Cảm ơn bạn đã truy cập Nature.com. Bạn đang sử dụng phiên bản trình duyệt có hỗ trợ CSS hạn chế. Để có trải nghiệm tốt nhất, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng trình duyệt đã cập nhật (hoặc tắt Chế độ tương thích trong Internet Explorer). Ngoài ra, để đảm bảo hỗ trợ liên tục, chúng tôi hiển thị trang web không có kiểu dáng và JavaScript.
Hiển thị một vòng quay gồm ba slide cùng một lúc. Sử dụng các nút Trước và Tiếp theo để di chuyển qua ba slide cùng một lúc hoặc sử dụng các nút thanh trượt ở cuối để di chuyển qua ba slide cùng một lúc.
Các hạt silica xốp được chế tạo bằng phương pháp sol-gel với một số sửa đổi để thu được các hạt có lỗ rộng. Các hạt này được dẫn xuất hóa bằng N-phenylmaleimide-methylvinyl isocyanate (PMI) và styrene thông qua phản ứng trùng hợp phân mảnh chuyển chuỗi ngược (RAFT) để tạo ra polyamit xen kẽ N-phenylmaleimide. Pha tĩnh styrene (PMP). Các cột thép không gỉ có lỗ hẹp (đường kính trong 100 × 1,8 mm) được nhồi bằng vật liệu nhồi dạng bùn. Hiệu suất sắc ký của cột PMP được đánh giá để tách hỗn hợp các peptide tổng hợp bao gồm năm peptide (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu amino acid enkephalin) và thủy phân tryptic của albumin huyết thanh người (HAS). Trong điều kiện rửa giải tối ưu, số lượng lý thuyết các đĩa với hỗn hợp peptide đạt 280.000 đĩa/m2. So sánh hiệu suất tách của cột đã phát triển với cột Ascentis Express RP-Amide thương mại, có thể thấy rằng hiệu quả tách của cột PMP vượt trội hơn cột thương mại về hiệu quả tách và độ phân giải.
Ngành công nghiệp dược phẩm sinh học đã trở thành một thị trường toàn cầu đang mở rộng với sự gia tăng đáng kể về thị phần trong những năm gần đây. Với sự phát triển bùng nổ của ngành công nghiệp dược phẩm sinh học1,2,3, nhu cầu phân tích peptide và protein rất lớn. Ngoài peptide mục tiêu, nhiều tạp chất khác nhau được hình thành trong quá trình tổng hợp peptide, do đó cần phải tinh chế bằng sắc ký để có được độ tinh khiết mong muốn của peptide. Việc phân tích và mô tả đặc tính của protein trong dịch cơ thể, mô và tế bào là một nhiệm vụ cực kỳ khó khăn do số lượng lớn các loài có khả năng phát hiện được trong một mẫu duy nhất. Mặc dù phổ khối là một công cụ hiệu quả để giải trình tự peptide và protein, nhưng nếu các mẫu như vậy được đưa trực tiếp vào máy quang phổ khối, thì việc phân tách sẽ không đạt yêu cầu. Vấn đề này có thể được giải quyết bằng cách thực hiện sắc ký lỏng (LC) trước khi phân tích MS, điều này sẽ làm giảm lượng chất phân tích đi vào máy quang phổ khối tại một thời điểm nhất định4,5,6. Ngoài ra, các chất phân tích có thể tập trung trong một vùng hẹp trong quá trình tách pha lỏng, do đó cô đặc các chất phân tích này và tăng độ nhạy của phát hiện MS. Sắc ký lỏng (LC) đã có những tiến bộ đáng kể trong thập kỷ qua và đã trở thành phương pháp được sử dụng rộng rãi để phân tích protein7,8,9,10.
