Cảm ơn bạn đã ghé thăm Nature.com. Phiên bản trình duyệt bạn đang sử dụng có hỗ trợ CSS hạn chế. Để có trải nghiệm tốt nhất, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng trình duyệt đã cập nhật (hoặc tắt Chế độ tương thích trong Internet Explorer). Trong thời gian chờ đợi, để đảm bảo hỗ trợ liên tục, chúng tôi sẽ hiển thị trang web mà không có kiểu dáng và JavaScript.
Sinh thiết lỏng (LB) là một khái niệm đang nhanh chóng trở nên phổ biến trong lĩnh vực y sinh. Khái niệm này chủ yếu dựa trên việc phát hiện các mảnh DNA ngoại bào lưu thông (ccfDNA), chủ yếu được giải phóng dưới dạng các mảnh nhỏ sau khi tế bào chết trong nhiều mô khác nhau. Một tỷ lệ nhỏ các mảnh này có nguồn gốc từ các mô hoặc sinh vật lạ (ngoại lai). Trong công trình hiện tại, chúng tôi đã áp dụng khái niệm này cho trai, một loài canh gác được biết đến với khả năng lọc nước biển cao. Chúng tôi sử dụng khả năng hoạt động như bộ lọc tự nhiên của trai để thu thập các mảnh DNA môi trường từ nhiều nguồn khác nhau nhằm cung cấp thông tin về đa dạng sinh học của các hệ sinh thái ven biển. Kết quả của chúng tôi cho thấy huyết tương trai chứa các mảnh DNA có kích thước thay đổi rất nhiều, từ 1 đến 5 kb. Giải trình tự shotgun cho thấy một số lượng lớn các mảnh DNA có nguồn gốc từ vi khuẩn lạ. Trong số đó, chúng tôi tìm thấy các mảnh DNA từ vi khuẩn, vi khuẩn cổ và vi-rút, bao gồm cả vi-rút được biết là lây nhiễm cho nhiều loại vật chủ thường thấy trong các hệ sinh thái biển ven biển. Tóm lại, nghiên cứu của chúng tôi chứng minh rằng khái niệm LB áp dụng cho trai là nguồn kiến ​​thức phong phú nhưng chưa được khám phá về sự đa dạng vi khuẩn trong hệ sinh thái ven biển.
Tác động của biến đổi khí hậu (CC) đến đa dạng sinh học của các hệ sinh thái biển là một lĩnh vực nghiên cứu đang phát triển nhanh chóng. Sự nóng lên toàn cầu không chỉ gây ra những căng thẳng sinh lý quan trọng mà còn đẩy giới hạn tiến hóa của sự ổn định nhiệt của các sinh vật biển, ảnh hưởng đến môi trường sống của một số loài, thúc đẩy chúng tìm kiếm những điều kiện thuận lợi hơn [1, 2]. Ngoài việc ảnh hưởng đến đa dạng sinh học của động vật đa bào, CC phá vỡ sự cân bằng tinh tế của tương tác vật chủ-vi khuẩn. Tình trạng loạn khuẩn vi khuẩn này gây ra mối đe dọa nghiêm trọng đối với các hệ sinh thái biển vì nó khiến các sinh vật biển dễ bị các mầm bệnh truyền nhiễm hơn [3, 4]. Người ta tin rằng SS đóng vai trò quan trọng trong các vụ chết hàng loạt, đây là một vấn đề nghiêm trọng đối với việc quản lý các hệ sinh thái biển toàn cầu [5, 6]. Đây là một vấn đề quan trọng xét đến tác động kinh tế, sinh thái và dinh dưỡng của nhiều loài sinh vật biển. Điều này đặc biệt đúng đối với các loài hai mảnh vỏ sống ở các vùng cực, nơi tác động của CK tức thời và nghiêm trọng hơn [6, 7]. Trên thực tế, các loài hai mảnh vỏ như Mytilus spp. được sử dụng rộng rãi để theo dõi tác động của CC đối với các hệ sinh thái biển. Không có gì ngạc nhiên khi một số lượng tương đối lớn các dấu ấn sinh học đã được phát triển để theo dõi sức khỏe của chúng, thường sử dụng phương pháp tiếp cận hai tầng liên quan đến các dấu ấn sinh học chức năng dựa trên hoạt động của enzym hoặc các chức năng của tế bào như khả năng sống của tế bào và hoạt động thực bào [8]. Các phương pháp này cũng bao gồm việc đo nồng độ các chỉ số áp suất cụ thể tích tụ trong các mô mềm sau khi hấp thụ một lượng lớn nước biển. Tuy nhiên, khả năng lọc cao và hệ tuần hoàn bán hở của nhuyễn thể hai mảnh vỏ tạo cơ hội để phát triển các dấu ấn sinh học huyết tương mới bằng cách sử dụng khái niệm sinh thiết lỏng (LB), một phương pháp tiếp cận đơn giản và ít xâm lấn để quản lý bệnh nhân. mẫu máu [9, 10]. Mặc dù có thể tìm thấy một số loại phân tử lưu thông trong LB của con người, nhưng khái niệm này chủ yếu dựa trên phân tích trình tự DNA của các đoạn DNA ngoại bào lưu thông (ccfDNA) trong huyết tương. Trên thực tế, sự hiện diện của DNA lưu thông trong huyết tương của con người đã được biết đến từ giữa thế kỷ 20 [11], nhưng chỉ trong những năm gần đây, sự ra đời của các phương pháp giải trình tự thông lượng cao mới dẫn đến chẩn đoán lâm sàng dựa trên ccfDNA. Sự hiện diện của các đoạn DNA lưu thông này một phần là do sự giải phóng thụ động DNA bộ gen (nhân và ty thể) sau khi tế bào chết. Ở những người khỏe mạnh, nồng độ ccfDNA thường thấp (<10 ng/mL) nhưng có thể tăng gấp 5–10 lần ở những bệnh nhân mắc nhiều bệnh lý khác nhau hoặc chịu căng thẳng, dẫn đến tổn thương mô. Ở những người khỏe mạnh, nồng độ ccfDNA thường thấp (<10 ng/mL) nhưng có thể tăng gấp 5–10 lần ở những bệnh nhân mắc nhiều bệnh lý khác nhau hoặc chịu căng thẳng, dẫn đến tổn thương mô. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), không cần phải trả thêm tiền vào khoảng 5–10 tháng больных с различной патологией hoặc ли bạn có thể làm điều đó bằng cách sử dụng nó. Ở người khỏe mạnh, nồng độ cccDNA thường thấp (<10 ng/mL), nhưng có thể tăng gấp 5–10 lần ở những bệnh nhân mắc nhiều bệnh lý khác nhau hoặc bị căng thẳng dẫn đến tổn thương mô.在健康个体中,ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL).在 健康 个体 中 , ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml) 但 在 各 种 病理 或 承受 压力 患者 中 可增加 5-10 phútКонцентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены vào ngày 5-10 tháng 7 пациентов с различными патологиями hoặc или không, bạn có thể làm điều đó. Nồng độ ccfDNA thường thấp (<10 ng/ml) ở những người khỏe mạnh, nhưng có thể tăng gấp 5-10 lần ở những bệnh nhân mắc nhiều bệnh lý hoặc căng thẳng khác nhau, dẫn đến tổn thương mô.Kích thước của các đoạn ccfDNA thay đổi rất nhiều, nhưng thường nằm trong khoảng từ 150 đến 200 bp. [12]. Phân tích ccfDNA tự phát, tức là ccfDNA từ tế bào chủ bình thường hoặc đã biến đổi, có thể được sử dụng để phát hiện những thay đổi di truyền và biểu sinh có trong bộ gen hạt nhân và/hoặc ty thể, do đó giúp các bác sĩ lâm sàng lựa chọn liệu pháp nhắm mục tiêu phân tử cụ thể [13]. Tuy nhiên, ccfDNA có thể được lấy từ các nguồn lạ như ccfDNA từ tế bào thai nhi trong thời kỳ mang thai hoặc từ các cơ quan được cấy ghép [14,15,16,17]. ccfDNA cũng là một nguồn thông tin quan trọng để phát hiện sự hiện diện của axit nucleic của tác nhân truyền nhiễm (lạ), cho phép phát hiện không xâm lấn các bệnh nhiễm trùng lan rộng không được xác định bằng nuôi cấy máu, tránh sinh thiết xâm lấn mô bị nhiễm [18]. Các nghiên cứu gần đây thực sự đã chỉ ra rằng máu người chứa một nguồn thông tin phong phú có thể được sử dụng để xác định các tác nhân gây bệnh là vi-rút và vi khuẩn, và khoảng 1% ccfDNA được tìm thấy trong huyết tương người có nguồn gốc từ nước ngoài [19]. Các nghiên cứu này chứng minh rằng tính đa dạng sinh học của hệ vi sinh vật lưu thông của một sinh vật có thể được đánh giá bằng cách sử dụng phân tích ccfDNA. Tuy nhiên, cho đến gần đây, khái niệm này chỉ được sử dụng ở người và ở mức độ ít hơn ở các động vật có xương sống khác [20, 21].
