Cảm ơn bạn đã truy cập Nature.com. Phiên bản trình duyệt bạn đang sử dụng hỗ trợ CSS hạn chế. Để có trải nghiệm tốt nhất, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng trình duyệt cập nhật (hoặc tắt chế độ tương thích trong Internet Explorer). Trong thời gian chờ đợi, để đảm bảo tiếp tục được hỗ trợ, chúng tôi sẽ hiển thị trang web không có kiểu và JavaScript.
Các hạt silica xốp được điều chế bằng phương pháp sol-gel với một số sửa đổi để thu được các hạt xốp lớn. Các hạt này được tạo dẫn xuất bằng phản ứng trùng hợp chuyển chuỗi phân mảnh bổ sung thuận nghịch (RAFT) với N-phenylmaleimide-methylvinylisocyanate (PMI) và styrene để điều chế N-phenylmaleimide xen kẽ pha tĩnh polystyrene (PMP). Các cột thép không gỉ có lỗ khoan hẹp (id 100 × 1,8 mm) được đóng gói bằng cách đóng gói bùn.E Phân tách bằng cột PMP được định giá của hỗn hợp peptit bao gồm năm peptit (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enkephalin) hiệu suất sắc ký) và trypsin tiêu hóa albumin huyết thanh người (HAS). của cột đã phát triển với cột Ascentis Express RP-Amide thương mại, người ta nhận thấy rằng hiệu suất tách của cột PMP vượt trội so với cột thương mại về hiệu quả tách và độ phân giải.
Trong những năm gần đây, ngành dược phẩm sinh học đã trở thành một thị trường toàn cầu mở rộng với thị phần tăng đáng kể. Với sự phát triển bùng nổ của ngành dược phẩm sinh học1,2,3, việc phân tích peptide và protein rất được mong muốn. Ngoài peptide mục tiêu, một số tạp chất được tạo ra trong quá trình tổng hợp peptide, do đó cần phải tinh chế bằng sắc ký để thu được peptide có độ tinh khiết mong muốn. phép đo là một công cụ hiệu quả để giải trình tự peptide và protein, nếu các mẫu như vậy được đưa vào máy quang phổ khối trong một lượt, quá trình phân tách sẽ không lý tưởng. Vấn đề này có thể được giảm thiểu bằng cách thực hiện phân tách sắc ký lỏng (LC) trước khi phân tích MS, điều này sẽ làm giảm số lượng chất phân tích đi vào máy quang phổ khối tại một thời điểm nhất định4,5,6. tiến bộ đáng kể trong thập kỷ qua và đã trở thành một kỹ thuật phổ biến trong phân tích proteomic7,8,9,10.
Sắc ký lỏng pha đảo ngược (RP-LC) được sử dụng rộng rãi để tinh chế và tách hỗn hợp peptit sử dụng silica biến đổi octadecyl (ODS) làm pha tĩnh11,12,13. Tuy nhiên, pha tĩnh RP không cung cấp khả năng phân tách thỏa đáng các peptit và protein do cấu trúc phức tạp và bản chất lưỡng tính của chúng 14,15. Do đó, các pha tĩnh được thiết kế đặc biệt được yêu cầu để phân tích các peptit và protein có các gốc phân cực và không phân cực để tương tác và giữ lại các chất phân tích này 16. Sắc ký chế độ hỗn hợp, cung cấp các tương tác đa phương thức, có thể là một phương pháp thay thế cho RP-LC để tách peptit, protein và các hỗn hợp phức tạp khác. Một số pha tĩnh ở chế độ hỗn hợp đã được chuẩn bị và các cột chứa các pha này đã được sử dụng để tách peptit và protein17,18,19,20,21. Các pha tĩnh ở chế độ hỗn hợp (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, xen kẽ phân cực/RPLC) phù hợp để tách peptit và protein do sự có mặt của cả hai nhóm phân cực và không phân cực22,23,24,25,26,27,28 . Tương tự, các pha tĩnh xen kẽ phân cực với các nhóm phân cực liên kết cộng hóa trị cho thấy khả năng phân tách tốt và tính chọn lọc duy nhất đối với các chất phân tích phân cực và không phân cực, vì sự phân tách phụ thuộc vào sự tương tác giữa chất phân tích và pha tĩnh.Tương tác đa phương thức 29, 30, 31, 32. Gần đây, Zhang et al.30 đã điều chế pha tĩnh polyamine kết thúc dodecyl và tách thành công hydrocacbon, chất chống trầm cảm, flavonoid, nucleoside, estrogen và một số chất phân tích khác. Bộ phân cực xen kẽ có cả nhóm phân cực và nhóm không phân cực, do đó, nó có thể được sử dụng để tách peptit và protein có cả gốc kỵ nước và ưa nước. Cột nhúng cực (ví dụ: cột C18 nhúng amide) có sẵn trên thị trường dưới tên thương mại Ascentis Express RP-Amide cột, nhưng những cột này chỉ được sử dụng để phân tích amin 33.