Sắc ký lỏng pha đảo ngược (RP-LC) được sử dụng rộng rãi để tinh chế và tách hỗn hợp peptide bằng cách sử dụng silica biến tính octadecyl (ODS) làm pha tĩnh11,12,13. Tuy nhiên, do cấu trúc phức tạp và bản chất lưỡng tính của chúng,14,15 pha tĩnh RP không thể cung cấp khả năng tách peptide và protein một cách thỏa đáng. Do đó, việc phân tích peptide và protein với các mảnh phân cực và không phân cực đòi hỏi các pha tĩnh được thiết kế đặc biệt để tương tác và giữ lại các chất phân tích này16. Sắc ký hỗn hợp, cung cấp các tương tác đa phương thức, có thể là một phương pháp thay thế cho RP-LC để tách peptide, protein và các hỗn hợp phức tạp khác. Một số pha tĩnh loại hỗn hợp đã được chuẩn bị và các cột chứa các pha tĩnh này được sử dụng để tách peptide và protein17,18,19,20,21. Do sự có mặt của các nhóm phân cực và không phân cực, các pha tĩnh chế độ hỗn hợp (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, xen kẽ phân cực/RPLC) thích hợp để tách peptide và protein22,23,24,25,26,27,28. , các pha tĩnh xen kẽ phân cực với các nhóm phân cực liên kết cộng hóa trị cho thấy khả năng tách tốt và tính chọn lọc độc đáo đối với các chất phân tích phân cực và không phân cực vì sự tách phụ thuộc vào sự tương tác giữa chất phân tích và pha tĩnh Tương tác đa phương thức 29,30,31,32. Gần đây, Zhang và cộng sự 30 đã thu được các pha tĩnh có đầu behenyl của polyamine và tách thành công hydrocarbon, thuốc chống trầm cảm, flavonoid, nucleoside, estrogen và một số chất phân tích khác. Vật liệu tĩnh nhúng phân cực có cả nhóm phân cực và không phân cực, do đó có thể sử dụng để tách peptide và protein thành các phần kỵ nước và ưa nước. Các cột phân cực thẳng hàng (ví dụ: cột C18 có amide thẳng hàng) có tên thương mại là cột Ascentis Express RP-Amide, nhưng các cột này chỉ được sử dụng để phân tích amine 33.
Trong nghiên cứu hiện tại, một pha tĩnh nhúng phân cực (N-phenylmaleimide, polystyrene nhúng) đã được chuẩn bị và đánh giá để tách peptide và cắt tryptic HSA. Chiến lược sau đây đã được sử dụng để chuẩn bị pha tĩnh. Các hạt silica xốp đã được chuẩn bị theo các quy trình được mô tả trong các ấn phẩm trước đây của chúng tôi, với một số thay đổi trong các sơ đồ chuẩn bị 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39. Tỷ lệ urê, polyethylene glycol (PEG), TMOS và axit axetic trong nước đã được điều chỉnh để thu được các hạt silica có kích thước lỗ lớn. Thứ hai, một phối tử phenylmaleimide-methylvinyl isocyanate mới đã được tổng hợp và các hạt silica dẫn xuất của nó đã được sử dụng để chuẩn bị các pha tĩnh nhúng phân cực. Pha tĩnh thu được đã được đóng gói vào một cột thép không gỉ (đường kính trong 100 × 1,8 mm) theo một sơ đồ đóng gói tối ưu. Việc đóng gói cột được hỗ trợ bởi rung động cơ học để đảm bảo một lớp đồng nhất trong cột. Cột đóng gói được đánh giá để tách hỗn hợp peptide gồm năm peptide (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, peptide leucine-enkephalin). và thủy phân tryptic của albumin huyết thanh người (HSA). Người ta quan sát thấy hỗn hợp peptide và dịch tiêu hóa tryptic HSA tách ra với độ phân giải và hiệu quả tốt. Hiệu quả tách của cột PMP được so sánh với cột Ascentis Express RP-Amide. Người ta quan sát thấy peptide và protein có độ phân giải tốt và hiệu quả tách cao trên cột PMP, và hiệu quả tách của cột PMP cao hơn hiệu quả tách của cột Ascentis Express RP-Amide.
PEG (polyethylene glycol), urê, axit axetic, trimethoxyorthosilicate (TMOS), trimethylchlorosilane (TMCS), trypsin, albumin huyết thanh người (HSA), amoni clorua, urê, hexamethylmethacryloyldisilazane (HMDS), methacryloyl clorua (MC), styrene, 4-hydroxy- TEMPO, benzoyl peroxide (BPO), acetonitrile (ACN) cho HPLC, methanol, 2-propanol và acetone. Công ty Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, Hoa Kỳ).
Hỗn hợp urê (8 g), polyethylene glycol (8 g) và 8 ml axit axetic 0,01 N được khuấy trong 10 phút và 24 ml TMOS được thêm vào trong quá trình làm lạnh bằng đá. Hỗn hợp phản ứng được đun nóng ở 40°C trong 6 giờ và sau đó ở 120°C trong 8 giờ trong nồi hấp bằng thép không gỉ. Nước được gạn ra và cặn được sấy khô ở 70°C trong 12 giờ. Các khối mềm khô được nghiền mịn và nung trong lò ở 550°C trong 12 giờ. Ba mẻ được chuẩn bị và đặc trưng để kiểm tra khả năng tái tạo kích thước hạt, kích thước lỗ rỗng và diện tích bề mặt.
Nhóm phân cực và pha tĩnh cho chuỗi polystyrene. Quy trình chuẩn bị được mô tả dưới đây.
N-phenylmaleimide (200 mg) và methyl vinyl isocyanat (100 mg) được hòa tan trong toluen khan, sau đó thêm 0,1 ml 2,2′-azoisobutyronitrile (AIBN) vào bình phản ứng để thu được đồng trùng hợp của phenylmaleimide và methyl vinyl isocyanat (PMCP). Hỗn hợp được đun nóng ở 60°C trong 3 giờ, lọc và sấy khô trong lò ở 40°C trong 3 giờ.
