập từ M. platensis trong cùng một lớp vẹm ở Kerguelen cho thấy thành phần của các cộng sinh vi khuẩn liên quan đến mang là giống nhau đối với cả hai loài vẹm (Hình S4, Thông tin bổ sung).Sự giống nhau này của hai loài trai khác nhau về mặt di truyền có thể phản ánh thành phần của cộng đồng vi khuẩn trong các trầm tích lạnh, lưu huỳnh và núi lửa của Kerguelen [55, 56, 57, 58].Mức độ vi sinh vật khử lưu huỳnh cao hơn đã được mô tả rõ ràng khi thu hoạch vẹm từ các vùng ven biển bị xáo trộn sinh học [59], chẳng hạn như bờ biển Port-au-France.Một khả năng khác là hệ vi sinh vật trai có thể bị ảnh hưởng bởi sự lan truyền ngang [60, 61].Cần có nhiều nghiên cứu hơn để xác định mối tương quan giữa môi trường biển, bề mặt đáy biển và thành phần vi khuẩn cộng sinh trong trai.Những nghiên cứu này hiện đang được tiến hành.
Độ dài và nồng độ ccfDNA của hemolymph, khả năng tinh chế dễ dàng và chất lượng cao để cho phép giải trình tự nhanh chóng bằng súng ngắn là một số lợi thế của việc sử dụng ccfDNA của vẹm để đánh giá đa dạng sinh học trong các hệ sinh thái ven biển.Cách tiếp cận này đặc biệt hiệu quả để mô tả các cộng đồng vi rút (virome) trong một hệ sinh thái nhất định [62, 63].Không giống như vi khuẩn, vi khuẩn cổ và sinh vật nhân chuẩn, bộ gen của virus không chứa các gen được bảo tồn phát sinh loài như trình tự 16S.Kết quả của chúng tôi chỉ ra rằng sinh thiết lỏng từ các loài chỉ thị như trai có thể được sử dụng để xác định số lượng tương đối lớn các đoạn vi rút ccfDNA được biết là lây nhiễm các vật chủ thường sống trong hệ sinh thái biển ven biển.Điều này bao gồm các vi-rút được biết là lây nhiễm động vật nguyên sinh, động vật chân đốt, côn trùng, thực vật và vi-rút vi khuẩn (ví dụ: thể thực khuẩn).Một phân phối tương tự đã được tìm thấy khi chúng tôi kiểm tra virome ccfDNA tan máu của vẹm xanh (M. platensis) được thu thập trong cùng một lớp vẹm tại Kerguelen (Bảng S2, Thông tin bổ sung).Trình tự shotgun của ccfDNA thực sự là một cách tiếp cận mới đạt được động lực trong nghiên cứu về virome của con người hoặc các loài khác [21, 37, 64].Cách tiếp cận này đặc biệt hữu ích để nghiên cứu virus DNA sợi kép, vì không có gen đơn lẻ nào được bảo tồn trong số tất cả các virus DNA sợi kép, đại diện cho loại virus đa dạng và rộng nhất ở Baltimore [65].Mặc dù hầu hết các loại vi-rút này vẫn chưa được phân loại và có thể bao gồm các vi-rút từ một phần hoàn toàn chưa được biết đến của thế giới vi-rút [66], nhưng chúng tôi phát hiện ra rằng virome và phạm vi vật chủ của vẹm A. atra và M. platensis rơi vào khoảng giữa hai loài.tương tự (xem hình S3, thông tin bổ sung).Sự giống nhau này không có gì đáng ngạc nhiên, vì nó có thể phản ánh sự thiếu chọn lọc trong việc hấp thu DNA có trong môi trường.Các nghiên cứu trong tương lai sử dụng RNA tinh khiết hiện đang cần thiết để mô tả RNA virome.