Trong nghiên cứu hiện tại, một pha tĩnh nhúng phân cực (polystyrene nhúng N-phenylmaleimide) đã được điều chế và đánh giá để phân tách các peptide và chất tiêu hóa trypsin của HSA. Pha tĩnh được điều chế bằng cách sử dụng chiến lược sau. Các hạt silica xốp được điều chế theo quy trình được đưa ra trong ấn phẩm trước đây của chúng tôi với một số sửa đổi đối với quy trình chuẩn bị. Tỷ lệ urê, polyetylen glycol (PEG), TMOS, axit axetic trong nước đã được điều chỉnh để điều chế các hạt silica có kích thước lỗ lớn. Thứ hai, một phối tử mới, phenylmaleimide-metyl vinyl isocyanate, được tổng hợp và sử dụng để tạo dẫn xuất các hạt silica để chuẩn bị pha tĩnh nhúng phân cực. Pha tĩnh thu được được nhồi vào cột thép không gỉ (id 100 × 1,8 mm) bằng cách sử dụng sơ đồ nhồi tối ưu. Việc nhồi cột được hỗ trợ với rung động cơ học để đảm bảo lớp đồng nhất được hình thành trong cột. Đánh giá quá trình tách cột nhồi hỗn hợp peptit bao gồm năm peptit;(Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) và chất tiêu hóa Trypsin của albumin huyết thanh người (HAS). Hỗn hợp peptit và chất tiêu hóa trypsin của HSA đã được quan sát thấy là phân tách với độ phân giải và hiệu quả tốt. Hiệu suất phân tách của cột PMP được so sánh với hiệu suất của cột RP-Amide Ascentis Express. Cả peptide và protein đều được quan sát thấy là được giải quyết tốt và hiệu quả trên cột PMP, hiệu quả hơn cột Ascentis Express RP-Amide.
PEG (Polyethylene Glycol), Urê, Axit axetic, Trimethoxy Orthosilicate (TMOS), Trimethyl Chlorosilane (TMCS), Trypsin, Albumin huyết thanh người (HSA), Amoni Clorua, Urê, Hexan Methyldisilazane (HMDS), Methacryloyl Clorua (MC), Styren, 4-Hydroxy-TEMPO, Benzoyl Peroxide (BPO), Acetonitril cấp HPLC (ACN), Meth anol, 2-Propanol và Acetone Mua từ Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, Hoa Kỳ).
Một hỗn hợp gồm urê (8 g), polyetylen glycol (8 g) và 8 mL axit axetic 0,01 N được khuấy trong 10 phút, sau đó 24 mL TMOS được thêm vào trong điều kiện lạnh như băng. Hỗn hợp phản ứng được gia nhiệt ở 40°C trong 6 giờ và sau đó ở 120°C trong 8 giờ trong nồi hấp bằng thép không gỉ. lò nung và nung ở 550°C trong 12 giờ. Ba lô đã được chuẩn bị và đặc trưng để kiểm tra khả năng tái lập về kích thước hạt, kích thước lỗ xốp và diện tích bề mặt.