Các hạt silica khô (2 g) được phân tán trong toluen khô (100 ml), khuấy và siêu âm trong 10 phút trong bình tròn đáy 500 ml. PMCP (10 mg) được hòa tan trong toluen và nhỏ từng giọt vào bình phản ứng qua phễu thêm. Hỗn hợp được đun sôi ở 100°C trong 8 giờ, lọc, rửa bằng axeton và sấy khô ở 60°C trong 3 giờ. Sau đó, các hạt silica liên kết với PMCP (100 g) được hòa tan trong toluen (200 ml) và 4-hydroxy-TEMPO (2 ml) được thêm vào đó với sự có mặt của 100 μl dibutyltin dilaurate làm chất xúc tác. Hỗn hợp được khuấy ở 50°C trong 8 giờ, lọc và sấy khô ở 50°C trong 3 giờ.
Styrene (1 ml), benzoyl peroxide BPO (0,5 ml) và các hạt silica gắn vào TEMPO-PMCP (1,5 g) được phân tán trong toluene và được làm sạch bằng nitơ. Quá trình trùng hợp styrene được thực hiện ở 100°C trong 12 giờ. Sản phẩm thu được được rửa bằng methanol và sấy khô qua đêm ở 60°C. Sơ đồ chung của phản ứng được thể hiện trong hình một.
Các mẫu được khử khí ở 393 K trong 1 giờ cho đến khi thu được áp suất dư nhỏ hơn 10–3 Torr. Lượng N2 hấp phụ ở áp suất tương đối P/P0 = 0,99 được sử dụng để xác định tổng thể tích lỗ rỗng. Hình thái của các hạt silica tinh khiết và liên kết với phối tử được kiểm tra bằng kính hiển vi điện tử quét (Hitachi High Technologies, Tokyo, Nhật Bản). Các mẫu khô (các hạt silica tinh khiết và các hạt silica liên kết với phối tử) được đặt trên các thanh nhôm bằng băng carbon. Vàng được lắng đọng trên mẫu bằng thiết bị phun Q150T và một lớp Au dày 5 nm được lắng đọng trên mẫu. Điều này cải thiện hiệu quả của quy trình điện áp thấp và cung cấp khả năng phun lạnh mịn. Phân tích nguyên tố được thực hiện bằng máy phân tích thành phần nguyên tố Flash EA1112 của Thermo Electron (Waltham, MA, Hoa Kỳ). Máy phân tích kích thước hạt Malvern (Worcestershire, Vương quốc Anh) Mastersizer 2000 được sử dụng để thu được phân bố kích thước hạt. Các hạt silica không tráng phủ và các hạt silica liên kết với phối tử (mỗi loại 5 mg) được phân tán trong 5 ml isopropanol, siêu âm trong 10 phút, khuấy trong 5 phút và đặt trên băng ghế quang học Mastersizer. Phân tích nhiệt trọng lượng được thực hiện ở tốc độ 5 °C mỗi phút trong phạm vi nhiệt độ từ 30 đến 800 °C.
Cột thép không gỉ lỗ hẹp lót sợi thủy tinh có kích thước (ID 100 × 1,8 mm) được nhồi bằng phương pháp nạp bùn theo cùng quy trình như trong tài liệu tham khảo 31. Cột thép không gỉ (lót thủy tinh, ID 100 × 1,8 mm) và một đầu ra chứa frit 1 µm được kết nối với máy đóng gói bùn (Alltech Deerfield, IL, Hoa Kỳ). Chuẩn bị huyền phù của pha tĩnh bằng cách huyền phù 150 mg pha tĩnh trong 1,2 ml methanol và đưa vào cột chứa. Methanol được sử dụng làm dung môi bùn và dung môi kiểm soát. Nhồi cột bằng cách áp dụng chuỗi áp suất 100 MP trong 10 phút, 80 MP trong 15 phút và 60 MP trong 30 phút. Quá trình nhồi sử dụng hai máy rung cột sắc ký khí (Alltech, Deerfield, IL, Hoa Kỳ) để rung cơ học nhằm đảm bảo nhồi cột đồng đều. Đóng máy đóng gói bùn và xả áp suất từ ​​từ để tránh làm hỏng dây. Cột được ngắt kết nối khỏi vòi phun bùn và một phụ kiện khác được gắn vào đầu vào và kết nối với hệ thống LC để kiểm tra hoạt động của nó.