Trong bài báo hiện tại, chúng tôi sử dụng thế năng LB để phân tích ccfDNA của Aulacomya atra, một loài ở phía nam thường được tìm thấy ở quần đảo Kerguelen cận Nam Cực, một nhóm đảo trên đỉnh một cao nguyên lớn hình thành cách đây 35 triệu năm. phun trào núi lửa. Sử dụng hệ thống thử nghiệm trong ống nghiệm, chúng tôi phát hiện ra rằng các mảnh DNA trong nước biển nhanh chóng được trai hấp thụ và đi vào khoang huyết tương. Giải trình tự shotgun đã chỉ ra rằng ccfDNA huyết tương của trai chứa các mảnh DNA có nguồn gốc riêng và không phải của chính nó, bao gồm vi khuẩn cộng sinh và các mảnh DNA từ các quần xã sinh vật điển hình của hệ sinh thái ven biển núi lửa lạnh. ccfDNA huyết tương cũng chứa các trình tự vi-rút có nguồn gốc từ vi-rút có phạm vi vật chủ khác nhau. Chúng tôi cũng tìm thấy các mảnh DNA từ các động vật đa bào như cá xương, hải quỳ, tảo và côn trùng. Tóm lại, nghiên cứu của chúng tôi chứng minh rằng khái niệm LB có thể được áp dụng thành công cho các loài động vật không xương sống ở biển để tạo ra một kho gen phong phú trong các hệ sinh thái biển.
Người lớn (dài 55-70 mm) Mytilus platensis (M. platensis) và Aulacomya atra (A. atra) được thu thập từ bờ biển đá gian triều của Port-au-France (049°21.235 N, 070°13.490 Đ.). Quần đảo Kerguelen vào tháng 12 năm 2018. Những con trai xanh trưởng thành khác (Mytilus spp.) được lấy từ một nhà cung cấp thương mại (PEI Mussel King Inc., Đảo Prince Edward, Canada) và được đặt trong bể sục khí được kiểm soát nhiệt độ (4°C) chứa 10–20 L nước muối nhân tạo 32‰. (muối biển nhân tạo Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, Hoa Kỳ). Đối với mỗi thí nghiệm, chiều dài và trọng lượng của từng vỏ đã được đo.
Có thể tải giao thức truy cập mở miễn phí cho chương trình này trực tuyến (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Tóm lại, huyết tương LB được thu thập từ cơ khép như mô tả [22]. Huyết tương được làm trong bằng cách ly tâm ở tốc độ 1200 × g trong 3 phút, phần dịch trong được đông lạnh (-20°C) cho đến khi sử dụng. Để phân lập và tinh chế cfDNA, các mẫu (1,5-2,0 ml) được rã đông và xử lý bằng bộ dụng cụ NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. ccfDNA được bảo quản ở -80°C cho đến khi phân tích thêm. Trong một số thí nghiệm, ccfDNA được phân lập và tinh chế bằng Bộ dụng cụ QIAamp DNA Investigator (QIAGEN, Toronto, Ontario, Canada). DNA tinh chế được định lượng bằng xét nghiệm PicoGreen tiêu chuẩn. Phân bố đoạn của ccfDNA cô lập được phân tích bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng máy phân tích sinh học Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) sử dụng Bộ DNA độ nhạy cao. Xét nghiệm được thực hiện bằng cách sử dụng 1 µl mẫu ccfDNA theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Để giải trình tự các đoạn ccfDNA huyết tương, Génome Québec (Montreal, Quebec, Canada) đã chuẩn bị các thư viện shotgun bằng bộ Illumina DNA Mix của bộ Illumina MiSeq PE75. Một bộ điều hợp chuẩn (BioO) đã được sử dụng. Các tệp dữ liệu thô có sẵn từ NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 và SRR8924809). Chất lượng đọc cơ bản đã được đánh giá bằng FastQC [23]. Trimmomatic [24] đã được sử dụng để cắt các bộ điều hợp và các lần đọc chất lượng kém. Các lần đọc shotgun với các đầu ghép được hợp nhất FLASH thành các lần đọc đơn dài hơn với độ chồng chéo tối thiểu là 20 bp để tránh sự không khớp [25]. Các lần đọc được hợp nhất đã được chú thích bằng BLASTN bằng cách sử dụng cơ sở dữ liệu Phân loại NCBI hai mảnh vỏ (giá trị e < 1e−3 và độ tương đồng 90%) và việc che giấu các trình tự có độ phức tạp thấp đã được thực hiện bằng DUST [26]. Các lần đọc được hợp nhất đã được chú thích bằng BLASTN bằng cách sử dụng cơ sở dữ liệu Phân loại NCBI hai mảnh vỏ (giá trị e < 1e−3 và độ tương đồng 90%) và việc che giấu các trình tự có độ phức tạp thấp đã được thực hiện bằng DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчатых моллюсков NCBI (значение e < 1e-3 и 90% độ ồn), một khả năng giúp loại bỏ bụi bẩn khỏi bụi [26]. Các lần đọc gộp được chú thích bằng BLASTN sử dụng cơ sở dữ liệu phân loại động vật hai mảnh vỏ của NCBI (giá trị e < 1e-3 và độ tương đồng 90%) và việc che giấu trình tự có độ phức tạp thấp được thực hiện bằng DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库(e 值< 1e-3 和90% 同源性)用BLASTN 注释合并的读数,并使用BỤI [26]进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 , 并 使用 bụi [26] 进行复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных двустворчатых моллюсков NCBI (значение e <1e-3 và 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием BỤI [26]. Các lần đọc gộp được chú thích bằng BLASTN sử dụng cơ sở dữ liệu phân loại động vật hai mảnh vỏ của NCBI (giá trị e <1e-3 và độ tương đồng 90%) và việc che giấu trình tự có độ phức tạp thấp được thực hiện bằng DUST [26].Các lần đọc được chia thành hai nhóm: liên quan đến trình tự hai mảnh vỏ (ở đây gọi là tự đọc) và không liên quan (không tự đọc). Hai nhóm được lắp ráp riêng biệt bằng MEGAHIT để tạo ra các contig [27]. Trong khi đó, phân bố phân loại của các lần đọc vi sinh vật ngoài hành tinh được phân loại bằng Kraken2 [28] và được biểu diễn bằng đồ họa bằng biểu đồ hình tròn Krona trên Galaxy [29, 30]. Các kmers tối ưu được xác định là kmers-59 từ các thí nghiệm sơ bộ của chúng tôi. Sau đó, các contig tự thân được xác định bằng cách căn chỉnh với BLASTN (cơ sở dữ liệu NCBI về động vật hai mảnh vỏ, giá trị e < 1e−10 và độ tương đồng 60%) để có chú thích cuối cùng. Sau đó, các contig tự thân được xác định bằng cách căn chỉnh với BLASTN (cơ sở dữ liệu NCBI về động vật hai mảnh vỏ, giá trị e < 1e−10 và độ tương đồng 60%) để có chú thích cuối cùng. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатых моллюсков NCBI, значение e <1e-10 и tỷ lệ 60%) là một khoản tiền lớn. Sau đó, các contig tự thân được xác định bằng cách so sánh với BLASTN (cơ sở dữ liệu động vật hai mảnh vỏ của NCBI, giá trị e <1e-10 và độ tương đồng 60%) để có chú thích cuối cùng.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库,e 值< 1e-10 和60%同源性)对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库,e 值< 1e-10 和60% Bạn có thể sử dụng các công cụ hỗ trợ để đạt được lợi ích kinh tế cao nhất với BLASTN (база данных NCBI для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 và гомология 60%). Sau đó, các contig tự thân được xác định để chú thích cuối cùng bằng cách so sánh với BLASTN (cơ sở dữ liệu động vật hai mảnh vỏ của NCBI, giá trị e <1e-10 và độ tương đồng 60%). Song song đó, các contig nhóm không phải của chính nó được chú thích bằng BLASTN (cơ sở dữ liệu nt NCBI, giá trị e < 1e−10 và độ tương đồng 60%). Song song đó, các contig nhóm không phải của chính nó được chú thích bằng BLASTN (cơ sở dữ liệu nt NCBI, giá trị e < 1e−10 và độ tương đồng 60%). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 và гомология 60%). Song song đó, các contig nhóm nước ngoài được chú thích bằng BLASTN (cơ sở dữ liệu NT NCBI, giá trị e <1e-10 và độ tương đồng 60%).平行地,用BLASTN（nt NCBI 数据库,e 值< 1e-10 和60% 同源性)注释非自身组重叠群。平行地,用BLASTN（nt NCBI 数据库,e 值< 1e-10 和60% 同源性)注释非自身组重叠群。 Bạn không cần phải lo lắng về điều đó, bạn không cần phải làm gì với nó, bạn có thể làm điều đó bằng cách sử dụng BLASTN (база) данных nt NCBI, значение e <1e-10 và гомология 60%). Song song đó, các contig nhóm không tự thân được chú thích bằng BLASTN (cơ sở dữ liệu nt NCBI, giá trị e <1e-10 và độ tương đồng 60%). BLASTX cũng được tiến hành trên các contig không phải của chính nó bằng cách sử dụng cơ sở dữ liệu NCBI về protein nr và RefSeq (giá trị e < 1e−10 và độ tương đồng 60%). BLASTX cũng được tiến hành trên các contig không phải của chính nó bằng cách sử dụng cơ sở dữ liệu NCBI về protein nr và RefSeq (giá trị e < 1e−10 và độ tương đồng 60%). BLASTX là một trong những người cung cấp dịch vụ quản lý tài khoản cho các nhà cung cấp dịch vụ tài chính của bạn và RefSeq NCBI (значение e <1e-10 và гомология 60%). BLASTX cũng được thực hiện trên các contig không phải của chính mình bằng cách sử dụng cơ sở dữ liệu protein NCBI nr và RefSeq (giá trị e < 1e-10 và độ tương đồng 60%).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性)。还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性)。 BLASTX là một trong những công cụ giúp bạn quản lý các khoản nợ của mình bằng cách sử dụng các tài khoản của bạn và RefSeq NCBI (значение e <1e-10 và гомология 60%). BLASTX cũng được thực hiện trên các contig không phải của chính mình bằng cách sử dụng cơ sở dữ liệu protein NCBI nr và RefSeq (giá trị e <1e-10 và độ tương đồng 60%).Các nhóm BLASTN và BLASTX của các contig không tự biểu diễn các contig cuối cùng (xem Tệp bổ sung).
Các đoạn mồi dùng cho PCR được liệt kê trong Bảng S1. Taq DNA polymerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) được sử dụng để khuếch đại các gen mục tiêu ccfDNA. Các điều kiện phản ứng sau đây được sử dụng: biến tính ở 95°C trong 3 phút, 95°C trong 1 phút, nhiệt độ gắn kết cố định trong 1 phút, kéo dài ở 72°C trong 1 phút, 35 chu kỳ và cuối cùng là 72°C trong vòng 10 phút. . Các sản phẩm PCR được tách bằng điện di trong gel agarose (1,5%) chứa SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) ở 95 V.
Trai (Mytilus spp.) được thích nghi trong 500 ml nước biển có oxy (32 PSU) trong 24 giờ ở 4°C. DNA plasmid chứa đoạn chèn mã hóa trình tự cDNA galectin-7 của người (số hiệu truy cập NCBI L07769) được thêm vào lọ ở nồng độ cuối cùng là 190 μg/μl. Trai được ủ trong cùng điều kiện nhưng không bổ sung DNA là đối chứng. Bể đối chứng thứ ba chứa DNA không có trai. Để theo dõi chất lượng DNA trong nước biển, các mẫu nước biển (20 μl; ba lần lặp lại) được lấy từ mỗi bể tại thời điểm đã chỉ định. Để truy xuất nguồn gốc DNA plasmid, trai LB được thu hoạch tại thời điểm đã chỉ định và phân tích bằng qPCR và ddPCR. Do hàm lượng muối cao trong nước biển, các phần định lượng được pha loãng trong nước chất lượng PCR (1:10) trước tất cả các xét nghiệm PCR.
Phản ứng PCR giọt kỹ thuật số (ddPCR) được thực hiện bằng giao thức BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Canada). Sử dụng hồ sơ nhiệt độ để xác định nhiệt độ tối ưu (Bảng S1). Các giọt được tạo ra bằng máy tạo giọt QX200 (BioRad). ddPCR được thực hiện như sau: 95°C trong 5 phút, 50 chu kỳ 95°C trong 30 giây và nhiệt độ gắn kết nhất định trong 1 phút và 72°C trong 30 giây, 4°C trong 5 phút và 90°C trong vòng 5 phút. Số giọt và phản ứng dương tính (số bản sao/µl) được đo bằng máy đọc giọt QX200 (BioRad). Các mẫu có ít hơn 10.000 giọt đã bị loại bỏ. Kiểm soát mẫu không được thực hiện mỗi lần chạy ddPCR.
qPCR được thực hiện bằng Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Úc) và các đoạn mồi đặc hiệu LGALS7. Tất cả các PCR định lượng được thực hiện trong 20 µl bằng Bộ PCR QuantiFast SYBR Green (QIAGEN). qPCR được bắt đầu bằng thời gian ủ 15 phút ở 95°C, sau đó là 40 chu kỳ ở 95°C trong 10 giây và ở 60°C trong 60 giây với một lần thu thập dữ liệu. Đường cong nóng chảy được tạo ra bằng cách sử dụng các phép đo liên tiếp ở 95°C trong 5 giây, 65°C trong 60 giây và 97°C khi kết thúc qPCR. Mỗi qPCR được thực hiện theo bộ ba, ngoại trừ các mẫu đối chứng.