Bằng cách biến đổi bề mặt của các hạt silica với phối tử phenylmaleimide-metylvinylisocyanate (PCMP) được tổng hợp trước, sau đó trùng hợp xuyên tâm với styren, một hợp chất chứa nhóm phân cực đã được điều chế.Pha tĩnh cho cốt liệu và chuỗi polystyrene. Quá trình chuẩn bị được mô tả bên dưới.
N-phenylmaleimide (200 mg) và metyl vinyl isocyanate (100 mg) được hòa tan trong toluen khô và 0,1 mL 2,2′-azoisobutyronitrile (AIBN) được thêm vào bình phản ứng để điều chế chất đồng trùng hợp phenylmaleimide-metyl vinyl isocyanate (PMCP). Hỗn hợp này được gia nhiệt ở 60°C trong 3 giờ, được lọc và sấy khô trong tủ sấy ở 40°C trong 3 giờ.
Các hạt silica khô (2 g) được phân tán trong toluen khô (100 mL), khuấy và sonicated trong bình đáy tròn 500 mL trong 10 phút. PMCP (10 mg) được hòa tan trong toluen và thêm từng giọt vào bình phản ứng qua phễu nhỏ giọt. Hỗn hợp này được hồi lưu ở 100°C trong 8 giờ, được lọc và rửa bằng axeton và sấy khô ở 60°C trong 3 giờ. Sau đó, các hạt silica liên kết với PMCP (100 g) được hòa tan trong toluen (200 ml) và 4-hydroxy-TEMPO (2 mL) được thêm vào với sự có mặt của 100 µL dibutyltin loãng làm chất xúc tác. Hỗn hợp này được khuấy ở 50°C trong 8 giờ, được lọc và sấy khô ở 50°C trong 3 giờ.
Styren (1 mL), benzoyl peroxide BPO (0,5 mL) và các hạt silica gắn với TEMPO-PMCP (1,5 g) được phân tán trong toluene và làm sạch bằng nitơ. Quá trình trùng hợp styren được thực hiện ở 100°C trong 12 giờ. Sản phẩm thu được được rửa bằng metanol và sấy khô ở 60°C qua đêm. Sơ đồ phản ứng tổng thể được thể hiện trong Hình 1.
Các mẫu được khử khí ở 393 K trong 1 giờ để thu được áp suất dư nhỏ hơn 10-3 Torr. Lượng N2 được hấp phụ ở áp suất tương đối P/P0 = 0,99 được sử dụng để xác định tổng thể tích lỗ rỗng. Hình thái của các hạt silica trần và liên kết phối tử được kiểm tra bằng kính hiển vi điện tử quét (Hitachi High Technologies, Tokyo, Nhật Bản). Các mẫu khô (các hạt silica trần và các hạt silica liên kết phối tử) được đặt trên một tấm nhôm. cột sử dụng băng dính carbon. Vàng được mạ lên các mẫu bằng cách sử dụng máy phủ phún xạ Q150T và một lớp Au 5 nm được lắng đọng trên các mẫu. Điều này giúp cải thiện hiệu quả quá trình sử dụng điện áp thấp và cung cấp phương pháp phún xạ lạnh, hạt mịn. Máy phân tích nguyên tố Flash EA1112 của Thermo Electron (Waltham, MA, Hoa Kỳ) đã được sử dụng để phân tích nguyên tố. Máy phân tích kích thước hạt Mastersizer 2000 của Malvern (Worcestershire, Vương quốc Anh) đã được sử dụng để thu được sự phân bố kích thước hạt. các hạt và các hạt silica liên kết phối tử (5 mg mỗi hạt) được phân tán trong 5 mL isopropanol, được siêu âm trong 10 phút, xoáy trong 5 phút và đặt trên băng ghế quang học của Mastersizer. Phân tích nhiệt trọng lượng được thực hiện với tốc độ 5 °C mỗi phút trong khoảng nhiệt độ từ 30 đến 800 °C.