Một MLC tùy chỉnh đã được xây dựng bằng cách sử dụng một máy bơm LC (10AD Shimadzu, Nhật Bản), một máy lấy mẫu với vòng tiêm 50 nL (Valco (Hoa Kỳ) C14 W.05), một máy khử khí màng (Shimadzu DGU-14A) và một cửa sổ mao quản UV-VIS. Thiết bị phát hiện (UV-2075) và vi cột tráng men. Sử dụng các ống kết nối rất hẹp và ngắn để giảm thiểu tác động của sự giãn nở cột bổ sung. Sau khi làm đầy cột, lắp một mao quản (50 µm id 365) tại đầu ra của mối nối khử 1/16″ và lắp một mao quản (50 µm) của mối nối khử. Thu thập dữ liệu và xử lý sắc ký được thực hiện bằng phần mềm Multichro 2000. Ở 254 nm, độ hấp thụ tia UV của các chất phân tích của đối tượng được theo dõi ở 0. Dữ liệu sắc ký được phân tích bằng OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumin huyết thanh người, bột đông khô, ≥ 96% (điện di gel agarose) 3 mg trộn với trypsin (1,5 mg), 4,0 M urê (1 ml) và 0,2 M amoni bicarbonate (1 ml). Khuấy dung dịch trong 10 phút và giữ trong bồn nước ở 37°C trong 6 giờ, sau đó làm nguội bằng 1 ml TFA 0,1%. Lọc dung dịch và bảo quản dưới 4°C.
Phân tách hỗn hợp peptide và tryptic digest HSA trên cột PMP được đánh giá riêng. Kiểm tra quá trình thủy phân tryptic của hỗn hợp peptide và HSA được phân tách bằng cột PMP và so sánh kết quả với cột Ascentis Express RP-Amide. Số lượng đĩa lý thuyết được tính bằng phương trình sau:
Hình ảnh SEM của các hạt silica tinh khiết và các hạt silica liên kết với phối tử được thể hiện trong Hình 2. Hình ảnh SEM của các hạt silica tinh khiết (A, B) cho thấy hình cầu trong đó các hạt bị kéo dài hoặc có tính đối xứng không đều so với các nghiên cứu trước đây của chúng tôi. Bề mặt của các hạt silica liên kết với phối tử (C, D) mịn hơn bề mặt của các hạt silica tinh khiết, điều này có thể là do các chuỗi polystyrene bao phủ bề mặt của các hạt silica.
Ảnh chụp bằng kính hiển vi điện tử quét của các hạt silica tinh khiết (A, B) và các hạt silica liên kết phối tử (C, D).
Phân bố kích thước hạt của các hạt silica tinh khiết và các hạt silica liên kết với phối tử được thể hiện trong Hình 2. 3(A). Đường cong phân bố kích thước hạt theo thể tích cho thấy kích thước hạt silica tăng lên sau khi biến tính hóa học (Hình 3A). Dữ liệu phân bố kích thước hạt silica từ nghiên cứu hiện tại và nghiên cứu trước đây được so sánh trong Bảng 1(A). Kích thước hạt theo thể tích d(0,5) của PMP là 3,36 µm, so với giá trị ad(0,5) là 3,05 µm trong nghiên cứu trước đây của chúng tôi (các hạt silica liên kết polystyrene)34. Do sự thay đổi tỷ lệ PEG, urê, TMOS và axit axetic trong hỗn hợp phản ứng, phân bố kích thước hạt của mẻ này hẹp hơn so với nghiên cứu trước đây của chúng tôi. Kích thước hạt của pha PMP lớn hơn một chút so với kích thước hạt của pha hạt silica liên kết polystyrene mà chúng tôi đã nghiên cứu trước đó. Điều này có nghĩa là chức năng hóa bề mặt của các hạt silica với styrene chỉ lắng đọng một lớp polystyrene (0,97 µm) trên bề mặt silica, trong khi ở pha PMP, độ dày lớp là 1,38 µm.
Phân bố kích thước hạt (A) và phân bố kích thước lỗ rỗng (B) của các hạt silica nguyên chất và các hạt silica liên kết phối tử.
Kích thước lỗ, thể tích lỗ và diện tích bề mặt của các hạt silica được sử dụng trong nghiên cứu này được thể hiện trong Bảng 1 (B). Hồ sơ PSD của các hạt silica tinh khiết và các hạt silica liên kết phối tử được thể hiện trong Hình 3(B). Các kết quả tương đương với nghiên cứu trước đây của chúng tôi34. Kích thước lỗ của các hạt silica tinh khiết và liên kết phối tử lần lượt là 310 Å và 241 Å, cho thấy rằng sau khi biến đổi hóa học, kích thước lỗ giảm 69 Å, như thể hiện trong Bảng 1 (B) và đường cong dịch chuyển được thể hiện trong Hình. Diện tích bề mặt riêng của các hạt silica trong nghiên cứu hiện tại là 116 m2/g, tương đương với nghiên cứu trước đây của chúng tôi (124 m2/g). Như thể hiện trong Bảng 1(B), diện tích bề mặt (m2/g) của các hạt silica sau khi biến đổi hóa học cũng giảm từ 116 m2/g xuống 105 m2/g.