Vì trai được biết đến với tốc độ lọc cao, trước tiên chúng tôi đã nghiên cứu xem chúng có thể lọc và giữ lại các mảnh DNA có trong nước biển hay không. Chúng tôi cũng quan tâm đến việc liệu những mảnh này có tích tụ trong hệ thống bạch huyết bán mở của chúng hay không. Chúng tôi đã giải quyết vấn đề này bằng thực nghiệm bằng cách theo dõi số phận của các mảnh DNA hòa tan được thêm vào bể nuôi trai xanh. Để tạo điều kiện theo dõi các mảnh DNA, chúng tôi đã sử dụng DNA plasmid ngoại lai (không phải của chính nó) có chứa gen galectin-7 của người. ddPCR theo dõi các mảnh DNA plasmid trong nước biển và trai. Kết quả của chúng tôi cho thấy nếu lượng mảnh DNA trong nước biển vẫn tương đối ổn định theo thời gian (lên đến 7 ngày) khi không có trai, thì khi có trai, mức độ này gần như biến mất hoàn toàn trong vòng 8 giờ (Hình 1a, b). Các mảnh DNA ngoại sinh dễ dàng được phát hiện trong vòng 15 phút trong dịch nội van và huyết tương (Hình 1c). Những mảnh này vẫn có thể được phát hiện tới 4 giờ sau khi tiếp xúc. Hoạt động lọc này đối với các mảnh DNA có thể so sánh với hoạt động lọc của vi khuẩn và tảo [31]. Những kết quả này cho thấy rằng trai có thể lọc và tích tụ DNA lạ trong các khoang chất lỏng của chúng.
Nồng độ tương đối của DNA plasmid trong nước biển khi có (A) hoặc không có (B) trai, được đo bằng ddPCR. Trong A, kết quả được biểu thị dưới dạng phần trăm, với đường viền của các ô biểu thị phần trăm thứ 75 và thứ 25. Đường cong logarit được điều chỉnh được hiển thị màu đỏ và khu vực được tô màu xám biểu thị khoảng tin cậy 95%. Trong B, đường màu đỏ biểu thị giá trị trung bình và đường màu xanh biểu thị khoảng tin cậy 95% cho nồng độ. C Sự tích tụ DNA plasmid trong máu và dịch van của trai tại các thời điểm khác nhau sau khi bổ sung DNA plasmid. Kết quả được trình bày dưới dạng số bản sao tuyệt đối được phát hiện/mL (±SE).
Tiếp theo, chúng tôi đã nghiên cứu nguồn gốc của ccfDNA trong trai được thu thập từ các bãi trai trên quần đảo Kerguelen, một nhóm đảo xa xôi có ảnh hưởng hạn chế của con người. Vì mục đích này, cccDNA từ huyết tương trai đã được phân lập và tinh chế bằng các phương pháp thường được sử dụng để tinh chế cccDNA của con người [32, 33]. Chúng tôi thấy rằng nồng độ ccfDNA huyết tương trung bình trong trai nằm trong phạm vi microgam trên ml huyết tương thấp (xem Bảng S2, Thông tin bổ sung). Phạm vi nồng độ này lớn hơn nhiều so với ở người khỏe mạnh (thấp nanogam trên mililít), nhưng trong một số trường hợp hiếm hoi, ở bệnh nhân ung thư, mức ccfDNA có thể đạt tới vài microgam trên mililít [34, 35]. Phân tích phân bố kích thước của ccfDNA huyết tương cho thấy các đoạn này có kích thước rất khác nhau, dao động từ 1000 bp đến 1000 bp, lên đến 5000 bp (Hình 2). Kết quả tương tự đã thu được khi sử dụng Bộ dụng cụ điều tra QIAamp dựa trên silica, một phương pháp thường được sử dụng trong khoa học pháp y để nhanh chóng phân lập và tinh chế DNA bộ gen từ các mẫu DNA nồng độ thấp, bao gồm ccfDNA [36].
Biểu đồ điện di ccfDNA đại diện của huyết tương trai. Chiết xuất bằng Bộ NucleoSnap Plasma (phía trên) và Bộ QIAamp DNA Investigator. B Biểu đồ Violin cho thấy sự phân bố nồng độ ccfDNA huyết tương (±SE) trong trai. Các đường màu đen và đỏ lần lượt biểu diễn trung vị và tứ phân vị thứ nhất và thứ ba.
Khoảng 1% ccfDNA ở người và động vật linh trưởng có nguồn gốc từ bên ngoài [21, 37]. Với hệ tuần hoàn bán hở của động vật hai mảnh vỏ, nước biển giàu vi khuẩn và phân bố kích thước của ccfDNA ở trai, chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng ccfDNA huyết tương ở trai có thể chứa một nhóm DNA vi khuẩn phong phú và đa dạng. Để kiểm tra giả thuyết này, chúng tôi đã giải trình tự ccfDNA huyết tương từ các mẫu Aulacomya atra thu thập được từ quần đảo Kerguelen, thu được hơn 10 triệu lần đọc, trong đó 97,6% đạt yêu cầu kiểm soát chất lượng. Sau đó, các lần đọc được phân loại theo nguồn tự thân và không tự thân bằng cách sử dụng cơ sở dữ liệu BLASTN và NCBI về động vật hai mảnh vỏ (Hình S1, Thông tin bổ sung).
Ở người, cả DNA nhân và DNA ty thể đều có thể được giải phóng vào máu [38]. Tuy nhiên, trong nghiên cứu hiện tại, không thể mô tả chi tiết DNA bộ gen nhân của trai, vì bộ gen A. atra chưa được giải trình tự hoặc mô tả. Tuy nhiên, chúng tôi đã có thể xác định một số đoạn ccfDNA có nguồn gốc từ chính chúng tôi bằng cách sử dụng thư viện hai mảnh vỏ (Hình S2, Thông tin bổ sung). Chúng tôi cũng xác nhận sự hiện diện của các đoạn DNA có nguồn gốc từ chính chúng tôi bằng cách khuếch đại PCR có hướng các gen A. atra đã được giải trình tự (Hình 3). Tương tự như vậy, vì bộ gen ty thể của A. atra có sẵn trong các cơ sở dữ liệu công khai, nên người ta có thể tìm thấy bằng chứng về sự hiện diện của các đoạn ccfDNA ty thể trong huyết tương của A. atra. Sự hiện diện của các đoạn DNA ty thể đã được xác nhận bằng cách khuếch đại PCR (Hình 3).
Nhiều gen ty thể có mặt trong huyết tương của A. atra (chấm đỏ – mã số: SRX5705969) và M. platensis (chấm xanh – mã số: SRX5705968) được khuếch đại bằng PCR. Hình ảnh được điều chỉnh từ Breton et al., 2011 B Sự khuếch đại của dịch huyết tương từ A. atra Lưu trữ trên giấy FTA. Sử dụng một cú đấm 3 mm để thêm trực tiếp vào ống PCR chứa hỗn hợp PCR.