Các cột lỗ hẹp bằng thép không gỉ lót thủy tinh có kích thước (id 100 × 1,8 mm) được nhồi bằng phương pháp nhồi bùn, áp dụng quy trình tương tự được sử dụng trong Ref.31. Cột thép không gỉ (lót bằng thủy tinh, id 100 × 1,8 mm) có đầu nối đầu ra chứa frit 1 µm được kết nối với máy đóng gói huyền phù (Alltech Deerfield, IL, Hoa Kỳ). Chuẩn bị huyền phù pha tĩnh bằng huyền phù 150 mg pha tĩnh trong 1,2 mL metanol và gửi nó vào cột lưu trữ. Methanol được sử dụng làm dung môi huyền phù cũng như dung môi đẩy. Đổ đầy cột tuần tự bằng cách áp dụng áp suất 100 MP trong 10 phút, 80 MP trong 15 phút và 60 MP trong 30 phút. Trong quá trình đóng gói, rung cơ học được áp dụng với hai máy lắc cột GC (Alltech, Deerfield, IL, Hoa Kỳ) để đảm bảo cột được đóng gói đồng đều. Đóng bộ đóng gói huyền phù và xả áp suất từ ​​từ để tránh bất kỳ hư hỏng nào trong cột. Ngắt kết nối cột khỏi bộ phận đóng gói huyền phù và kết nối một phụ kiện khác với đầu vào và với hệ thống LC để kiểm tra hiệu suất của nó.
Một máy bơm LC (10AD Shimadzu, Nhật Bản), bộ tiêm (Valco (USA) C14 W.05) với vòng tiêm 50nL, bộ khử khí màng (Shimadzu DGU-14A), cửa sổ mao quản UV-VIS đã được chế tạo Máy dò thiết bị µLC đặc biệt (UV-2075) và các vi cột lót thủy tinh. Sử dụng ống nối rất hẹp và ngắn để giảm thiểu ảnh hưởng của việc mở rộng dải cột phụ. Sau khi đóng gói, các mao quản (50 μm id 3 65 và các mao quản liên kết khử (50 μm) đã được lắp đặt ở đầu ra 1/16″ của liên kết khử. Việc thu thập dữ liệu và xử lý sắc ký được thực hiện bằng phần mềm Multichro 2000. Việc giám sát ở bước sóng 254 nm Các chất phân tích đã được kiểm tra độ hấp thụ tia cực tím. Dữ liệu sắc ký được phân tích bởi OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumin từ huyết thanh người, bột đông khô, ≥ 96% (điện di trên gel agarose) 3 mg trộn với trypsin (1,5 mg), urê 4,0 M (1 mL) và amoni bicacbonat 0,2 M (1 mL). Khuấy dung dịch trong 10 phút và giữ trong bể nước ở 37°C trong 6 giờ, sau đó dập tắt bằng 1 mL TFA 0,1%. Lọc dung dịch và bảo quản ở nhiệt độ dưới 4°C.
Quá trình phân tách hỗn hợp peptit và quá trình phân hủy trypsin HSA được đánh giá riêng biệt trên các cột PMP. Kiểm tra quá trình phân tách hỗn hợp peptit và quá trình phân hủy trypsin của HSA bằng cột PMP và so sánh kết quả với cột Ascentis Express RP-Amide. Số đĩa lý thuyết được tính như sau:
Ảnh SEM của các hạt silica trần và các hạt silica liên kết phối tử được thể hiện trên FIG.2 .Ảnh SEM của các hạt silica trần (A, B) cho thấy, trái ngược với các nghiên cứu trước đây của chúng tôi, các hạt này có dạng hình cầu trong đó các hạt bị kéo dài hoặc có tính đối xứng không đều. Bề mặt của các hạt silica liên kết phối tử (C, D) mịn hơn bề mặt của các hạt silica trần, điều này có thể là do lớp phủ của các chuỗi polystyrene trên bề mặt của các hạt silica.
Hình ảnh kính hiển vi điện tử quét của các hạt silica trần (A, B) và các hạt silica liên kết phối tử (C, D).
