Cảm ơn bạn đã ghé thăm Nature.com.Phiên bản trình duyệt bạn đang sử dụng có hỗ trợ CSS hạn chế.Để có trải nghiệm tốt nhất, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng trình duyệt cập nhật (hoặc tắt Chế độ tương thích trong Internet Explorer).Trong thời gian chờ đợi, để đảm bảo hỗ trợ liên tục, chúng tôi sẽ hiển thị trang web không có kiểu và JavaScript.
Angustifolius lupin (NLL, Lupinus angustifolius L.) là cây họ đậu dùng làm lương thực và cải tạo đất.Sự mở rộng toàn cầu của NLL như một loại cây trồng đã thu hút nhiều loại nấm gây bệnh, bao gồm cả bệnh thán thư lupin, gây ra bệnh thán thư tàn khốc.Hai alen, Lanr1 và AnMan, giúp tăng sức đề kháng, đã được sử dụng trong nhân giống NLL, nhưng các cơ chế phân tử cơ bản vẫn chưa được biết.Trong nghiên cứu này, các chỉ thị Lanr1 và AnMan được sử dụng để sàng lọc các mẫu NLL châu Âu.Việc thử nghiệm vắc-xin trong môi trường được kiểm soát đã xác nhận tính hiệu quả của cả những người cho kháng thuốc.Hồ sơ biểu hiện gen khác biệt được thực hiện trên các dòng kháng và nhạy cảm đại diện.Tính kháng bệnh thán thư có liên quan đến sự biểu hiện quá mức của các thuật ngữ bản thể gen “GO:0006952 Phản ứng phòng thủ”, “GO:0055114 Quá trình oxy hóa khử” và “GO:0015979 Quang hợp”.Ngoài ra, dòng Lanr1(83A:476) cho thấy sự tái lập trình hệ phiên mã đáng kể nhanh chóng sau khi cấy, trong khi các dòng khác cho thấy phản ứng này chậm trễ khoảng 42 giờ.Các phản ứng phòng vệ có liên quan đến các gen TIR-NBS, CC-NBS-LRR và NBS-LRR, 10 protein liên quan đến sinh bệnh học, protein chuyển lipid, endoglucan-1,3-β-glucosidase, protein thành tế bào giàu glycine và các gen từ con đường phản ứng của oxy.Các phản ứng ban đầu đối với 83A:476, bao gồm cả việc ức chế cẩn thận các gen liên quan đến quang hợp, trùng khớp với sự bảo vệ thành công trong giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng của nấm, cho thấy rằng một tác nhân kích hoạt khả năng miễn dịch.Phản ứng Mandeloop bị chậm lại, cũng như lực cản ngang tổng thể.
Lupin lá hẹp (NLL, Lupinus angustifolius L.) là một loại ngũ cốc giàu protein có nguồn gốc ở khu vực phía tây Địa Trung Hải1,2.Hiện nay nó được trồng làm cây lương thực cho động vật và con người.Nó cũng được coi là phân xanh trong các hệ thống luân canh cây trồng do vi khuẩn cố định đạm cộng sinh cố định đạm và cải thiện tổng thể cấu trúc đất.NLL đã trải qua một quá trình thuần hóa nhanh chóng trong thế kỷ trước và vẫn đang chịu áp lực nhân giống cao3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.Với việc trồng trọt rộng rãi NLL, sự kế thừa của các loại nấm gây bệnh đã phát triển các hốc nông nghiệp mới và gây ra các bệnh phá hoại mùa màng mới. Điều đáng chú ý nhất đối với những người trồng và nhân giống cây lupin là sự xuất hiện của bệnh thán thư do nấm gây bệnh Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Điều đáng chú ý nhất đối với những người trồng và nhân giống cây lupin là sự xuất hiện của bệnh thán thư do nấm gây bệnh Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров và селекционеров люпина было появление антракноза, в ызванного патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Đáng chú ý nhất đối với nông dân và người chăn nuôi đậu lupin là sự xuất hiện của bệnh thán thư do nấm gây bệnh Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 gây ra.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真菌Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg , Feiler & Hagedorn13 引起的。对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真菌Colletotrichum lupini (Bondar)嵵tóc。1 Наиболее поразительным для фермеров và селекционеров люпина является появление антракноза , вызываемого патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Đáng chú ý nhất đối với nông dân và người chăn nuôi lupin là sự xuất hiện của bệnh thán thư do nấm gây bệnh Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Các báo cáo sớm nhất về căn bệnh này đến từ Brazil và Hoa Kỳ, với các triệu chứng điển hình lần lượt xuất hiện vào năm 1912 và 1929.Tuy nhiên, sau khoảng 30 năm, mầm bệnh được chỉ định là Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorph Glomerella cingulata (Người đá) Spauld. & Sacc., teleomorph Glomerella cingulata (Người đá) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorph của Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld trong Hình thái Mục tiêu. & H. Schrenk,. & H. Schrenk, .và H. Schrenk. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。và H. Schlenk, .Kiểu hình bệnh sơ bộ được thực hiện vào giữa thế kỷ 20 cho thấy một số kháng thuốc ở NLL và các giống đậu lupin vàng (L. luteus L.), nhưng tất cả các giống đậu lupin trắng (L. albus L.) được thử nghiệm đều rất nhạy cảm15,16.Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự phát triển của bệnh thán thư có liên quan đến lượng mưa (độ ẩm không khí) và nhiệt độ tăng (trong khoảng 12-28°C), dẫn đến vi phạm khả năng chống chịu ở nhiệt độ cao hơn17, 18. Trên thực tế, thời gian cần thiết để bào tử hạt nảy mầm và bắt đầu bệnh ngắn hơn bốn lần ở 24°C (4 giờ) so với ở 12°C (16 giờ) trong điều kiện độ ẩm cao19.Do đó, sự nóng lên toàn cầu đang diễn ra đã dẫn đến sự lây lan của bệnh thán thư.Tuy nhiên, căn bệnh này đã được quan sát thấy ở Pháp (1982) và Ukraine (1983) như một dấu hiệu báo trước về một mối đe dọa sắp xảy ra, nhưng dường như ngành công nghiệp đậu lupin đã phớt lờ vào thời điểm đó20,21.Vài năm sau, căn bệnh tàn khốc này lan rộng khắp thế giới và cũng ảnh hưởng đến các quốc gia sản xuất lupin lớn như Úc, Ba Lan và Đức22,23,24.Sau đợt bùng phát bệnh thán thư vào giữa những năm 1990, sàng lọc rộng rãi đã dẫn đến việc xác định một số người cho kháng thuốc trong các mẫu NLL19.Khả năng kháng bệnh thán thư của NLL được kiểm soát bởi hai alen trội riêng biệt được tìm thấy trong các nguồn tế bào mầm khác nhau: Lanr1 trong giống Tanjil và Wonga và AnMan trong giống.Mandalay 25, 26. Các alen này bổ sung cho các chỉ thị phân tử hỗ trợ việc lựa chọn nguồn gen kháng bệnh trong các chương trình nhân giống25,26,27,28,29,30.Dòng nhân giống kháng bệnh 83A:476 mang alen Lanr1 được lai với dòng hoang dã mẫn cảm P27255 để thu được quần thể RIL phân ly tính kháng bệnh thán thư, điều này cho phép gán locus Lanr1 cho nhiễm sắc thể NLL-1131, 32, 33. (NLL-11), nhưng ở các vị trí khác nhau29,34,35.Tuy nhiên, do số lượng RIL ít và khoảng cách di truyền lớn giữa các dấu hiệu và alen tương ứng, không thể đưa ra kết luận đáng tin cậy nào về các gen cơ bản của chúng.Mặt khác, việc sử dụng di truyền ngược ở lupin rất khó khăn do khả năng tái sinh rất thấp của chúng, khiến cho thao tác di truyền trở nên cồng kềnh37.
Sự phát triển của nguồn gen thuần hóa mang alen mong muốn ở trạng thái đồng hợp tử, chẳng hạn như 83A:476 (Lanr1) và Mandelup (AnMan), đã mở ra cơ hội nghiên cứu khả năng kháng bệnh thán thư khi đối mặt với sự hiện diện của các tổ hợp alen đối lập trong quần thể hoang dã.Khả năng của các cơ chế phân tử.So sánh các phản ứng phòng thủ được tạo ra bởi các kiểu gen cụ thể.Nghiên cứu này đã đánh giá phản ứng phiên mã sớm của NLL đối với vắc-xin C. lupini.Đầu tiên, một bảng chất lượng mầm NLL châu Âu chứa 215 dòng đã được sàng lọc bằng cách sử dụng các dấu hiệu phân tử đánh dấu các alen Lanr1 và AnMan.Kiểu hình bệnh thán thư sau đó được thực hiện trên 50 dòng NLL, được chọn trước đó cho các chỉ thị phân tử, trong các điều kiện được kiểm soát.Dựa trên những thí nghiệm này, bốn dòng khác nhau về tính kháng bệnh thán thư và thành phần alen Lanr1/AnMan đã được chọn để lập hồ sơ biểu hiện gen phòng vệ khác biệt bằng cách sử dụng hai phương pháp bổ sung: giải trình tự RNA thông lượng cao và định lượng PCR thời gian thực.
Sàng lọc một bộ tế bào mầm NLL (N = 215) với các dấu hiệu Lanr1 (Anseq3 và Anseq4) và AnMan (Anseq4) và AnMan (AnManM1) cho thấy rằng chỉ có một dòng (95726, gần Salamanca-b) khuếch đại alen “kháng” cho tất cả các dấu hiệu , trong khi “Sự hiện diện của các alen 'nhạy cảm'” tìm thấy tỷ lệ của tất cả các dấu hiệu trong 158 (~73,5 %) dòng.13 dòng tạo ra 2 alen “kháng” của Lanr1, và 8 dòng tạo ra các alen “kháng” Lanr1.đánh dấu.Alen “kháng” của chỉ thị AnMan (Bảng bổ trợ S1).Hai dòng dị hợp tử đối với dấu hiệu Anseq3 và một dòng dị hợp tử đối với dấu hiệu AnManM1.42 dòng (19,5%) mang các pha ngược nhau của alen Anseq3 và Anseq4, cho thấy tần suất tái tổ hợp cao giữa hai locus này.Các kiểu hình bệnh thán thư trong các điều kiện được kiểm soát (Bảng bổ trợ S2) cho thấy sự thay đổi về tính kháng của các kiểu gen được thử nghiệm, điều này được phản ánh ở mức độ nghiêm trọng của bệnh thán thư.Sự khác biệt về điểm trung bình dao động từ 1,8 (kháng trung bình) đến 6,9 (nhạy cảm) và sự khác biệt về trọng lượng cây dao động từ 0,62 (nhạy cảm) đến 4,45 g (kháng). Có mối tương quan đáng kể giữa các giá trị quan sát được trong hai lần lặp lại thí nghiệm (0,51 đối với điểm mức độ nghiêm trọng của bệnh, P = 0,00017 và 0,61 đối với trọng lượng cây, P < 0,0001) cũng như giữa hai tham số này (- 0,59 và - 0,77, P < 0,0001). Có mối tương quan đáng kể giữa các giá trị quan sát được trong hai lần lặp lại thí nghiệm (0,51 đối với điểm mức độ nghiêm trọng của bệnh, P = 0,00017 và 0,61 đối với trọng lượng cây, P < 0,0001) cũng như giữa hai tham số này (− 0,59 và − 0,77, P < 0,0001). Выявлена ​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях эксперимента (0,51 для баллов тяжести болезни, P = 0,00017 và 0,61 для массы растения, P < 0,0001), а также между этими двумя параметрами (-0,59 và -0,77, Р < 0,0001) 0,0001). Một mối tương quan đáng kể đã được tìm thấy giữa các giá trị quan sát được trong hai lần lặp lại thí nghiệm (0,51 đối với điểm mức độ nghiêm trọng của bệnh, P = 0,00017 và 0,61 đối với trọng lượng cây, P < 0,0001), cũng như giữa hai tham số này (- 0,59 và -0,77, P < 0,0001) 0,0001).0,51，P = 0,00017，植物重量为0,61，P < 0,0001）以及这两个参数之间（- 0,59 和- 0,77，P < 0,0001)。在两次重复实验中观察的值之间存在相关性（疾病严重程度评分为分为分为0.5 1，p=0.00017，植物为为0.61，p<0.0001）以及两个参数之间（（（（-0.59和–0.59和–0.59和– 0,59 和- 0,77，P < 0,0001)。 Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторно стях (оценка тяжести заболевания 0,51, P = 0,00017 и масса растения 0,61, P <0,0001), và между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,0001) 0,77, P < 0,0001. Có mối tương quan đáng kể giữa các giá trị quan sát được trùng lặp (điểm mức độ nghiêm trọng của bệnh 0,51, P = 0,00017 và trọng lượng cây 0,61, P < 0,0001) và giữa hai tham số này (-0,59 và -0,0001) 0,77, P<0,0001. ).Các triệu chứng điển hình được thấy ở những cây mẫn cảm bao gồm xoắn và xoắn thân giống như cấu trúc “mũi của người chăn cừu”, sau đó là các vết bệnh hình bầu dục với thoa trùng màu cam/hồng (Hình bổ sung. 1).Các giống Úc mang gen Lanr1 (83A:476 và Tanjil) và AnMan (Mandelup) có tính kháng vừa phải, 0,0331 và 0,0036).Một số dòng cũng mang alen Lanr1 và/hoặc AnMan “kháng thuốc” biểu hiện các triệu chứng của bệnh.