Do hàm lượng vi khuẩn dồi dào trong nước biển, ban đầu chúng tôi tập trung vào đặc tính của trình tự DNA vi khuẩn trong huyết tương. Để làm được điều này, chúng tôi sử dụng hai chiến lược khác nhau. Chiến lược đầu tiên sử dụng Kraken2, một chương trình phân loại trình tự dựa trên thuật toán có thể xác định trình tự vi khuẩn với độ chính xác tương đương với BLAST và các công cụ khác [28]. Hơn 6719 lần đọc được xác định là có nguồn gốc từ vi khuẩn, trong khi 124 và 64 lần đọc đến từ vi khuẩn cổ và vi-rút (Hình 4). Các đoạn DNA vi khuẩn dồi dào nhất là Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) và Bacteroidetes (17%) (Hình 4a). Sự phân bố này phù hợp với các nghiên cứu trước đây về hệ vi sinh vật ở trai xanh biển [39, 40]. Gammaproteobacteria là lớp chính của Proteobacteria (44%), bao gồm nhiều loại Vibrionales (Hình 4b). Phương pháp ddPCR đã xác nhận sự hiện diện của các mảnh DNA Vibrio trong ccfDNA của A. atra hemolymph (Hình 4c) [41]. Để có thêm thông tin về nguồn gốc vi khuẩn của ccfDNA, một phương pháp tiếp cận bổ sung đã được thực hiện (Hình S2, Thông tin bổ sung). Trong trường hợp này, các đoạn đọc chồng lên nhau được lắp ráp thành các đoạn đọc ghép đôi và được phân loại là có nguồn gốc từ chính nó (hai mảnh vỏ) hoặc không phải từ chính nó bằng cách sử dụng BLASTN và giá trị e là 1e−3 và ngưỡng có độ tương đồng >90%. Trong trường hợp này, các đoạn đọc chồng lên nhau được lắp ráp thành các đoạn đọc ghép đôi và được phân loại là có nguồn gốc từ chính nó (hai mảnh vỏ) hoặc không phải từ chính nó bằng cách sử dụng BLASTN và giá trị e là 1e−3 và ngưỡng có độ tương đồng >90%. Bạn có thể dễ dàng tìm được một người có thể kiếm được nhiều tiền hơn và có thể kiếm được nhiều tiền hơn классифицированы как собственные (двустворчатые моллюски) hoặc чужие по происхождению с использованием BLASTN và значения e 1e-3 và отсечения с гомологией> 90%. Trong trường hợp này, các đoạn đọc chồng lấn được thu thập dưới dạng các đoạn đọc có cặp kết thúc và được phân loại là bản địa (hai mảnh vỏ) hoặc không phải bản địa bằng cách sử dụng BLASTN và giá trị e là 1e-3 và ngưỡng với độ tương đồng >90%.90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 , 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 , 使用 使用 使用 blastn 和 1e-3 的 的 值和> 90% Bạn có thể có được một khoản tiền lớn để có được một khoản tiền lớn và một khoản tiền nhất định và một khoản tiền lớn как собственные (двустворчатые моллюски) hoặc несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3 и порога гомологии> 90%. Trong trường hợp này, các đoạn đọc chồng lấn được thu thập dưới dạng các đoạn đọc có cặp kết thúc và được phân loại là riêng (hai mảnh vỏ) hoặc không phải bản gốc bằng cách sử dụng các giá trị e BLASTN và 1e-3 và ngưỡng tương đồng >90%.Vì bộ gen A. atra vẫn chưa được giải trình tự, chúng tôi đã sử dụng chiến lược lắp ráp de novo của trình lắp ráp MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS). Tổng cộng 147.188 contig đã được xác định là phụ thuộc (hai mảnh vỏ) có nguồn gốc. Sau đó, các contig này được giải mã với các giá trị e từ 1e-10 bằng BLASTN và BLASTX. Chiến lược này cho phép chúng tôi xác định 482 đoạn không phải hai mảnh vỏ có trong ccfDNA của A. atra. Hơn một nửa (57%) trong số các đoạn DNA này được lấy từ vi khuẩn, chủ yếu từ cộng sinh mang, bao gồm cộng sinh sunfotrophic, và từ cộng sinh mang Solemya velum (Hình 5).
Độ phong phú tương đối ở cấp độ loại. B Sự đa dạng vi khuẩn của hai ngành chính (Firmicutes và Proteobacteria). Sự khuếch đại đại diện của ddPCR C Vibrio spp. A. Các mảnh gen rRNA 16S (màu xanh) trong ba huyết tương atra.
Tổng cộng 482 contig đã thu thập được đã được phân tích. Hồ sơ chung về phân bố phân loại của chú thích contig metagenomic (prokaryote và eukaryote). B Phân bố chi tiết các đoạn DNA của vi khuẩn được xác định bởi BLASTN và BLASTX.
Phân tích Kraken2 cũng cho thấy ccfDNA của trai chứa các mảnh DNA của vi khuẩn cổ, bao gồm các mảnh DNA của Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) và Thaurmarcheota (11%) (Hình 6a). Sự hiện diện của các mảnh DNA có nguồn gốc từ Euryarchaeota và Crenarchaeota, trước đây được tìm thấy trong cộng đồng vi khuẩn của trai California, không phải là điều bất ngờ [42]. Mặc dù Euryarchaeota thường liên quan đến các điều kiện khắc nghiệt, nhưng hiện nay người ta nhận ra rằng cả Euryarchaeota và Crenarcheota đều nằm trong số các sinh vật nhân sơ phổ biến nhất trong môi trường đông lạnh biển [43, 44]. Sự hiện diện của các vi sinh vật sinh metan trong trai không phải là điều đáng ngạc nhiên, xét đến các báo cáo gần đây về rò rỉ metan lớn từ các vết rò rỉ ở đáy trên Cao nguyên Kerguelen [45] và khả năng sản xuất metan của vi khuẩn được quan sát thấy ngoài khơi quần đảo Kerguelen [46].
Sau đó, chúng tôi chuyển sự chú ý sang các bài đọc từ virus DNA. Theo hiểu biết của chúng tôi, đây là nghiên cứu đầu tiên không liên quan đến hàm lượng virus trong trai. Đúng như dự đoán, chúng tôi đã tìm thấy các đoạn DNA của thực khuẩn thể (Caudovirales) (Hình 6b). Tuy nhiên, DNA virus phổ biến nhất đến từ ngành nucleocytovirus, còn được gọi là virus DNA lớn trong tế bào chất hạt nhân (NCLDV), có bộ gen lớn nhất trong số các loại virus. Trong ngành này, hầu hết các trình tự DNA thuộc về họ Mimimidoviridae (58%) và Poxviridae (21%), có vật chủ tự nhiên bao gồm động vật có xương sống và động vật chân đốt, trong khi một tỷ lệ nhỏ các trình tự DNA này thuộc về tảo virus đã biết. Lây nhiễm tảo nhân chuẩn biển. Các trình tự cũng được lấy từ virus Pandora, loại virus khổng lồ có kích thước bộ gen lớn nhất trong số các chi virus đã biết. Điều thú vị là phạm vi vật chủ được biết là bị nhiễm virus, được xác định bằng trình tự ccfDNA trong huyết tương, tương đối lớn (Hình S3, Thông tin bổ sung). Nó bao gồm các loại virus lây nhiễm côn trùng như Baculoviridae và Iridoviridae, cũng như các loại virus lây nhiễm amip, tảo và động vật có xương sống. Chúng tôi cũng tìm thấy các trình tự khớp với bộ gen của Pithovirus sibericum. Pitovirus (còn được gọi là "virus thây ma") lần đầu tiên được phân lập từ lớp đất đóng băng vĩnh cửu 30.000 năm tuổi ở Siberia [47]. Do đó, kết quả của chúng tôi phù hợp với các báo cáo trước đây cho thấy không phải tất cả các loài hiện đại của những loại virus này đều đã tuyệt chủng [48] và những loại virus này có thể hiện diện trong các hệ sinh thái biển cận Bắc Cực xa xôi.