Sự phân bố kích thước hạt của các hạt silica trần và các hạt silica liên kết phối tử được thể hiện trong Hình 3(A). Các đường cong phân bố kích thước hạt dựa trên thể tích cho thấy kích thước của các hạt silica tăng lên sau khi biến đổi hóa học (Hình 3). Dữ liệu phân bố kích thước hạt của các hạt silica từ nghiên cứu hiện tại và nghiên cứu trước đó được so sánh trong Bảng 1(A). Kích thước hạt dựa trên thể tích, d(0,5), của PMP là 3,36 μm, so với nghiên cứu trước đây của chúng tôi với giá trị quảng cáo (0,5) là 3 0,05 μm (các hạt silica liên kết với polystyren)34. Lô này có sự phân bố kích thước hạt hẹp hơn so với nghiên cứu trước đây của chúng tôi do các tỷ lệ khác nhau của PEG, urê, TMOS và axit axetic trong hỗn hợp phản ứng. Kích thước hạt của pha PMP lớn hơn một chút so với kích thước của pha hạt silica liên kết với polystyren mà chúng tôi đã nghiên cứu trước đây. Điều này có nghĩa là chức năng hóa bề mặt của các hạt silica với styren chỉ lắng đọng một lớp polystyren (0,97 µm) trên bề mặt silica, trong khi ở pha PMP là lớp độ dày là 1,38 µm.
Sự phân bố kích thước hạt (A) và sự phân bố kích thước lỗ rỗng (B) của các hạt silica trần và các hạt silica liên kết phối tử.
Kích thước lỗ rỗng, thể tích lỗ rỗng và diện tích bề mặt của các hạt silica trong nghiên cứu hiện tại được đưa ra trong Bảng 1 (B). Cấu hình PSD của các hạt silica trần và các hạt silica liên kết phối tử được thể hiện trong Hình 3 (B). Kết quả có thể so sánh với nghiên cứu trước đây của chúng tôi. Kích thước lỗ rỗng của các hạt silica trần và liên kết phối tử lần lượt là 310 và 241, điều này cho thấy rằng kích thước lỗ rỗng giảm 69 sau khi biến đổi hóa học, như trong Bảng 1 (B) và sự thay đổi của đường cong được thể hiện trong Hình 3(B). Tương tự, thể tích lỗ rỗng của các hạt silica giảm từ 0,67 xuống 0,58 cm3/g sau khi biến đổi hóa học. Diện tích bề mặt riêng của các hạt silica được nghiên cứu hiện tại là 116 m2/g, tương đương với nghiên cứu trước đây của chúng tôi (124 m2/g). Như thể hiện trong Bảng 1(B), diện tích bề mặt (m2/g) của các hạt silica cũng giảm từ 116 m2/g xuống 105 m2 / g sau khi sửa đổi hóa học.
Kết quả phân tích nguyên tố của pha tĩnh được trình bày trong Bảng 2. Tải lượng carbon của pha tĩnh hiện tại là 6,35%, thấp hơn tải lượng carbon trong nghiên cứu trước đây của chúng tôi (các hạt silica liên kết polystyrene, lần lượt là 7,93%35 và 10,21%). ylisocyanate (PCMP) và 4-hydroxy-TEMPO đã được sử dụng. Phần trăm trọng lượng nitơ của pha tĩnh hiện tại là 2,21%, so với 0,1735 và 0,85% theo trọng lượng của nitơ trong các nghiên cứu trước đây. Điều này có nghĩa là % khối lượng nitơ cao hơn trong pha tĩnh hiện tại do phenylmaleimide. Tương tự, lượng cacbon của các sản phẩm (4) và (5) lần lượt là 2,7% và 2,9%. trong khi tải lượng cacbon của sản phẩm cuối cùng (6) là 6,35%, như thể hiện trong Bảng 2. Mức giảm trọng lượng được kiểm tra với pha tĩnh PMP và đường cong TGA được thể hiện trong Hình 4. Đường cong TGA cho thấy mức giảm trọng lượng là 8,6%, phù hợp tốt với tải lượng cacbon (6,35%) vì các phối tử không chỉ chứa C mà còn chứa cả N, O và H.