Điều thú vị là, một vài dòng NLL thiếu bất kỳ alen đánh dấu “kháng thuốc” nào cho thấy mức độ kháng bệnh thán thư cao (tương đương hoặc cao hơn so với các kiểu gen Lanr1 hoặc AnMan), chẳng hạn như Boregine (giá trị P < 0,0001 cho cả hai thông số), Bojar (giá trị P < 0,0001 cho điểm số và 0,001 cho trọng lượng cây) và Quần thể B-549/79b (giá trị P < 0,0001 cho điểm số và không có ý nghĩa đối với trọng lượng). Điều thú vị là, một vài dòng NLL thiếu bất kỳ alen đánh dấu “kháng thuốc” nào cho thấy mức độ kháng bệnh thán thư cao (tương đương hoặc cao hơn so với các kiểu gen Lanr1 hoặc AnMan), chẳng hạn như Boregine (giá trị P < 0,0001 cho cả hai thông số), Bojar (giá trị P < 0,0001 cho điểm số và 0,001 cho trọng lượng cây) và Quần thể B-549/79b (giá trị P < 0,0001 cho điểm số và không có ý nghĩa đối với trọng lượng). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, пока зали высокий уровень устойчивости к антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для г енотипов Lanr1 или AnMan), таких как Boregine (значение P < 0,0001 для обоих параметров), Bojar (значение P < 0,0001 для оцен ки и 0,001 для массы растения) и популяции B-549/79b (значение P < 0,0001 для оценки и незначимо для м ассы). Điều thú vị là, một số dòng NLL thiếu bất kỳ alen đánh dấu 'kháng thuốc' nào lại cho thấy mức độ kháng bệnh thán thư cao (tương đương hoặc cao hơn các kiểu gen Lanr1 hoặc AnMan), chẳng hạn như Boregine (giá trị P < 0,0001 cho cả hai thông số ), Bojar (giá trị P < 0,0001 đối với đánh giá và 0,001 đối với trọng lượng cây) và quần thể B-549/79b (giá trị P < 0,0001 đối với đánh giá và không có ý nghĩa đối với trọng lượng).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭疽病抗性（与Lanr1 或AnMan基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0.0001）、Bojar（P 值<得分为0.0001，植物重量为0.0 01）和种群B-549/79b（得分P 值< 0.0001，重量不显着）。 Điều thú vị là một số hệ thống NLL không có bất kỳ dấu hiệu “kháng nguyên” nào cho thấy tính kháng ngang cao (tương đương với gen Lanr1 hoặc AnMan hoặc cao hơn), chẳng hạn như Boregine (cả hai tham số P < 0,0001), Bojar (giá trị P < 0,0001, trọng lượng cây 0,001) và chủng B-549/79b (giá trị P < 0,0001, trọng lượng không đáng kể). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», показа ли высокие уровни устойчивости к антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие как Boregine (значение P для обоих параметров <0,0001), Bojar (значение P <0,0001, масса растения 0,001) và популяция B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначительна). Điều thú vị là, một số dòng NLL thiếu bất kỳ alen đánh dấu 'kháng' nào cho thấy mức độ kháng bệnh thán thư cao (tương đương hoặc cao hơn kiểu gen Lanr1 hoặc AnMan), chẳng hạn như Boregine (giá trị P cho cả hai tham số <0,0001), Bojar (giá trị P < 0,0001, trọng lượng cây 0,001) và quần thể B-549/79b (giá trị P < 0,0001, trọng lượng không đáng kể).Hiện tượng này cho thấy khả năng có một nguồn gen kháng thuốc mới, giải thích sự thiếu tương quan quan sát được giữa kiểu gen đánh dấu và kiểu hình bệnh (giá trị P từ ~0,42 đến ~0,98).Do đó, thử nghiệm Kolmogorov-Smirnov cho thấy dữ liệu về khả năng kháng bệnh thán thư được phân phối gần như bình thường đối với điểm số (giá trị P 0,25 và 0,11) và khối lượng cây (giá trị P 0,47 và 0,55), cho thấy tôi đưa ra giả thuyết rằng có nhiều alen hơn Lanr1 và AnMan có liên quan.