Cuối cùng, chúng tôi đã thử nghiệm để xem liệu chúng tôi có thể tìm thấy các đoạn DNA từ các loài động vật đa bào khác hay không. Tổng cộng 482 contig ngoại lai đã được BLASTN và BLASTX xác định bằng các thư viện nt, nr và RefSeq (gen và protein). Kết quả của chúng tôi cho thấy trong số các đoạn ccfDNA ngoại lai của động vật đa bào, DNA của xương chiếm ưu thế (Hình 5). Các đoạn DNA từ côn trùng và các loài khác cũng đã được tìm thấy. Một phần tương đối lớn các đoạn DNA vẫn chưa được xác định, có thể là do số lượng lớn các loài sinh vật biển trong cơ sở dữ liệu gen không được đại diện đầy đủ so với các loài trên cạn [49].
Trong bài báo hiện tại, chúng tôi áp dụng khái niệm LB cho trai, lập luận rằng giải trình tự bắn ccfDNA trong huyết tương có thể cung cấp cái nhìn sâu sắc về thành phần của hệ sinh thái ven biển. Đặc biệt, chúng tôi phát hiện ra rằng 1) huyết tương trai chứa nồng độ tương đối cao (mức microgam) của các đoạn DNA lưu thông tương đối lớn (~1-5 kb); 2) các đoạn DNA này vừa độc lập vừa không độc lập 3) Trong số các nguồn ngoại lai của các đoạn DNA này, chúng tôi tìm thấy DNA của vi khuẩn, vi khuẩn cổ và vi rút, cũng như DNA của các động vật đa bào khác; 4) Sự tích tụ của các đoạn ccfDNA ngoại lai này trong huyết tương diễn ra nhanh chóng và góp phần vào hoạt động lọc bên trong của trai. Tóm lại, nghiên cứu của chúng tôi chứng minh rằng khái niệm LB, cho đến nay chủ yếu được áp dụng trong lĩnh vực y sinh học, mã hóa một nguồn kiến ​​thức phong phú nhưng chưa được khám phá có thể được sử dụng để hiểu rõ hơn về sự tương tác giữa các loài canh gác và môi trường của chúng.
Ngoài loài linh trưởng, việc phân lập ccfDNA đã được báo cáo ở động vật có vú, bao gồm chuột, chó, mèo và ngựa [50, 51, 52]. Tuy nhiên, theo hiểu biết của chúng tôi, nghiên cứu của chúng tôi là nghiên cứu đầu tiên báo cáo về việc phát hiện và giải trình tự ccfDNA ở các loài sinh vật biển có hệ thống tuần hoàn hở. Đặc điểm giải phẫu và khả năng lọc này của trai có thể, ít nhất là một phần, giải thích các đặc điểm kích thước khác nhau của các đoạn DNA tuần hoàn so với các loài khác. Ở người, hầu hết các đoạn DNA lưu thông trong máu là các đoạn nhỏ có kích thước từ 150 đến 200 bp, với đỉnh tối đa là 167 bp [34, 53]. Một phần nhỏ nhưng đáng kể các đoạn DNA có kích thước từ 300 đến 500 bp và khoảng 5% dài hơn 900 bp. [54]. Lý do cho sự phân bố kích thước này là nguồn chính của ccfDNA trong huyết tương xảy ra do tế bào chết, do tế bào chết hoặc do hoại tử các tế bào tạo máu lưu thông ở những người khỏe mạnh hoặc do quá trình apoptosis của tế bào khối u ở bệnh nhân ung thư (được gọi là DNA khối u lưu thông). , ctDNA). Sự phân bố kích thước của ccfDNA trong huyết tương mà chúng tôi tìm thấy ở trai dao động từ 1000 đến 5000 bp, cho thấy ccfDNA của trai có nguồn gốc khác. Đây là một giả thuyết hợp lý, vì trai có hệ thống mạch bán hở và sống trong môi trường nước biển có chứa nồng độ DNA bộ gen của vi khuẩn cao. Trên thực tế, các thí nghiệm trong phòng thí nghiệm của chúng tôi sử dụng DNA ngoại sinh đã chỉ ra rằng trai tích tụ các mảnh DNA trong nước biển, ít nhất là sau vài giờ, chúng bị phân hủy sau khi được tế bào hấp thụ và/hoặc giải phóng và/hoặc lưu trữ trong các tổ chức khác nhau. Do tính hiếm của các tế bào (cả tế bào nhân sơ và nhân thực), việc sử dụng các ngăn trong van sẽ làm giảm lượng ccfDNA từ các nguồn tự thân cũng như từ các nguồn bên ngoài. Xem xét tầm quan trọng của khả năng miễn dịch bẩm sinh của động vật hai mảnh vỏ và số lượng lớn các tế bào thực bào lưu hành, chúng tôi tiếp tục đưa ra giả thuyết rằng ngay cả ccfDNA ngoại lai cũng được làm giàu trong các tế bào thực bào lưu hành tích tụ DNA ngoại lai khi ăn phải vi sinh vật và/hoặc mảnh vụn tế bào. Tổng hợp lại, kết quả của chúng tôi cho thấy ccfDNA huyết tương hai mảnh vỏ là một kho lưu trữ thông tin phân tử độc đáo và củng cố vị thế của chúng như một loài canh gác.
Dữ liệu của chúng tôi chỉ ra rằng việc giải trình tự và phân tích các đoạn ccfDNA huyết tương có nguồn gốc từ vi khuẩn có thể cung cấp thông tin quan trọng về hệ vi khuẩn chủ và vi khuẩn hiện diện trong hệ sinh thái biển xung quanh. Các kỹ thuật giải trình tự shot đã tiết lộ trình tự của vi khuẩn cộng sinh A. atra gill sẽ bị bỏ sót nếu sử dụng các phương pháp xác định 16S rRNA thông thường, một phần là do sự thiên vị của thư viện tham chiếu. Trên thực tế, việc chúng tôi sử dụng dữ liệu LB thu thập được từ M. platensis trong cùng một lớp trai ở Kerguelen cho thấy thành phần của cộng sinh vi khuẩn liên quan đến mang là giống nhau đối với cả hai loài trai (Hình S4, Thông tin bổ sung). Điểm tương đồng này của hai loài trai khác nhau về mặt di truyền có thể phản ánh thành phần của cộng đồng vi khuẩn trong các trầm tích lạnh, lưu huỳnh và núi lửa của Kerguelen [55, 56, 57, 58]. Mức độ vi sinh vật khử lưu huỳnh cao hơn đã được mô tả rõ khi thu hoạch trai từ các vùng ven biển bị nhiễu loạn sinh học [59], chẳng hạn như bờ biển Port-au-France. Một khả năng khác là hệ thực vật trai cộng sinh có thể bị ảnh hưởng bởi sự truyền ngang [60, 61]. Cần nhiều nghiên cứu hơn để xác định mối tương quan giữa môi trường biển, bề mặt đáy biển và thành phần của vi khuẩn cộng sinh trong trai. Các nghiên cứu này hiện đang được tiến hành.