Phối tử phenylmaleimide-metylvinylisocyanate được chọn để biến đổi bề mặt của các hạt silica vì nó có các nhóm phenylmaleimide và nhóm vinylisocyanate phân cực. Các nhóm vinyl isocyanate có thể phản ứng thêm với styren bằng phản ứng trùng hợp gốc sống. Lý do thứ hai là chèn một nhóm có tương tác vừa phải với chất phân tích và không có tương tác tĩnh điện mạnh giữa chất phân tích và pha tĩnh, vì gốc phenylmaleimide không có điện tích ảo ở pH bình thường. Độ phân cực của trạm Pha tĩnh có thể được kiểm soát bởi lượng styren tối ưu và thời gian phản ứng trùng hợp gốc tự do. Bước cuối cùng của phản ứng (trùng hợp gốc tự do) là rất quan trọng và có thể thay đổi tính phân cực của pha tĩnh. Phân tích nguyên tố được thực hiện để kiểm tra tải lượng cacbon của các pha tĩnh này. Người ta quan sát thấy rằng việc tăng lượng styren và thời gian phản ứng sẽ làm tăng tải trọng cacbon của pha tĩnh và ngược lại. Các SP được điều chế với nồng độ styren khác nhau có tải trọng cacbon khác nhau. Một lần nữa, tải các pha tĩnh này vào thép không gỉ cột và kiểm tra hiệu suất sắc ký của chúng (độ chọn lọc, độ phân giải, giá trị N, v.v.). Dựa trên các thí nghiệm này, một công thức tối ưu hóa đã được chọn để chuẩn bị pha tĩnh PMP nhằm đảm bảo độ phân cực được kiểm soát và khả năng lưu giữ chất phân tích tốt.
Năm hỗn hợp peptide (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enkephalin) cũng được đánh giá bằng cột PMP sử dụng pha động;60/40 (v/v) acetonitril/nước (0,1% TFA) ở tốc độ dòng 80 μL/phút. Trong các điều kiện rửa giải tối ưu, số đĩa lý thuyết (N) trên mỗi cột (id 100 × 1,8 mm) là 20.000 ± 100 (200.000 đĩa/m²). Bảng 3 đưa ra các giá trị N cho ba cột PMP và sắc ký đồ được thể hiện trong Hình 5A. Phân tích nhanh trên cột PMP ở tốc độ dòng chảy cao (700 μL/phút), 5 peptit được rửa giải trong vòng 1 phút, giá trị N rất tốt, 13.500 ± 330 trên mỗi cột (100 × 1,8 mm id), Tương ứng với 135.000 đĩa/m (Hình 5B). Nồng độ chất phân tích cho mỗi cột được ghi lại bằng cách sử dụng các điều kiện rửa giải tối ưu và số lượng đĩa lý thuyết N và thời gian lưu để tách cùng một hỗn hợp thử nghiệm trên mỗi cột. Dữ liệu về độ tái lập cho các cột PMP được trình bày trong Bảng 4. Độ tái lập của cột PMP tương quan tốt với các giá trị %RSD rất thấp, như thể hiện trong Bảng 3.
Tách hỗn hợp peptide trên cột PMP (B) và cột Ascentis Express RP-Amide (A);pha động 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), kích thước cột PMP (id 100 × 1,8 mm);phân tích Thứ tự rửa giải của các hợp chất: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) và 5 (leucine) axit enkephalin)).
Cột PMP (id 100 × 1,8 mm) được đánh giá để phân tách các chất tiêu hóa tryptic của albumin huyết thanh người trong sắc ký lỏng hiệu năng cao. Sắc ký đồ trong Hình 6 cho thấy mẫu được phân tách tốt và độ phân giải rất tốt. Các chất tiêu hóa HSA được phân tích bằng cách sử dụng tốc độ dòng chảy 100 µL/phút, pha động 70/30 axetonitril/nước và 0,1% TFA. Như thể hiện trong sắc ký đồ (Hình 6), quá trình tiêu hóa HSA đã được tách thành 17 pic tương ứng với 17 peptit. Hiệu suất tách của mỗi pic trong HSA phân hủy đã được tính toán và các giá trị được đưa ra trong Bảng 5.