Dựa trên kết quả sàng lọc tính kháng bệnh thán thư, 4 dòng đã được chọn để phân tích phiên mã: 83A:476, Boregine, Mandelup và Quần thể 22660. Những dòng này đã được kiểm tra lại tính kháng bệnh than trong các thí nghiệm cấy bằng trình tự RNA, miễn là chúng giống như trong thử nghiệm trước.Các giá trị điểm số như sau: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A: 476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) và dân số 22660 (6,11 ± 1,29).
Giao thức Illumina NovaSeq 6000 đạt được trung bình 40,5 cặp Mread trên mỗi mẫu (29,7 đến 54,4 Mread) (Bảng bổ trợ S3).Điểm sắp xếp trong chuỗi tham chiếu dao động từ 75,5% đến 88,6%.Mối tương quan trung bình của dữ liệu số lần đọc giữa các biến thể thử nghiệm giữa các lần sao chép sinh học nằm trong khoảng từ 0,812 đến 0,997 (có nghĩa là 0,959). Trong số 35.170 gen được phân tích, 2917 gen không biểu hiện và 4785 gen khác được biểu hiện ở mức không đáng kể (trung bình cơ sở <5). Trong số 35.170 gen được phân tích, 2917 gen không biểu hiện và 4785 gen khác được biểu hiện ở mức không đáng kể (trung bình cơ sở <5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов экспре ссировались на незначительном уровне (базовое среднее <5). Trong số 35.170 gen được phân tích, 2917 gen không biểu hiện và 4785 gen còn lại được biểu hiện ở mức không đáng kể (trung bình cơ sở <5).在分析的35,170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785 个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）。35.170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 генов имели незна чительную экспрессию (базовое среднее значение <5). Trong số 35.170 gen được phân tích, 2917 gen không được biểu hiện và 4785 gen còn lại có biểu hiện không đáng kể (trung bình cơ sở <5).Do đó, số lượng gen được coi là biểu hiện (trung bình cơ sở ≥ 5) trong thí nghiệm là 27.468 (78,1%) (Bảng bổ trợ S4).
Ngay từ thời điểm đầu tiên, tất cả các dòng NLL đều phản ứng với việc cấy C. lupini (chủng Col-08) bằng cách lập trình lại bộ phiên mã (Bảng 1), tuy nhiên, đã quan sát thấy sự khác biệt đáng kể giữa các dòng.Do đó, dòng kháng 83A:476 (mang gen Lanr1) cho thấy sự tái lập trình bộ phiên mã đáng kể tại thời điểm đầu tiên (6 hpi) với số lượng gen tăng và giảm được phân lập tăng gấp 31-69 lần so với các thời điểm khác tại thời điểm này.Ngoài ra, đỉnh này chỉ tồn tại trong thời gian ngắn vì biểu hiện của chỉ một số gen vẫn bị thay đổi đáng kể ở thời điểm thứ hai (12 hpi).Thật thú vị, Boregine, cũng cho thấy mức độ kháng thuốc cao trong thử nghiệm ghép, đã không trải qua quá trình tái lập trình phiên mã lớn như vậy trong suốt quá trình thử nghiệm.Tuy nhiên, số lượng gen được biểu hiện khác biệt (DEG) là như nhau đối với Boregine và 83A:476 ở 12 HPI.Cả Mandelup và dân số 22660 đều cho thấy các đỉnh DEG tại thời điểm cuối cùng (48 l/s), cho thấy độ trễ tương đối trong các phản ứng phòng thủ.
Do 83A:476 trải qua quá trình tái lập trình phiên mã lớn để đáp ứng với C. lupini ở mức 6 HPI so với tất cả các dòng khác, nên ~91% DEG được quan sát tại thời điểm này là đặc trưng cho dòng (Hình 1).Tuy nhiên, có một số trùng lặp trong các phản hồi ban đầu giữa các dòng nghiên cứu, như 68,5%, 50,9% và 52,6% DEG ở Boregine, Mandelup và dân số 22660, tương ứng, trùng lặp với các phản ứng được tìm thấy trong 83A:476 ở một số thời điểm nhất định.Tuy nhiên, các DEG này chỉ chiếm một phần nhỏ (0,97–1,70%) trong số tất cả các DEG hiện được phát hiện bằng cách sử dụng 83A:476.Ngoài ra, 11 DEG từ tất cả các dòng đều kết hợp với nhau vào thời điểm này (Bảng bổ trợ S4-S6), bao gồm các thành phần phổ biến của phản ứng bảo vệ thực vật: protein chuyển lipid (TanjilG_32225), enzyme endoglucan-1,3-β-glucoside (TanjilG_23384), hai protein gây căng thẳng như SAM22 (TanjilG_31528 và TanjilG_31531), protein latex cơ bản (TanjilG_32 352) và hai protein thành tế bào cấu trúc giàu glycine (TanjilG_19701 và TanjilG_19702).Cũng có sự trùng lặp tương đối cao trong các phản ứng phiên mã giữa 83A:476 và Boregine ở 24 HPI (tổng 16-38% DEG) và giữa Mandelup và Dân số 22660 ở 48 HPI (tổng 14-20% DEG).
Biểu đồ Venn cho thấy số lượng gen được biểu hiện khác nhau (DEG) trong các dòng đậu lupin lá hẹp (NLL) được cấy Colletotrichum lupini (chủng Col-08 thu được từ các cánh đồng đậu lupin ở Wierzhenice, Ba Lan, 1999).Các dòng NLL được phân tích là: 83A:476 (kháng, mang alen Lanr1), Boregine (kháng, không rõ nguồn gốc di truyền), Mandelup (kháng trung bình, mang alen AnMan) và quần thể 22660 (rất mẫn cảm).Chữ hpi viết tắt là viết tắt của giờ sau khi tiêm vắc-xin.Giá trị 0 đã được loại bỏ để đơn giản hóa biểu đồ.