Kết quả phân tích thành phần pha tĩnh được trình bày trong Bảng 2. Hàm lượng cacbon của pha tĩnh hiện tại là 6,35%, thấp hơn so với nghiên cứu trước đây của chúng tôi (các hạt silica liên kết với polystyrene, lần lượt là 7,93%35 và 10,21%) 42. Hàm lượng cacbon của pha tĩnh hiện tại bên dưới, vì một số phối tử phân cực như phenylmaleimide methyl vinyl isocyanat (PCMP) và 4-hydroxy-TEMPO đã được sử dụng ngoài styrene trong quá trình điều chế SP. Tỷ lệ phần trăm khối lượng nitơ trong pha tĩnh hiện tại là 2,21% so với 0,1735 và 0,85% trong các nghiên cứu trước đây42. Điều này có nghĩa là pha tĩnh hiện tại có tỷ lệ phần trăm khối lượng nitơ cao do phenylmaleimide. Tương tự như vậy, các sản phẩm (4) và (5) có hàm lượng carbon lần lượt là 2,7% và 2,9%, trong khi sản phẩm cuối cùng (6) có hàm lượng carbon là 6,35%, như thể hiện trong Bảng 2. Phân tích nhiệt trọng lượng (TGA) đã được sử dụng trên pha tĩnh của PMP để kiểm tra sự mất trọng lượng và đường cong TGA được thể hiện trong Hình 4. Đường cong TGA cho thấy sự mất trọng lượng là 8,6%, phù hợp với hàm lượng carbon (6,35%), vì các phối tử không chỉ chứa C mà còn chứa N, O và H.
Phối tử phenylmaleimide-methylvinyl isocyanate được chọn để biến đổi bề mặt của các hạt silica do nhóm phenylmaleimide và vinylisocyanate phân cực của nó. Nhóm vinyl isocyanate có thể phản ứng thêm với styrene bằng cách trùng hợp gốc sống. Lý do thứ hai là chèn một nhóm có tương tác vừa phải với chất phân tích và không có tương tác tĩnh điện mạnh giữa chất phân tích và pha tĩnh, vì phần phenylmaleimide không có điện tích ảo ở pH bình thường. Độ phân cực của pha tĩnh có thể được kiểm soát bằng lượng styrene tối ưu và thời gian phản ứng của quá trình trùng hợp gốc tự do. Bước cuối cùng của phản ứng (trùng hợp gốc tự do) rất quan trọng vì nó làm thay đổi độ phân cực của pha tĩnh. Phân tích nguyên tố đã được thực hiện để kiểm tra hàm lượng cacbon trong các pha tĩnh này. Người ta đã quan sát thấy rằng việc tăng lượng styrene và thời gian phản ứng sẽ làm tăng hàm lượng cacbon của pha tĩnh và ngược lại. SP được chuẩn bị với các nồng độ styrene khác nhau có tải lượng cacbon khác nhau. Tương tự như vậy, các pha tĩnh này được đặt trên các cột thép không gỉ và các đặc điểm sắc ký của chúng (độ chọn lọc, độ phân giải, giá trị N, v.v.) đã được kiểm tra. Dựa trên các thí nghiệm này, một thành phần tối ưu để chuẩn bị pha tĩnh PMP đã được chọn để cung cấp độ phân cực được kiểm soát và khả năng giữ lại chất phân tích tốt.
Cột PMP cũng được đánh giá để phân tích năm hỗn hợp peptide (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine-enkephalin) bằng cách sử dụng dung tích pha động. 60/40 (v/v) ACN/nước (0,1% TFA) ở tốc độ dòng chảy 80 µl/phút. Trong điều kiện rửa giải tối ưu (200.000 đĩa/m), số đĩa lý thuyết (N) trên mỗi cột (100 × 1,8 mm) là 20.000 ± 100. Giá trị N cho ba cột PMP được thể hiện trong Bảng 3 và sắc ký đồ được thể hiện trong Hình 5A. Phân tích nhanh ở tốc độ dòng chảy cao (700 µl/phút) trên cột PMP, năm peptide được rửa giải trong vòng một phút, giá trị N tuyệt vời là 13.500 ± 330 trên mỗi cột (đường kính 100 x 1,8 mm), tương đương với 135.000 đĩa/m2 (Hình 5B). Ba cột có cùng kích thước (đường kính trong 100 x 1,8 mm) được nạp ba mẻ pha tĩnh PMP khác nhau để kiểm tra độ tái lập. Các chất phân tích được ghi lại cho mỗi cột bằng cách tách cùng một hỗn hợp thử nghiệm trên mỗi cột bằng cách sử dụng các điều kiện rửa giải tối ưu, số đĩa lý thuyết N và thời gian lưu. Dữ liệu độ tái lập cho các cột PMP được thể hiện trong Bảng 4. Độ tái lập của cột PMP tương quan tốt với các giá trị %RSD rất thấp như thể hiện trong Bảng 3.