Một bản tóm tắt tryptic của HSA (id 100 × 1,8 mm) đã được phân tách trên cột PMP;tốc độ dòng chảy (100 µL/phút), pha động 60/40 axetonitril/nước với 0,1% TFA.
Trong đó L là chiều dài cột, η là độ nhớt của pha động, ΔP là áp suất ngược của cột và u là vận tốc tuyến tính của pha động. Độ thấm của cột PMP là 2,5 × 10-14 m2, tốc độ dòng chảy là 25 μL/phút và 60/40 v/v ACN/nước đã được sử dụng. Độ thấm của cột PMP (100 × 1,8 mm id) tương tự như nghiên cứu trước đây của chúng tôi Tham khảo 34. Độ thấm của cột chứa các hạt xốp bề mặt là: 1,7 × 10-15 đối với các hạt 1,3 μm, 3,1 × 10-15 đối với các hạt 1,7 μm, 5,2 × 10-15 và 2,5 × 10-14 m2 đối với các hạt 2,6 μm Đối với các hạt 5 μm 43. Do đó, độ thấm của pha PMP tương tự như tính thấm của các hạt lõi-vỏ 5 μm.
trong đó Wx là trọng lượng của cột được nhồi bằng chloroform, Wy là trọng lượng của cột được nhồi bằng metanol và ρ là tỷ trọng của dung môi. Tỷ trọng của metanol (ρ = 0,7866) và chloroform (ρ = 1,484). Tổng độ xốp của cột SILICA ParticleLES-C18 (id 100 × 1,8 mm) 34 và cột C18-Urê 31 mà chúng tôi đã nghiên cứu trước đây là 0,63 và 0,55, tương ứng. Điều này có nghĩa là sự có mặt của các phối tử urê làm giảm tính thấm của pha tĩnh. Mặt khác, tổng độ xốp của cột PMP (id 100 × 1,8 mm) là 0,60. Độ thấm của cột PMP thấp hơn so với các cột chứa các hạt silica liên kết C18 vì trong pha tĩnh loại C18, các phối tử C18 được gắn vào các hạt silica dưới dạng chuỗi tuyến tính, trong khi ở pha tĩnh loại polystyrene , lớp polymer tương đối dày được hình thành xung quanh nó. Trong một thí nghiệm điển hình, độ xốp của cột được tính như sau:
Fig.7A,B thể hiện cột PMP (id 100 × 1,8 mm) và cột Ascentis Express RP-Amide (id 100 × 1,8 mm) sử dụng cùng điều kiện rửa giải (nghĩa là 60/40 ACN/H2O và 0,1% TFA).) của âm mưu van Deemter.Các hỗn hợp peptit chọn lọc (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) được điều chế ở 20 µL/ Tốc độ dòng tối thiểu cho cả hai cột là 800 µL/phút. Các giá trị HETP tối thiểu ở tốc độ dòng tối ưu (80 µL/phút) cho cột PMP và cột RP-Amide Ascentis Express tương ứng là 2,6 µm và 3,9 µm. Các giá trị HETP cho thấy hiệu quả phân tách của cột PMP (id 100 × 1,8 mm) tốt hơn nhiều so với cột Ascentis Express RP-Amide có bán trên thị trường (id 100 × 1,8 mm). Biểu đồ van Deemter trong Hình 7(A) cho thấy giá trị N giảm khi lưu lượng tăng là không đáng kể so với nghiên cứu trước đây của chúng tôi. Hiệu suất tách cao hơn của cột PMP (1 00 × 1,8 mm id) so với cột Ascentis Express RP-Amide dựa trên những cải tiến về hình dạng, kích thước hạt và quy trình đóng gói cột phức tạp được sử dụng trong công việc hiện tại34.
. A.