Tập hợp các gen được biểu hiện quá mức ở mức 6 hpi đã được phân tích về sự hiện diện của các miền gen R chính tắc (Bảng bổ trợ S7).Nghiên cứu này cho thấy sự cảm ứng phiên mã của các gen kháng bệnh cổ điển với các miền NBS-LRR chỉ ở 83A:476.Bộ này bao gồm một gen TIR-NBS-LRR (tanjilg_05042), năm gen CC-NBS-LRR (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 và tanjilg_16162), và Bốn NBS-LR, Tanjilg_16162) và Bốn NBS-LRRE (tanjilg _16162) cũng như Bốn NBS-Lrr (tanjilg_16162) và Bốn NBS-LRR (TANJILG_16162).Tất cả các gen này có các miền chính tắc được sắp xếp theo trình tự được bảo tồn.Ngoài các gen miền NBS-LRR, một số kinase RLL đã được kích hoạt ở mức 6 hpi, cụ thể là một ở Boregine (TanjilG_19877), hai ở Mandelup (TanjilG_07141 và TanjilG_19877) và trong quần thể 22660 (TanjilG_09014 và TanjilG_10361) và hai ở 83A 27:476.
Các gen có biểu hiện bị thay đổi đáng kể để đáp ứng với việc cấy C. lupini (chủng Col-08) đã được phân tích làm giàu Gene Onology (GO) (Bảng bổ trợ S8). Thuật ngữ quá trình sinh học được biểu thị quá mức thường xuyên nhất là phản ứng bảo vệ của GO GO: 0006952, xuất hiện ở 6 trên 16 kết hợp (thời gian × dòng) có ý nghĩa cao (giá trị P <0, 001) (Hình 2). Thuật ngữ quá trình sinh học được biểu thị quá mức thường xuyên nhất là phản ứng bảo vệ của GO GO: 0006952, xuất hiện ở 6 trên 16 kết hợp (thời gian × dòng) có ý nghĩa cao (giá trị P <0, 001) (Hình 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защит ный ответ», который появлялся в 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (з начение P < 0,001) (рис. 2). Thuật ngữ quá trình sinh học được biểu thị quá mức thường xuyên nhất là 'phản ứng phòng thủ GO: 0006952', xuất hiện ở 6 trong số 16 kết hợp (thời gian × dòng dõi) có ý nghĩa cao (giá trị P <0, 001) (Hình 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16 个（时间×线）组合中的6个中，具有高显着性（P 值< 0,001）（图2）。 Thuật ngữ quá trình sinh học tiêu biểu nhất là “phản ứng phòng vệ GO:0006952”, xuất hiện ở 6 trong số 16 tổ hợp (时间×线), có ý nghĩa cao (giá trị P < 0,001) (图2) . Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Defense Response», к оторый появлялся в 6 hoặc 16 комбинаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) ( câu trả lời. 2). Thuật ngữ quy trình sinh học được biểu thị quá mức thường xuyên nhất là 'GO: 0006952 Phản ứng phòng thủ', xuất hiện ở 6 trong số 16 kết hợp (thời gian × dòng) có ý nghĩa cao (giá trị P <0, 001) (Hình 2).Thuật ngữ này được thể hiện quá mức tại hai thời điểm trong 83A: 476 và Boregine (6 và 24 hpi) và tại một thời điểm trong Mandelup và Dân số 22660 (tương ứng là 12 và 6 hpi).Đây là một kết quả được mong đợi, làm nổi bật phản ứng kháng nấm của các dòng kháng thuốc.Ngoài ra, 83A:476 đã phản ứng với C. lupini bằng cách tạo ra nhanh chóng các gen liên quan đến sự bùng nổ oxy hóa được biểu thị bằng thuật ngữ “GO:0055114 quá trình oxi hóa khử”, biểu thị một phản ứng phòng vệ cụ thể, trong khi Boregine tiết lộ các phản ứng phòng vệ cụ thể, liên quan đến thuật ngữ 'GO'.:0006950 Ứng phó với căng thẳng”.Dân số 22660 đã kích hoạt phản ứng kháng theo chiều ngang liên quan đến các chất chuyển hóa thứ cấp, làm nổi bật số lượng quá nhiều thuật ngữ “GO:0016104 Quá trình sinh tổng hợp triterpene” và “GO:0006722 Quá trình chuyển hóa triterpene” (cả hai thuật ngữ thuộc cùng một bộ gen ), có tính đến kết quả phân tích làm giàu thuật ngữ GO, độ ổn định của phản ứng Mandelup là giữa Boregine và Quần thể 22660. Ngoài ra, phản ứng sớm 83A:47 6 (6 hpi) và phản ứng chậm Mandelup và Dân số 22660 bao gồm thuật ngữ GO:0015979 'quang hợp' và các quá trình sinh học liên quan khác.
Các thuật ngữ bản thể gen xử lý sinh học được chọn trong chú thích của các gen được biểu hiện khác nhau trong phản ứng phiên mã của lupin lá hẹp (NLL) được cấy với lupin bệnh than (chủng Col-08 thu được từ các cánh đồng lupin ở Wierzhenice, Ba Lan, năm 1999) được phóng đại rất nhiều.Các dòng NLL được phân tích là: 83A:476 (kháng thuốc, mang alen Lanr1 đồng hợp tử), Boregine (kháng thuốc, không rõ nguồn gốc di truyền), Mandelup (kháng trung bình, mang alen AnMan đồng hợp tử) và quần thể 22660 (nhiễm bệnh).
Vì nghiên cứu này nhằm mục đích xác định các gen góp phần kháng bệnh thán thư nên các gen được chỉ định cho các thuật ngữ GO “GO: 0006952 Phản ứng phòng thủ” và “GO: 0055114 Quá trình oxy hóa khử” đã được phân tích với ngưỡng giới hạn vì đường cơ sở có nghĩa là ≥ 30 với ít nhất một dòng.× thời điểm kết hợp các giá trị có ý nghĩa thống kê của log2 (thay đổi lần).Số lượng gen đáp ứng các tiêu chí này là 65 cho GO:0006952 và 524 cho GO:0055114.