Chiều dài và nồng độ của ccfDNA huyết tương, khả năng tinh chế dễ dàng và chất lượng cao cho phép giải trình tự shotgun nhanh là một số trong nhiều lợi thế của việc sử dụng ccfDNA của trai để đánh giá đa dạng sinh học trong các hệ sinh thái ven biển biển. Phương pháp này đặc biệt hiệu quả để mô tả các cộng đồng vi-rút (virome) trong một hệ sinh thái nhất định [62, 63]. Không giống như vi khuẩn, vi khuẩn cổ và sinh vật nhân chuẩn, bộ gen vi-rút không chứa các gen được bảo tồn về mặt phát sinh loài như trình tự 16S. Kết quả của chúng tôi chỉ ra rằng sinh thiết lỏng từ các loài chỉ thị như trai có thể được sử dụng để xác định số lượng tương đối lớn các mảnh vi-rút ccfDNA được biết là lây nhiễm cho vật chủ thường sống trong các hệ sinh thái biển ven biển. Điều này bao gồm các loại vi-rút được biết là lây nhiễm cho động vật nguyên sinh, động vật chân đốt, côn trùng, thực vật và vi-rút vi khuẩn (ví dụ: thực khuẩn thể). Một sự phân bố tương tự đã được tìm thấy khi chúng tôi kiểm tra virome ccfDNA huyết tương của trai xanh (M. platensis) được thu thập trong cùng một lớp trai tại Kerguelen (Bảng S2, Thông tin bổ sung). Giải trình tự shotgun của ccfDNA thực sự là một phương pháp tiếp cận mới đang được chú ý trong nghiên cứu về virome của con người hoặc các loài khác [21, 37, 64]. Phương pháp tiếp cận này đặc biệt hữu ích để nghiên cứu các loại virus DNA sợi đôi, vì không có gen đơn lẻ nào được bảo tồn trong số tất cả các loại virus DNA sợi đôi, đại diện cho nhóm virus đa dạng và rộng nhất ở Baltimore [65]. Mặc dù hầu hết các loại virus này vẫn chưa được phân loại và có thể bao gồm các loại virus từ một phần hoàn toàn chưa được biết đến của thế giới virus [66], chúng tôi thấy rằng các loại virus và phạm vi vật chủ của trai A. atra và M. platensis nằm giữa hai loài. tương tự (xem hình S3, thông tin bổ sung). Điểm tương đồng này không có gì đáng ngạc nhiên, vì nó có thể phản ánh sự thiếu chọn lọc trong việc hấp thụ DNA có trong môi trường. Các nghiên cứu trong tương lai sử dụng RNA tinh khiết hiện là cần thiết để mô tả virome RNA.
Trong nghiên cứu của mình, chúng tôi đã sử dụng một quy trình rất nghiêm ngặt được điều chỉnh từ công trình của Kowarski và các đồng nghiệp [37], những người đã sử dụng thao tác xóa hai bước các đoạn đọc và contig được gộp lại trước và sau khi lắp ráp ccfDNA bản địa, dẫn đến tỷ lệ cao các đoạn đọc chưa được lập bản đồ. Do đó, chúng tôi không thể loại trừ khả năng một số đoạn đọc chưa được lập bản đồ này vẫn có thể có nguồn gốc riêng, chủ yếu là vì chúng tôi không có bộ gen tham chiếu cho loài trai này. Chúng tôi cũng sử dụng quy trình này vì chúng tôi lo ngại về các thể khảm giữa các đoạn đọc của bản thân và không phải của bản thân cũng như độ dài đoạn đọc do Illumina MiSeq PE75 tạo ra. Một lý do khác cho phần lớn các đoạn đọc chưa được lập bản đồ là phần lớn các vi khuẩn biển, đặc biệt là ở các vùng xa xôi như Kerguelen, chưa được chú thích. Chúng tôi đã sử dụng Illumina MiSeq PE75, giả sử độ dài đoạn ccfDNA tương tự như ccfDNA của con người. Đối với các nghiên cứu trong tương lai, với kết quả của chúng tôi cho thấy ccfDNA trong huyết tương có độ dài đọc dài hơn ở người và/hoặc động vật có vú, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng nền tảng giải trình tự phù hợp hơn với các đoạn ccfDNA dài hơn. Thực hành này sẽ giúp xác định dễ dàng hơn nhiều các chỉ định để phân tích sâu hơn. Việc có được trình tự bộ gen nhân A. atra hoàn chỉnh hiện không có sẵn cũng sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho việc phân biệt ccfDNA từ các nguồn tự thân và không tự thân. Với nghiên cứu của chúng tôi tập trung vào khả năng áp dụng khái niệm sinh thiết lỏng cho trai, chúng tôi hy vọng rằng khi khái niệm này được sử dụng trong nghiên cứu trong tương lai, các công cụ và quy trình mới sẽ được phát triển để tăng tiềm năng của phương pháp này trong việc nghiên cứu sự đa dạng vi khuẩn của trai. hệ sinh thái biển.
Là một dấu ấn sinh học lâm sàng không xâm lấn, nồng độ ccfDNA trong huyết tương người tăng cao có liên quan đến nhiều bệnh, tổn thương mô và tình trạng căng thẳng [67,68,69]. Sự gia tăng này có liên quan đến việc giải phóng các đoạn DNA có nguồn gốc riêng sau khi mô bị tổn thương. Chúng tôi đã giải quyết vấn đề này bằng cách sử dụng ứng suất nhiệt cấp tính, trong đó trai được tiếp xúc trong thời gian ngắn với nhiệt độ 30 °C. Chúng tôi đã thực hiện phân tích này trên ba loại trai khác nhau trong ba thí nghiệm độc lập. Tuy nhiên, chúng tôi không tìm thấy bất kỳ thay đổi nào về nồng độ ccfDNA sau ứng suất nhiệt cấp tính (xem Hình S5, thông tin bổ sung). Khám phá này có thể giải thích, ít nhất là một phần, thực tế là trai có hệ tuần hoàn bán hở và tích tụ một lượng lớn DNA lạ do hoạt động lọc cao của chúng. Mặt khác, trai, giống như nhiều loài động vật không xương sống khác, có thể có khả năng chống lại tổn thương mô do căng thẳng tốt hơn, do đó hạn chế việc giải phóng ccfDNA trong máu của chúng [70, 71].