Pha tĩnh polystyrene nhúng phân cực đã được điều chế và đánh giá để tách các hỗn hợp peptit tổng hợp và các chất tiêu hóa trypsin của albumin huyết thanh người (HAS) trong sắc ký lỏng hiệu năng cao. Hiệu suất sắc ký của cột PMP đối với hỗn hợp peptit là tuyệt vời về hiệu quả phân tách và độ phân giải. Hiệu suất phân tách được cải thiện của các cột PMP là do nhiều lý do, chẳng hạn như kích thước hạt và kích thước lỗ của các hạt silica, kiểm soát quá trình tổng hợp pha tĩnh và đóng gói cột phức tạp. Ngoài hiệu quả phân tách cao, áp suất ngược cột thấp tại tốc độ dòng chảy cao là một ưu điểm khác của pha tĩnh này. Cột PMP thể hiện khả năng tái sản xuất tốt và có thể được sử dụng để phân tích hỗn hợp peptit và quá trình tiêu hóa trypsin của nhiều loại protein khác nhau. Chúng tôi dự định sử dụng cột này để tách các sản phẩm tự nhiên, hợp chất hoạt tính sinh học từ cây thuốc và chất chiết xuất từ ​​nấm trong sắc ký lỏng. Trong tương lai, cột PMP cũng sẽ được đánh giá để tách protein và kháng thể đơn dòng.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Nghiên cứu về các hệ thống tách peptit bằng sắc ký pha đảo ngược Phần I: Phát triển giao thức mô tả đặc tính cột.J.Sắc ký.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al.Các peptit hoạt tính cải tiến được thiết kế để điều trị các bệnh truyền nhiễm.Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429.https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Peptide trị liệu tổng hợp: khoa học và thị trường.drug Discovery.15 (1-2) hôm nay, 40-56.https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Sắc ký lỏng proteomic nâng cao.J.Sắc ký.A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. và cộng sự. Phép đo phổ khối sắc ký lỏng nâng cao cho phép kết hợp các chất chuyển hóa và proteomics được nhắm mục tiêu rộng rãi.anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Vai trò của UHPLC trong phát triển thuốc.J.Tháng 9 Sci.30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Các khía cạnh cơ bản và thực tế của sắc ký lỏng siêu cao áp để phân tách nhanh.J.Tháng 9 Sci.30(8), 1167-1182.https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Ứng dụng sắc ký lỏng hiệu năng cực cao trong phát triển thuốc.J.Sắc ký.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Hydrogel macropious nguyên khối được điều chế từ nhũ tương pha bên trong dầu trong nước cao để tinh chế hiệu quả enteroviruses.Chemical.Britain.J.401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Vai trò của sắc ký lỏng trong proteomics.J.Sắc ký.A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. & Guillarme, D. Các xu hướng mới nổi trong phân tách sắc ký lỏng pha đảo ngược của peptide và protein điều trị: lý thuyết và ứng dụng.J.Dược.Khoa học Y sinh.anus.69, 27-9 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Phân tách hai chiều peptide bằng hệ thống RP-RP-HPLC sử dụng các giá trị pH khác nhau trong chiều phân tách thứ nhất và thứ hai.J.Tháng 9 Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. và cộng sự. Các đặc tính truyền khối và hiệu suất động học của các cột sắc ký hiệu suất cao được đóng gói với các hạt C18 dưới 2 μm hoàn toàn và bề mặt xốp đã được nghiên cứu.J.Tháng 9 Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al.Xu hướng gần đây và những thách thức phân tích trong việc phân lập, xác định và xác nhận các peptide có hoạt tính sinh học thực vật.anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB et al.Cảnh quan proteomic của vương quốc sự sống.Nature 582(7813), 592-596.https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. và cộng sự. Xử lý xuôi dòng các peptide trị liệu bằng sắc ký lỏng chuẩn bị.Molecule (Basel, Thụy Sĩ) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Sắc ký chế độ hỗn hợp và ứng dụng của nó đối với polyme sinh học.J.Sắc ký.A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y.& Sun, Y. Phối tử cho sắc ký protein chế độ hỗn hợp: nguyên tắc, đặc tính và thiết kế.J.Công nghệ sinh học.144(1), 11-3 (2009).