83A:476 tiết lộ hai đỉnh DEG được chú thích bằng thuật ngữ GO:0006952, đỉnh đầu tiên có 6 gen trên inch (64 gen, quy định tăng và giảm) và đỉnh thứ hai có 24 gen trên inch (15 gen, chỉ quy định tăng).Boregine cũng chỉ ra rằng GO:0006952 đạt đỉnh tại cùng thời điểm, nhưng với ít DEG hơn (11 và 8) và kích hoạt ưu tiên.Mandeloop cho thấy hai đỉnh GO:0006952 ở 12 và 48 HPI, cả hai đều mang 12 gen (đầu tiên có gen kích hoạt và thứ hai chỉ có gen ức chế), trong khi quần thể 22660 ở 6 HPI (13 gen) có ưu thế lớn hơn về đỉnh tăng.quy định.Cần lưu ý rằng 96,4% GO:0006952 DEG trong các đỉnh này có cùng một loại phản ứng (lên hoặc xuống), cho thấy sự chồng chéo đáng kể trong các phản ứng phòng vệ mặc dù có sự khác biệt về số lượng gen liên quan.Nhóm trình tự lớn nhất liên quan đến thuật ngữ GO:0006952 mã hóa Protein thông điệp liên quan đến căng thẳng do đói 22 (giống SAM22), thuộc nhóm protein protein liên quan đến sinh bệnh học (PR-10) lớp 10 và mủ protein lõi.protein tương tự (giống MLP) (Hình 3).Hai nhóm khác nhau về bản chất biểu hiện và hướng phản ứng.Các gen mã hóa các protein giống SAM22 cho thấy cảm ứng nhất quán và có ý nghĩa ở các thời điểm ban đầu (6 hoặc 12 hpi) và thường không phản hồi ở cuối thí nghiệm (48 hpi), trong khi các protein giống MLP cho thấy sự phối hợp ở 6 hpi.hpi.83A:476 và Mandelup ở mức 48 hp/in, hầu như tất cả các điểm dữ liệu khác đều không phản hồi.Ngoài ra, sự khác biệt về cấu hình biểu hiện của các gen protein giống SAM22 theo sau sự thay đổi quan sát được về tính kháng bệnh thán thư, vì nhiều dòng kháng bệnh hơn có nhiều điểm thời gian tạo ra các gen này hơn đáng kể so với các gen nhạy cảm hơn.Một gen PR-10 giống LlR18A/B khác cho thấy kiểu biểu hiện rất giống với gen protein giống SAM22.
Các thành phần chính của thuật ngữ quy trình sinh học “GO:0006952 Defense Response” và các kiểu biểu hiện của các gen ứng cử viên của các alen Lanr1 và AnMan đã được xác định.Thang đo Log2 biểu thị các giá trị log2 (thay đổi lần) giữa các cây được cấy (Colletotrichum lupini, chủng Col-08, thu được từ các cánh đồng lupin, Wizhenica, Ba Lan, 1999) và các cây đối chứng (được cấy giả) tại cùng một thời điểm.Các dòng đậu lupin lá hẹp sau đây đã được phân tích: 83A:476 (kháng thuốc, mang alen Lanr1 đồng hợp tử), Boregine (kháng thuốc, nền tảng di truyền chưa rõ), Mandelup (kháng trung bình, mang alen AnMan đồng hợp tử) và Quần thể 22660 (nhiễm bệnh).
Ngoài ra, cấu hình biểu hiện của các gen ứng cử viên RNA-seq Lanr1 (TanjilG_05042) và AnMan (TanjilG_12861) đã được đánh giá (Hình 3).Gen TanjilG_05042 cho thấy phản ứng (kích hoạt) đáng kể ở 83A:476 chỉ ở thời điểm đầu tiên (6 hpi), trong khi TanjilG_12861 chỉ có ý nghĩa ở Mandeloop ở hai thời điểm: 6 hpi (điều chỉnh giảm) và 24 hpi (6 hpi).Với.).có thể điều chỉnh) ).
Các gen được biểu hiện quá mức nhất trong thuật ngữ GO:0055114 “quá trình oxi hóa khử” là các gen mã hóa protein cytochrom P450 và peroxidase (Hình 4).Đối với các mẫu được phân lập từ 83A:476 ở 6 HPI, giá trị log2 (thay đổi nếp gấp) tối đa hoặc tối thiểu (đối với 86,6% gen) thường được quan sát thấy giữa các cây được cấy và cây đối chứng, làm nổi bật phản ứng cao của kiểu gen này đối với giới tính được cấy.83A:476 cho thấy GO quan trọng nhất: 0055114 DEG ở 6 hpi (503 gen), trong khi các dòng còn lại ở 48 hpi (Boregine, 31 gen; Mandelup, 85 gen; và Dân số 22660, 78 gen)).Trong hầu hết các gen thuộc họ GO:0055114, người ta đã quan sát thấy hai loại phản ứng đối với việc tiêm phòng (kích hoạt và ức chế).Thật thú vị, có tới 97,6% DEG được xác định cho thuật ngữ GO: 0055114 ở Mandelupe ở 48 mã lực. Những quan sát này cho thấy rằng, mặc dù quy mô nhỏ hơn đáng kể (nghĩa là số lượng gen oxi hóa khử bị đột biến, 85 so với 503), kiểu phản ứng phiên mã chậm của mandeloup đối với bệnh thán thư tương tự như phản ứng ban đầu của 83A:476.Ở Boregine và Dân số 22660, sự hội tụ này thấp hơn lần lượt là 51,6% và 75,6%.
Các kiểu biểu hiện của các thành phần chính của thuật ngữ quá trình sinh học “GO:0055114 Quá trình oxi hóa khử” đã được tiết lộ.Thang đo Log2 biểu thị các giá trị log2 (thay đổi lần) giữa các cây được cấy (Colletotrichum lupini, chủng Col-08, thu được từ các cánh đồng lupin, Wizhenica, Ba Lan, 1999) và các cây đối chứng (được cấy giả) tại cùng một thời điểm.Các dòng đậu lupin lá hẹp sau đây đã được phân tích: 83A:476 (kháng thuốc, mang alen Lanr1 đồng hợp tử), Boregine (kháng thuốc, nền tảng di truyền chưa rõ), Mandelup (kháng trung bình, mang alen AnMan đồng hợp tử) và Quần thể 22660 (nhiễm bệnh).