Trong nghiên cứu của chúng tôi, chúng tôi đã sử dụng một quy trình rất nghiêm ngặt được điều chỉnh từ công trình của Kowarski và các đồng nghiệp [37], những người đã sử dụng thao tác xóa hai bước đối với các lần đọc và đường viền gộp trước và sau khi lắp ráp ccfDNA gốc, dẫn đến tỷ lệ cao các lần đọc không được ánh xạ.Do đó, chúng tôi không thể loại trừ rằng một số lần đọc chưa được lập bản đồ này vẫn có thể có nguồn gốc riêng, chủ yếu là do chúng tôi không có bộ gen tham chiếu cho loài vẹm này.Chúng tôi cũng đã sử dụng quy trình này vì chúng tôi lo ngại về các khả năng tiềm ẩn giữa các lần tự đọc và không tự đọc cũng như độ dài đọc do Illumina MiSeq PE75 tạo ra.Một lý do khác cho phần lớn các bài đọc chưa được lập bản đồ là phần lớn vi khuẩn biển, đặc biệt là ở các vùng xa xôi như Kerguelen, chưa được chú thích.Chúng tôi đã sử dụng Illumina MiSeq PE75, giả sử độ dài đoạn ccfDNA tương tự như ccfDNA của con người.Đối với các nghiên cứu trong tương lai, dựa trên kết quả của chúng tôi cho thấy rằng ccfDNA tan máu có thời gian đọc lâu hơn so với người và/hoặc động vật có vú, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng một nền tảng giải trình tự phù hợp hơn cho các đoạn ccfDNA dài hơn.Thực hành này sẽ giúp dễ dàng xác định nhiều dấu hiệu hơn để phân tích sâu hơn.Việc có được trình tự bộ gen hạt nhân A. atra hoàn chỉnh hiện không có sẵn cũng sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho việc phân biệt ccfDNA từ các nguồn tự thân và không tự thân.Cho rằng nghiên cứu của chúng tôi tập trung vào khả năng áp dụng khái niệm sinh thiết lỏng cho vẹm, chúng tôi hy vọng rằng khi khái niệm này được sử dụng trong nghiên cứu trong tương lai, các công cụ và quy trình mới sẽ được phát triển để tăng tiềm năng của phương pháp này trong việc nghiên cứu sự đa dạng vi sinh vật của vẹm.hệ sinh thái biển.
Là một dấu ấn sinh học lâm sàng không xâm lấn, nồng độ ccfDNA trong huyết tương của con người tăng cao có liên quan đến các bệnh khác nhau, tổn thương mô và tình trạng căng thẳng [67,68,69].Sự gia tăng này có liên quan đến việc giải phóng các đoạn DNA có nguồn gốc riêng sau khi mô bị tổn thương.Chúng tôi đã giải quyết vấn đề này bằng cách sử dụng ứng suất nhiệt cấp tính, trong đó vẹm tiếp xúc với nhiệt độ 30°C trong thời gian ngắn.Chúng tôi đã thực hiện phân tích này trên ba loại hến khác nhau trong ba thí nghiệm độc lập.Tuy nhiên, chúng tôi không tìm thấy bất kỳ thay đổi nào về mức độ ccfDNA sau khi bị stress nhiệt cấp tính (xem Hình S5, thông tin bổ sung).Phát hiện này có thể giải thích, ít nhất một phần, thực tế là vẹm có hệ thống tuần hoàn bán mở và tích lũy một lượng lớn DNA ngoại lai do hoạt động lọc cao của chúng.Mặt khác, vẹm, giống như nhiều động vật không xương sống, có thể chống lại tổn thương mô do căng thẳng gây ra tốt hơn, do đó hạn chế việc giải phóng ccfDNA trong tan máu của chúng [70, 71].