Cho đến nay, phân tích DNA về đa dạng sinh học trong hệ sinh thái dưới nước chủ yếu tập trung vào siêu mã vạch DNA môi trường (eDNA). Tuy nhiên, phương pháp này thường bị hạn chế trong phân tích đa dạng sinh học khi sử dụng các đoạn mồi. Việc sử dụng giải trình tự shotgun khắc phục được những hạn chế của PCR và sự lựa chọn sai lệch của các bộ mồi. Do đó, theo một nghĩa nào đó, phương pháp của chúng tôi gần hơn với phương pháp giải trình tự Shotgun eDNA thông lượng cao mới được sử dụng gần đây, có thể giải trình tự trực tiếp DNA bị phân mảnh và phân tích hầu hết mọi sinh vật [72, 73]. Tuy nhiên, có một số vấn đề cơ bản phân biệt LB với các phương pháp eDNA tiêu chuẩn. Tất nhiên, sự khác biệt chính giữa eDNA và LB là việc sử dụng vật chủ lọc tự nhiên. Việc sử dụng các loài sinh vật biển như bọt biển và nhuyễn thể hai mảnh vỏ (Dresseina spp.) làm bộ lọc tự nhiên để nghiên cứu eDNA đã được báo cáo [74, 75]. Tuy nhiên, nghiên cứu của Dreissena đã sử dụng sinh thiết mô mà từ đó DNA được chiết xuất. Phân tích ccfDNA từ LB không yêu cầu sinh thiết mô, thiết bị chuyên dụng và đôi khi đắt tiền và hậu cần liên quan đến eDNA hoặc sinh thiết mô. Trên thực tế, chúng tôi gần đây đã báo cáo rằng ccfDNA từ LB có thể được lưu trữ và phân tích với sự hỗ trợ của FTA mà không cần duy trì chuỗi lạnh, đây là một thách thức lớn đối với nghiên cứu ở các vùng xa xôi [76]. Việc chiết xuất ccfDNA từ sinh thiết lỏng cũng đơn giản và cung cấp DNA chất lượng cao để giải trình tự shotgun và phân tích PCR. Đây là một lợi thế lớn khi xét đến một số hạn chế kỹ thuật liên quan đến phân tích eDNA [77]. Tính đơn giản và chi phí thấp của phương pháp lấy mẫu cũng đặc biệt phù hợp cho các chương trình giám sát dài hạn. Ngoài khả năng lọc cao, một đặc điểm nổi tiếng khác của nhuyễn thể hai mảnh vỏ là thành phần mucopolysaccharide hóa học trong chất nhầy của chúng, giúp thúc đẩy quá trình hấp thụ vi-rút [78, 79]. Điều này khiến nhuyễn thể hai mảnh vỏ trở thành bộ lọc tự nhiên lý tưởng để mô tả đặc điểm đa dạng sinh học và tác động của biến đổi khí hậu trong một hệ sinh thái dưới nước nhất định. Mặc dù sự hiện diện của các đoạn DNA có nguồn gốc từ vật chủ có thể được coi là một hạn chế của phương pháp so với eDNA, nhưng chi phí liên quan đến việc có ccfDNA bản địa như vậy so với eDNA đồng thời có thể hiểu được đối với lượng thông tin khổng lồ có sẵn cho các nghiên cứu về sức khỏe. vật chủ bù trừ. Điều này bao gồm sự hiện diện của các trình tự vi-rút được tích hợp vào bộ gen của vật chủ. Điều này đặc biệt quan trọng đối với trai, do sự hiện diện của các retrovirus gây bệnh bạch cầu được truyền theo chiều ngang ở động vật hai mảnh vỏ [80, 81]. Một lợi thế khác của LB so với eDNA là nó khai thác hoạt động thực bào của các tế bào máu lưu thông trong huyết tương, nơi bao bọc các vi sinh vật (và bộ gen của chúng). Thực bào là chức năng chính của các tế bào máu ở động vật hai mảnh vỏ [82]. Cuối cùng, phương pháp này tận dụng khả năng lọc cao của trai (trung bình 1,5 l/h nước biển) và tuần hoàn hai ngày, giúp tăng cường sự trộn lẫn của các lớp nước biển khác nhau, cho phép thu thập eDNA khác loài. [83, 84]. Do đó, phân tích ccfDNA của trai là một hướng đi thú vị do tác động về dinh dưỡng, kinh tế và môi trường của trai. Tương tự như phân tích LB thu thập từ người, phương pháp này cũng mở ra khả năng đo lường những thay đổi về di truyền và biểu sinh trong DNA của vật chủ để đáp ứng với các chất ngoại sinh. Ví dụ, các công nghệ giải trình tự thế hệ thứ ba có thể được hình dung để thực hiện phân tích metyl hóa toàn bộ hệ gen trong ccfDNA bản địa bằng cách sử dụng giải trình tự nanopore. Quá trình này sẽ được tạo điều kiện thuận lợi bởi thực tế là độ dài của các đoạn ccfDNA của trai lý tưởng tương thích với các nền tảng giải trình tự đọc dài cho phép phân tích metyl hóa toàn bộ hệ gen từ một lần giải trình tự duy nhất mà không cần chuyển đổi hóa học.85,86] Đây là một khả năng thú vị, vì người ta đã chỉ ra rằng các kiểu metyl hóa DNA phản ánh phản ứng với căng thẳng về môi trường và tồn tại qua nhiều thế hệ. Do đó, nó có thể cung cấp cái nhìn sâu sắc có giá trị về các cơ chế cơ bản chi phối phản ứng sau khi tiếp xúc với biến đổi khí hậu hoặc chất ô nhiễm [87]. Tuy nhiên, việc sử dụng LB không phải là không có hạn chế. Không cần phải nói, điều này đòi hỏi sự hiện diện của các loài chỉ thị trong hệ sinh thái. Như đã đề cập ở trên, việc sử dụng LB để đánh giá tính đa dạng sinh học của một hệ sinh thái nhất định cũng đòi hỏi một quy trình tin sinh học nghiêm ngặt có tính đến sự hiện diện của các đoạn DNA từ nguồn. Một vấn đề lớn khác là tính khả dụng của các bộ gen tham chiếu cho các loài sinh vật biển. Người ta hy vọng rằng các sáng kiến ​​như Dự án bộ gen động vật có vú biển và dự án Fish10k mới thành lập [88] sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho việc phân tích như vậy trong tương lai. Việc áp dụng khái niệm LB cho các sinh vật ăn lọc biển cũng tương thích với những tiến bộ mới nhất trong công nghệ giải trình tự, khiến nó phù hợp với sự phát triển của các dấu ấn sinh học đa ohm để cung cấp thông tin quan trọng về sức khỏe của môi trường sống ở biển để ứng phó với căng thẳng về môi trường.
Dữ liệu giải trình tự bộ gen đã được lưu trữ tại Kho lưu trữ trình tự đọc của NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 thuộc mục Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Tác động của biến đổi khí hậu đến sinh vật biển và hệ sinh thái. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al. Xem xét tác động kết hợp của biến đổi khí hậu và các tác nhân gây căng thẳng cục bộ khác đối với môi trường biển. môi trường khoa học chung. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, và cộng sự. ). Khoa học của ngày đầu tiên của tháng ba. 2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Giảm khả năng chịu nhiệt trong điều kiện căng thẳng nhiệt độ lặp đi lặp lại giải thích tỷ lệ tử vong cao vào mùa hè của trai xanh. Báo cáo khoa học năm 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al. Những thay đổi gần đây về tần suất, nguyên nhân và mức độ tử vong của động vật. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, và cộng sự. Nhiều mầm bệnh không đặc hiệu cho loài có thể gây chết hàng loạt loài Pinna nobilis. Mạng sống. 2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. Tác động tiềm tàng của biến đổi khí hậu đối với các bệnh truyền nhiễm ở Bắc Cực. Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al. Vẹm xanh (Mytilus edulis spp.) là sinh vật tín hiệu trong giám sát ô nhiễm ven biển: một bài đánh giá. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Tích hợp sinh thiết lỏng trong điều trị ung thư. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al. Sự trưởng thành của sinh thiết lỏng: Cho phép DNA khối u lưu thông. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Axit nucleic trong huyết tương người. Biên bản cuộc họp của các công ty con của Soc Biol. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Vai trò mới của DNA không có tế bào như một dấu hiệu phân tử để điều trị ung thư. Định lượng phân tích sinh học phân tử. 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Sinh thiết lỏng được đưa vào phòng khám – các vấn đề triển khai và thách thức trong tương lai. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW và những người khác. DNA thai nhi có trong huyết tương và huyết thanh của mẹ. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Nghiên cứu về quá trình mang thai và các biến chứng của nó bằng cách sử dụng RNA ngoại bào lưu thông trong máu của phụ nữ trong thời kỳ mang thai. Dopediatrics. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al. Sinh thiết lỏng: DNA không có tế bào của người hiến tặng được sử dụng để phát hiện các tổn thương đồng loại trong ghép thận. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM Những đổi mới trong chẩn đoán trước sinh: giải trình tự bộ gen huyết tương của mẹ. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al. Phát hiện tác nhân gây bệnh nhanh chóng bằng giải trình tự metagenomic thế hệ tiếp theo của dịch cơ thể bị nhiễm bệnh. Nat Medicine. 2021;27:115-24.