83A:476 Các phản ứng phiên mã đối với việc cấy C. lupini (chủng Col-08) cũng bao gồm sự im lặng phối hợp của các gen được gán cho thuật ngữ GO:0015979 “quang hợp” và các quá trình sinh học liên quan khác (Hình 5).Bộ GO:0015979 DEG này chứa 105 gen bị ức chế đáng kể ở mức 6 hpi ở 83A:476.Trong tập hợp con này, 37 gen cũng được điều hòa giảm ở Mandelup ở 48 HPI và 35 tại cùng thời điểm trong quần thể 22660, bao gồm 19 DEG chung cho cả hai kiểu gen.Không có DEG nào liên quan đến thuật ngữ GO: 0015979 được kích hoạt đáng kể trong bất kỳ kết hợp nào (dòng x thời gian).
Các kiểu biểu hiện của các thành phần chính của thuật ngữ quá trình sinh học “GO:0015979 Quang hợp” đã được tiết lộ.Thang đo Log2 biểu thị các giá trị log2 (thay đổi lần) giữa các cây được cấy (Colletotrichum lupini, chủng Col-08, thu được từ các cánh đồng lupin, Wizhenica, Ba Lan, 1999) và các cây đối chứng (được cấy giả) tại cùng một thời điểm.Các dòng đậu lupin lá hẹp sau đây đã được phân tích: 83A:476 (kháng thuốc, mang alen Lanr1 đồng hợp tử), Boregine (kháng thuốc, nền tảng di truyền chưa rõ), Mandelup (kháng trung bình, mang alen AnMan đồng hợp tử) và Quần thể 22660 (nhiễm bệnh).
Dựa trên kết quả phân tích biểu hiện khác biệt và có lẽ liên quan đến phản ứng phòng vệ chống lại nấm gây bệnh, bộ bảy gen này đã được chọn để định lượng cấu hình biểu hiện bằng PCR thời gian thực (Bảng bổ trợ S9).
Gen protein giả định TanjilG_10657 đã được tạo ra đáng kể trong tất cả các dòng và thời điểm được nghiên cứu so với các cây đối chứng (bắt chước) (Bảng bổ trợ S10, S11).Ngoài ra, cấu hình biểu thức của TanjilG_10657 cho thấy xu hướng ngày càng tăng trong quá trình thử nghiệm đối với tất cả các dòng.Dân số 22660 cho thấy độ nhạy cao nhất của TanjilG_10657 đối với việc tiêm chủng với kích hoạt gấp 114 lần và mức biểu hiện tương đối cao nhất (4,4 ± 0,4) ở 24 HPI (Hình 6a).Gen protein PR10 LlR18A TanjilG_27015 cũng cho thấy sự kích hoạt trên tất cả các dòng và thời điểm, với ý nghĩa thống kê ở hầu hết các điểm dữ liệu (Hình 6b).Tương tự như TanjilG_10657, mức biểu hiện tương đối cao nhất của TanjilG_27015 được quan sát thấy trong quần thể 22660 người được tiêm ở 24 HPI (19,5 ± 2,4).Gen endochitinase axit TanjilG_04706 đã được điều chỉnh tăng đáng kể trong tất cả các dòng và tại mọi thời điểm ngoại trừ Boregine 6 hpi (Hình 6c).Nó được cảm ứng mạnh ở thời điểm đầu tiên (6 HPI) ở 83A:476 (tăng 10,5 lần) và tăng vừa phải ở các dòng khác (tăng 6,6-7,5 lần).Trong quá trình thử nghiệm, biểu hiện của TanjilG_04706 vẫn ở mức tương tự ở 83A:476 và Boregine, trong khi ở Mandelup và Quần thể 22660, nó tăng lên đáng kể, đạt các giá trị tương đối cao (lần lượt là 5,9 ± 1,5 và 6,2 ± 1,5).Gen giống như endoglucan-1,3-β-glucosidase TanjilG_23384 cho thấy khả năng kích hoạt cao ở hai thời điểm đầu tiên (6 và 12 hpi) trong tất cả các dòng ngoại trừ quần thể 22660 (Hình 6d).Các mức biểu hiện tương đối cao nhất của TanjilG_23384 được quan sát tại thời điểm thứ hai (12 hpi) ở Mandelup (2,7 ± 0,3) và 83A:476 (1,5 ± 0,1).Ở 24 HPI, biểu hiện TanjilG_23384 tương đối thấp ở tất cả các dòng nghiên cứu (từ 0,04 ± 0,009 đến 0,44 ± 0,12).