Cho đến nay, phân tích DNA về đa dạng sinh học trong các hệ sinh thái dưới nước chủ yếu tập trung vào siêu mã hóa DNA môi trường (eDNA).Tuy nhiên, phương pháp này thường bị hạn chế trong phân tích đa dạng sinh học khi sử dụng mồi.Việc sử dụng giải trình tự shotgun tránh được những hạn chế của PCR và sự lựa chọn sai lệch của các bộ mồi.Do đó, theo một nghĩa nào đó, phương pháp của chúng tôi gần với phương pháp giải trình tự eDNA Shotgun thông lượng cao được sử dụng gần đây, phương pháp này có thể giải trình tự trực tiếp DNA bị phân mảnh và phân tích hầu hết tất cả các sinh vật [72, 73].Tuy nhiên, có một số vấn đề cơ bản giúp phân biệt LB với các phương pháp eDNA tiêu chuẩn.Tất nhiên, sự khác biệt chính giữa eDNA và LB là việc sử dụng các máy chủ bộ lọc tự nhiên.Việc sử dụng các loài sinh vật biển như bọt biển và động vật hai mảnh vỏ (Dresseina spp.) làm bộ lọc tự nhiên để nghiên cứu eDNA đã được báo cáo [74, 75].Tuy nhiên, nghiên cứu của Dreissena đã sử dụng sinh thiết mô để chiết xuất DNA.Phân tích ccfDNA từ LB không yêu cầu sinh thiết mô, thiết bị chuyên dụng và đôi khi đắt tiền cũng như hậu cần liên quan đến eDNA hoặc sinh thiết mô.Trên thực tế, gần đây chúng tôi đã báo cáo rằng ccfDNA từ LB có thể được lưu trữ và phân tích với sự hỗ trợ của FTA mà không cần duy trì chuỗi lạnh, đây là một thách thức lớn đối với nghiên cứu ở các vùng sâu vùng xa [76].Việc trích xuất ccfDNA từ sinh thiết lỏng cũng đơn giản và cung cấp DNA chất lượng cao để giải trình tự shotgun và phân tích PCR.Đây là một lợi thế lớn do một số hạn chế kỹ thuật liên quan đến phân tích eDNA [77].Tính đơn giản và chi phí thấp của phương pháp lấy mẫu cũng đặc biệt thích hợp cho các chương trình giám sát dài hạn.Ngoài khả năng lọc cao, một đặc điểm nổi tiếng khác của động vật hai mảnh vỏ là thành phần hóa học mucopolysacarit trong chất nhầy của chúng, giúp thúc đẩy sự hấp thụ vi rút [78, 79].Điều này làm cho hai mảnh vỏ trở thành bộ lọc tự nhiên lý tưởng để mô tả đặc điểm đa dạng sinh học và tác động của biến đổi khí hậu trong một hệ sinh thái thủy sinh nhất định.Mặc dù sự hiện diện của các đoạn DNA có nguồn gốc từ vật chủ có thể được coi là một hạn chế của phương pháp so với eDNA, nhưng chi phí liên quan đến việc có một ccfDNA tự nhiên như vậy so với eDNA đồng thời có thể hiểu được đối với lượng thông tin khổng lồ có sẵn cho các nghiên cứu về sức khỏe.máy chủ bù đắp.Điều này bao gồm sự hiện diện của các trình tự virus được tích hợp vào bộ gen của vật chủ ký chủ.Điều này đặc biệt quan trọng đối với trai, do sự hiện diện của các retrovirus gây bệnh bạch cầu lây truyền theo chiều ngang ở động vật hai mảnh vỏ [80, 81].Một ưu điểm khác của LB so với eDNA là nó khai thác hoạt động thực bào của các tế bào máu lưu thông trong tan máu, nơi hấp thụ các vi sinh vật (và bộ gen của chúng).Thực bào là chức năng chính của tế bào máu ở hai mảnh vỏ [82].Cuối cùng, phương pháp này tận dụng khả năng lọc cao của trai (trung bình 1,5 l/h nước biển) và tuần hoàn hai ngày, làm tăng sự pha trộn của các lớp nước biển khác nhau, cho phép thu giữ eDNA dị loại.[83, 84].Do đó, phân tích ccfDNA của trai là một con đường thú vị dựa trên các tác động về dinh dưỡng, kinh tế và môi trường của trai.Tương tự như phân tích LB thu thập từ người, phương pháp này cũng mở ra khả năng đo lường những thay đổi di truyền và biểu sinh trong DNA vật chủ để đáp ứng với các chất ngoại sinh.Ví dụ, các công nghệ giải trình tự thế hệ thứ ba có thể được dự kiến ​​để thực hiện phân tích quá trình methyl hóa trên toàn bộ gen trong ccfDNA bản địa bằng cách sử dụng giải trình tự nanopore.Quá trình này nên được tạo điều kiện thuận lợi bởi thực tế là độ dài của các đoạn ccfDNA của vẹm tương thích lý tưởng với các nền tảng giải trình tự đọc dài cho phép phân tích quá trình methyl hóa DNA trên toàn bộ gen từ một lần chạy giải trình tự mà không cần biến đổi hóa học.85,86] Đây là một khả năng thú vị, vì người ta đã chứng minh rằng các kiểu methyl hóa DNA phản ánh phản ứng với áp lực môi trường và tồn tại qua nhiều thế hệ.Do đó, nó có thể cung cấp cái nhìn sâu sắc có giá trị về các cơ chế cơ bản chi phối phản