Phân tách hỗn hợp peptide trên cột PMP (B) và cột Ascentis Express RP-Amide (A), pha động 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), kích thước cột PMP (100 x 1,8 mm id), phân tích Thứ tự rửa giải của các hợp chất: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) và 5 (enkephalin axit leucic).
Cột PMP (đường kính trong 100 x 1,8 mm) được đánh giá để tách thủy phân trypsin của albumin huyết thanh người bằng HPLC. Sắc ký đồ trong Hình 6 cho thấy các mẫu được tách tốt với độ phân giải rất tốt. Các dung dịch HSA được phân tích bằng cách sử dụng tốc độ dòng chảy 100 μl/phút, pha động 70/30 acetonitril/nước và 0,1% TFA. Sự cắt của HSA được chia thành 17 đỉnh, như thể hiện trong sắc ký đồ (Hình 6), tương ứng với 17 peptide. Hiệu suất tách của từng đỉnh từ thủy phân HSA đã được tính toán và các giá trị được thể hiện trong Bảng 5.
Thủy phân trypsin HSA được tách trên cột PMP (đường kính trong 100 x 1,8 mm), tốc độ dòng chảy (100 μl/phút), pha động 60/40 acetonitril/nước và 0,1% TFA.
trong đó L là chiều dài cột, η là độ nhớt của pha động, ΔP là áp suất ngược của cột và u là vận tốc tuyến tính của pha động. Độ thấm của cột PMP là 2,5 × 10–14 m2, lưu lượng là 25 µl/phút, sử dụng 60/40 v/v. ACN/nước. Độ thấm của cột PMP (ID 100 × 1,8 mm) tương tự như nghiên cứu Ref.34 trước đây của chúng tôi. Độ thấm của cột chứa các hạt có bề mặt xốp là 1,7 × 10 .6 µm, 2,5 × 10-14 m2 đối với các hạt 5 µm43. Do đó, độ thấm của pha PMP tương tự như độ thấm của các hạt lõi-vỏ có kích thước 5 μm.
trong đó Wx là khối lượng của cột chứa clorofom, Wy là khối lượng của cột chứa metanol và ρ là khối lượng riêng của dung môi. Khối lượng riêng của metanol (ρ = 0,7866) và clorofom (ρ = 1,484). Độ xốp tổng thể của cột hạt silica-C18 (100 × 1,8 mm ID)34 và cột C18-urea31 mà chúng tôi đã nghiên cứu trước đây lần lượt là 0,63 và 0,55. Điều này có nghĩa là sự hiện diện của các phối tử urê làm giảm độ thấm của pha tĩnh. Mặt khác, độ xốp tổng thể của cột PMP (đường kính trong 100 × 1,8 mm) là 0,60. Các cột PMP ít thấm hơn các cột chứa các hạt silica liên kết C18 vì trong các pha tĩnh loại C18, các phối tử C18 được gắn vào các hạt silica theo chuỗi tuyến tính, trong khi trong các pha tĩnh loại polystyrene, một lớp polyme tương đối dày được hình thành xung quanh các hạt. lớp A. Trong một thí nghiệm điển hình, độ xốp của cột được tính như sau:
Trên hình 7A, B hiển thị biểu đồ Van Deemter cho cột PMP (id 100 x 1,8 mm) và cột Ascentis Express RP-Amide (id 100 x 1,8 mm) trong cùng điều kiện rửa giải, 60/40 ACN/H2O và 0,1% TFA 20 µl/phút đến 800 µl/phút trên cả hai cột. Giá trị HETP tối thiểu ở tốc độ dòng chảy tối ưu (80 µl/phút) lần lượt là 2,6 µm và 3,9 µm đối với cột PMP và cột Ascentis Express RP-Amide. Giá trị HETP cho thấy hiệu suất tách của cột PMP (id 100 x 1,8 mm) cao hơn nhiều so với hiệu suất tách của cột Ascentis Express RP-Amide có bán trên thị trường (id 100 x 1,8 mm). Biểu đồ van Deemter trong Hình 7(A) cho thấy giá trị N giảm không cao hơn đáng kể khi tăng lưu lượng so với nghiên cứu trước đây của chúng tôi. Hiệu suất tách cao hơn của cột PMP (id 100 × 1,8 mm) so với cột Ascentis Express RP-Amide dựa trên hình dạng và kích thước hạt được cải thiện và quy trình đóng gói cột tinh vi được sử dụng trong công việc hiện tại34.
(A) Biểu đồ Van Deemter (HETP so với vận tốc tuyến tính của pha động) thu được trên cột PMP (id 100 x 1,8 mm) trong 60/40 ACN/H2O với 0,1% TFA. (B) Biểu đồ Van Deemter (HETP so với vận tốc tuyến tính của pha động) thu được trên cột Ascentis Express RP-Amide (id 100 x 1,8 mm) trong 60/40 ACN/H2O với 0,1% TFA.