ứng sau khi tiếp xúc với biến đổi khí hậu hoặc các chất ô nhiễm [87].Tuy nhiên, việc sử dụng LB không phải là không có giới hạn.Không cần phải nói, điều này đòi hỏi sự hiện diện của các loài chỉ thị trong hệ sinh thái.Như đã đề cập ở trên, việc sử dụng LB để đánh giá tính đa dạng sinh học của một hệ sinh thái nhất định cũng đòi hỏi một quy trình tin sinh học nghiêm ngặt có tính đến sự hiện diện của các đoạn DNA từ nguồn.Một vấn đề lớn khác là sự sẵn có của bộ gen tham chiếu cho các loài sinh vật biển.Hy vọng rằng các sáng kiến ​​như Dự án bộ gen động vật có vú ở biển và dự án Fish10k được thành lập gần đây [88] sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho việc phân tích như vậy trong tương lai.Việc áp dụng khái niệm LB cho các sinh vật ăn bộ lọc ở biển cũng tương thích với những tiến bộ mới nhất trong công nghệ giải trình tự, làm cho nó phù hợp để phát triển các dấu ấn sinh học đa ohm nhằm cung cấp thông tin quan trọng về sức khỏe của môi trường sống biển để đối phó với áp lực môi trường.
Dữ liệu giải trình tự bộ gen đã được gửi vào Kho lưu trữ đọc trình tự NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 trong Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Tác động của biến đổi khí hậu đối với hệ sinh thái và sinh vật biển.Sinh học Cole.2009;19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al.Xem xét các tác động kết hợp của biến đổi khí hậu và các tác nhân gây căng thẳng cục bộ khác đối với môi trường biển.môi trường khoa học nói chung.2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al.).Khoa học ngày đầu tiên của tháng ba.2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Giảm khả năng chịu nhiệt trong các điều kiện căng thẳng nhiệt lặp đi lặp lại giải thích tỷ lệ tử vong cao của vẹm xanh vào mùa hè.Báo cáo khoa học 2019;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al.Những thay đổi gần đây về tần suất, nguyên nhân và mức độ tử vong của động vật.Proc Natl Acad Sci Hoa Kỳ.2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al.Nhiều tác nhân gây bệnh không đặc hiệu cho loài có thể đã gây ra cái chết hàng loạt của Pinna nobilis.Mạng sống.2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM.Tác động tiềm tàng của biến đổi khí hậu đối với các bệnh lây truyền từ động vật sang Bắc Cực.Int J Sức khỏe vòng tròn.2005;64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. và cộng sự.Vẹm xanh (Mytilus edulis spp.) là sinh vật tín hiệu trong giám sát ô nhiễm ven biển: đánh giá.Tháng 3 Môi trường Res 2017;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Tích hợp sinh thiết lỏng trong điều trị ung thư.Nat Rev Clean Oncol.2017;14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al.Trưởng thành sinh thiết lỏng: Cho phép DNA khối u lưu thông.Ung thư Nat Rev.2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Axit nucleic trong huyết tương người.Biên bản họp các công ty con của Soc Biol.1948;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Một vai trò mới đối với DNA không có tế bào như là một dấu hiệu phân tử để điều trị ung thư.Định lượng phân tích biomol.2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Sinh thiết lỏng đi vào phòng khám – các vấn đề triển khai và thách thức trong tương lai.Nat Rev Clin Oncol.2021;18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW và những người khác.DNA của thai nhi có trong huyết tương và huyết thanh của mẹ.lưỡi giáo.1997;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Nghiên cứu quá trình mang thai và các biến chứng của nó bằng cách sử dụng RNA ngoại bào tuần hoàn trong máu của phụ nữ khi mang thai.khoa nhi.2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al.Sinh thiết lỏng: DNA không có tế bào của người hiến tặng được sử dụng để phát hiện các tổn thương dị sinh trong ghép thận.Nat Rev Nephrol.2021;17:591–603.
Juan FC, Lo YM Những đổi mới trong chẩn đoán trước khi sinh: giải trình tự bộ gen huyết tương của mẹ.Anna MD.2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al.Phát hiện mầm bệnh nhanh chóng với trình tự metagenomic thế hệ tiếp theo của chất dịch cơ thể bị nhiễm bệnh.Thuốc Nat.2021;27:115-24.