Pha tĩnh phân cực của polystyrene xen kẽ đã được chuẩn bị và đánh giá để tách hỗn hợp peptide tổng hợp và thủy phân trypsin của albumin huyết thanh người (HSA) trong sắc ký lỏng hiệu suất cao. Hiệu suất sắc ký của cột PMP đối với hỗn hợp peptide là tuyệt vời về hiệu quả tách và độ phân giải. Hiệu quả tách được cải thiện của cột PMP là do một số lý do như kích thước hạt silica và kích thước lỗ rỗng, tổng hợp có kiểm soát các pha tĩnh và vật liệu đóng gói cột phức tạp. Ngoài hiệu quả tách cao, một ưu điểm khác của pha tĩnh này là áp suất ngược của cột thấp ở tốc độ dòng chảy cao. Cột PMP có khả năng tái tạo cao và có thể được sử dụng để phân tích hỗn hợp peptide và tiêu hóa trypsin của nhiều loại protein khác nhau. Chúng tôi dự định sử dụng cột này để tách các hợp chất hoạt tính sinh học từ các sản phẩm tự nhiên, chiết xuất từ ​​cây thuốc và nấm trong sắc ký lỏng. Trong tương lai, cột PMP cũng sẽ được đánh giá để tách protein và kháng thể đơn dòng.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Nghiên cứu về hệ thống tách peptide sắc ký pha đảo ngược phần I: Phát triển giao thức để xác định đặc tính cột. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Nghiên cứu về hệ thống tách peptide sắc ký pha đảo ngược phần I: Phát triển giao thức để xác định đặc tính cột.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H. và Petersson, P. Nghiên cứu hệ thống tách peptide bằng sắc ký pha đảo ngược, Phần I: Phát triển giao thức xác định đặc tính cột. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Nghiên cứu về hệ thống tách peptide sắc ký pha đảo ngược phần I: Phát triển giao thức cho các đặc điểm của cột. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Nghiên cứu về hệ thống tách peptide sắc ký pha đảo ngược phần I: Phát triển giao thức cho các đặc điểm của cột.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H. và Petersson, P. Nghiên cứu hệ thống tách peptide bằng sắc ký pha đảo ngược, Phần I: Phát triển giao thức xác định đặc tính cột.J.色谱法。 1603,113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019)。
Gomez, B. et al. Phương pháp tạo ra các peptide hoạt động cải tiến để điều trị các bệnh truyền nhiễm. Công nghệ sinh học. Thành tựu 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Peptide trị liệu tổng hợp: Khoa học và thị trường. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Peptide trị liệu tổng hợp: Khoa học và thị trường.Vliege P, Lisowski V, Martinez J và Chreschatyski M. Peptide trị liệu tổng hợp: khoa học và thị trường.Vliege P, Lisowski V, Martinez J và Khreschatsky M. Peptide trị liệu tổng hợp: khoa học và thị trường. khám phá thuốc. Today 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Sắc ký lỏng nâng cao về protein. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Sắc ký lỏng nâng cao về protein.Xem F., Smith RD và Shen Yu. Sắc ký lỏng proteomic tiên tiến. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. 高级蛋白质组液相色谱。 Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Thành phần protein nâng cao 液相色谱。Xem F., Smith RD và Shen Yu. Sắc ký lỏng proteomic tiên tiến.J. Sắc ký. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Sắc ký lỏng tiên tiến-phổ khối có thể kết hợp nghiên cứu chuyển hóa học và nghiên cứu protein học trên diện rộng. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Vai trò của UHPLC trong phát triển dược phẩm. Chesnut, SM & Salisbury, JJ Vai trò của UHPLC trong phát triển dược phẩm.Chesnut, SM và Salisbury, JJ Vai trò của UHPLC trong phát triển dược phẩm.Chesnut, SM và Salisbury, JJ Vai trò của UHPLC trong phát triển thuốc. J. Sept Science. 30(8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Các khía cạnh cơ bản và thực tiễn của sắc ký lỏng siêu áp suất để phân tách nhanh. Wu, N. & Clausen, AM Các khía cạnh cơ bản và thực tiễn của sắc ký lỏng siêu áp suất để phân tách nhanh.Wu, N. và Clausen, AM Các khía cạnh cơ bản và thực tiễn của sắc ký lỏng áp suất cao để phân tách nhanh. Wu, N. & Clausen, AM 用于快速分离的超高压液相色谱的基础和实践方面。 Wu, N. & Clausen, AM Các khía cạnh cơ bản và thực tế của sắc ký lỏng áp suất cực cao để phân tách nhanh.Wu, N. và Clausen, AM Các khía cạnh cơ bản và thực tiễn của sắc ký lỏng áp suất cao để phân tách nhanh.J. Khoa học tháng 9. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Sử dụng sắc ký lỏng hiệu suất cao trong phát triển dược phẩm. Wren, SA & Tchelitcheff, P. Sử dụng sắc ký lỏng hiệu suất cao trong phát triển dược phẩm.Ren, SA và Chelischeff, P. Việc sử dụng sắc ký lỏng hiệu suất cực cao trong phát triển dược phẩm. Wren, SA & Tchelitcheff, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用。 Wren, SA và Tchelitcheff, P.Ren, SA và Chelischeff, P. Ứng dụng sắc ký lỏng hiệu suất cao trong phát triển thuốc.J. Sắc ký. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Một hydrogel xốp đơn khối có nguồn gốc từ nhũ tương dầu trong nước với pha bên trong cao để tinh chế hiệu quả enterovirus 71. Dự án hóa học. Tạp chí 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Vai trò của sắc ký lỏng trong nghiên cứu về protein. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Vai trò của sắc ký lỏng trong nghiên cứu về protein.Shi, Y., Xiang, R., Horvath, C. và Wilkins, JA Vai trò của sắc ký lỏng trong nghiên cứu về protein. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA 液相色谱在蛋白质组学中的作用。 Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JAShi, Y., Xiang, R., Horvath, C. và Wilkins, JA Vai trò của sắc ký lỏng trong nghiên cứu về protein.J. Sắc ký. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Vutey, J.-L. & Guillarme, D. Xu hướng mới trong việc tách sắc ký lỏng pha đảo ngược của các peptide và protein điều trị: Lý thuyết và ứng dụng. & Guillarme, D. Xu hướng mới trong việc tách sắc ký lỏng pha đảo ngược của các peptide và protein điều trị: Lý thuyết và ứng dụng. & Guillarme, D. Новые тенденции в разделении терапевтических пептидов и белков с помощью жидкостной хроматографии с обращенной фазой: теория и приложения. & Guillarme, D. Xu hướng mới trong việc tách các peptide và protein điều trị bằng sắc ký lỏng pha đảo ngược: lý thuyết và ứng dụng. & Guillarme, D. 治疗性肽和蛋白质的反相液相色谱分离的新趋势:理论和应用。 và Guillarme, D.và Guillarmé, D. Xu hướng mới trong việc tách các peptide và protein điều trị bằng sắc ký lỏng pha đảo ngược: lý thuyết và ứng dụng.J. Pharm. Khoa học Y sinh. hậu môn. 69, 9–27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Phân tách hai chiều các peptit bằng hệ thống RP-RP-HPLC với độ pH khác nhau ở chiều phân tách thứ nhất và thứ hai. Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Phân tách hai chiều các peptit bằng hệ thống RP-RP-HPLC với độ pH khác nhau ở chiều phân tách thứ nhất và thứ hai.Gilar M., Olivova P., Dali AE và Gebler JK Phân tách hai chiều của peptide bằng hệ thống RP-RP-HPLC với độ pH khác nhau ở chiều phân tách thứ nhất và thứ hai.Gilar M., Olivova P., Dali AE và Gebler JK Phân tách hai chiều của peptide bằng cách sử dụng các giá trị pH khác nhau ở chiều phân tách thứ nhất và thứ hai bằng hệ thống RP-RP-HPLC. J. Sept Science. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Fellitti, S. et al. Nghiên cứu về đặc điểm truyền khối và động học của các cột sắc ký hiệu suất cao được nhồi bằng các hạt C18 xốp hoàn toàn và xốp bề mặt nhỏ hơn 2 µm. J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Xu hướng gần đây và những thách thức phân tích trong việc cô lập, xác định và xác nhận các peptide hoạt tính sinh học thực vật. hậu môn. Sinh vật hậu môn. Hóa học. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Muller, JB et al. Cảnh quan proteomic của vương quốc sự sống. Nature 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
De Luca, K. et al. Xử lý sau các peptit điều trị bằng sắc ký lỏng chuẩn bị. Phân tử (Basel, Thụy Sĩ) 26(15), 4688 (2021).
Yang, Y. & Geng, X. Sắc ký hỗn hợp và ứng dụng của nó đối với polyme sinh học. Yang, Y. & Geng, X. Sắc ký hỗn hợp và ứng dụng của nó đối với polyme sinh học.Yang, Yu. và Geng, X. Sắc ký chế độ hỗn hợp và ứng dụng của nó vào polyme sinh học. Yang, Y. & Geng, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用。 Yang, Y. & Geng, X. Sắc ký chế độ hỗn hợp và ứng dụng của nó trong polyme sinh học.Yang, Yu. và Gene, X. Sắc ký chế độ hỗn hợp và ứng dụng của nó vào polyme sinh học.J. Sắc ký. A 1218(49), 8813–8825 (2011).