Hồ sơ biểu hiện của các gen được chọn (ag) được tiết lộ bằng PCR định lượng.Các số 6, 12 và 24 đại diện cho số giờ sau khi tiêm chủng.Các gen LanDExH7 và LanTUB6 được sử dụng để chuẩn hóa và LanTUB6 được sử dụng để hiệu chuẩn giữa các chuỗi.Các thanh lỗi biểu thị độ lệch chuẩn dựa trên ba lần lặp lại sinh học, mỗi lần lặp lại là giá trị trung bình của ba lần lặp lại kỹ thuật. Ý nghĩa thống kê của sự khác biệt về mức độ biểu hiện giữa các cây được cấy (Colletotrichum lupini, chủng Col-08, thu được vào năm 1999 từ cánh đồng lupin ở Wierzenica, Ba Lan) và cây đối chứng (được cấy giả) được đánh dấu trên các điểm dữ liệu (* Giá trị P < 0,05, ** Giá trị P ≤ 0,01, *** Giá trị P ≤ 0,001). Ý nghĩa thống kê của sự khác biệt về mức độ biểu hiện giữa các cây được cấy (Colletotrichum lupini, chủng Col-08, thu được vào năm 1999 từ cánh đồng lupin ở Wierzenica, Ba Lan) và cây đối chứng (được cấy giả) được đánh dấu trên các điểm dữ liệu (* Giá trị P < 0,05, ** Giá trị P ≤ 0,01, *** Giá trị P ≤ 0,001). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, ш тамм Col-08, получен в 1999 г. с поля люпина в Верженице, Польша) và контрольными (ложно инокули) рованными) растениями отмечена над точками данных (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0 ,001). Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về mức độ biểu hiện giữa các cây được cấy (Colletotrichum lupini, chủng Col-08, thu được vào năm 1999 từ một cánh đồng lupin ở Wierzhenice, Ba Lan) và các cây đối chứng (được cấy giả) được ghi chú ở trên các điểm dữ liệu (* Giá trị P < 0,05, ** Giá trị P ≤ 0,01, *** Giá trị P ≤ 0,001).接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间达水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值≤ 0,001)。接种（colletotrichum lupini，color-08株，1999年波兰波兰wierzenica的羽扇获得）和对照（接种植物之间水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001)。 Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штам м Col-08, полученный с полей люпина в Верженице, Польша, в 1999 г.) và контрольными (ложно иноку лированными) растениями отмечены над точками данных (* значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение e ≤ 0,001). Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về mức độ biểu hiện giữa các cây được cấy (Colletotrichum lupini, chủng Col-08, thu được từ các cánh đồng lupin ở Verzhenice, Ba Lan, năm 1999) và cây đối chứng (được cấy giả) được ghi chú ở trên các điểm dữ liệu (* Giá trị P < 0,05 , ** Giá trị P ≤ 0,01, *** Giá trị P ≤ 0,001).Các dòng NLL được phân tích là: 83A:476 (kháng thuốc, mang alen Lanr1 đồng hợp tử), Mandelup (kháng vừa phải, mang alen AnMan đồng hợp tử), Boregine (kháng thuốc, không rõ nền tảng di truyền) và quần thể 22660 (nhiễm bệnh).
Gen ứng cử viên TanjilG_05042 tại locus Lanr1 cho thấy một kiểu biểu hiện khác biệt rõ rệt so với các cấu hình thu được từ các nghiên cứu RNA-seq (Hình 6e).Sự kích hoạt đáng kể của gen này đã được quan sát thấy ở Mandelup và quần thể 22660 (lần lượt lên tới 39,7 và 11,7 lần), dẫn đến mức độ biểu hiện tương đối cao (lần lượt lên tới 1,4 ± 0,14 và 7,2 ± 1,3).83A:476 cũng tiết lộ một số điều chỉnh tăng của gen TanjilG_05042 (lên tới 3,8 lần), tuy nhiên, mức biểu hiện tương đối đạt được (0,044 ± 0,002) thấp hơn 30 lần so với mức quan sát được ở Mandelup và quần thể 22660.được phân tích bởi qPCR cho thấy sự khác biệt đáng kể về mức độ biểu hiện giữa các kiểu gen trong các biến thể được tiêm vắc-xin giả (đối chứng), đạt đến sự khác biệt gấp 58 lần giữa các quần thể 22660 và 83A:476, cũng như giữa các quần thể 22660 và 22660. Đã đạt được sự khác biệt gấp đôi giữa Boregine và Mandalup.
Gen ứng cử viên tại locus AnMan, TanjilG_12861, đã được kích hoạt để đáp ứng với việc tiêm vắc-xin ở 83A: 476 và Mandelup, là trung tính trong quần thể 22660 và được điều hòa quá mức ở Boregine (Hình 6f).Biểu hiện tương đối của gen TanjilG_12861 là cao nhất ở 83A được cấy: 476 (0,14±0,01).Gen protein sốc nhiệt loại I 17,4 kDa TanjilG_05080 HSP17.4 cho thấy mức độ biểu hiện tương đối thấp hơn ở tất cả các chủng và thời điểm được nghiên cứu (Hình 6g).Giá trị cao nhất được quan sát thấy ở 24 HPI trong quần thể 22660 (0,14 ± 0,02, tăng gấp tám lần đáp ứng với tiêm chủng).
So sánh cấu hình biểu hiện gen (Hình 7) cho thấy mối tương quan cao giữa TanjilG_10657 và bốn gen khác: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80) và TanjilG_04706 (r = 0,79).Những kết quả như vậy có thể chỉ ra sự đồng điều hòa của các gen này trong các phản ứng phòng vệ.Các gen TanjilG_12861 và TanjilG_23384 cho thấy các cấu hình biểu hiện khác nhau với các giá trị hệ số tương quan Pearson thấp hơn (lần lượt từ 0,08 đến 0,43 và -0,19 đến 0,28) so với các gen khác.
Mối tương quan giữa các biểu hiện gen được phát hiện bằng PCR định lượng.Các dòng lupin lá hẹp sau đây đã được phân tích: 83A:476 (kháng thuốc, mang alen Lanr1 đồng hợp tử), Mandelup (kháng vừa phải, mang alen AnMan đồng hợp tử), Boregine (kháng thuốc, nền tảng di truyền không rõ) và Quần thể 22660 (nhiễm bệnh).Ba điểm thời gian đã được tính toán (6, 12 và 24 giờ sau khi cấy), bao gồm các cây được cấy (Colletotrichum lupini, chủng Col-08, thu được từ các cánh đồng đậu lupin ở Wierzhenice, Ba Lan, năm 1999) và các cây đối chứng (được cấy giả).Thang đo thể hiện giá trị của hệ số tương quan Pearson.
Dựa trên dữ liệu thu được ở mức 6 mã lực mỗi inch, WGCNA đã được thực hiện trên 9981 DEG được xác định bằng cách so sánh các cây được cấy và kiểm soát để tập trung vào các phản ứng phòng vệ sớm (Bảng bổ trợ S12).Hai mươi hai mô-đun gen (cụm) đã được tìm thấy với cấu hình biểu hiện tương quan (tích cực hoặc tiêu cực) giữa các kiểu gen và các biến thể thử nghiệm. Trung bình, mức độ biểu hiện gen giảm dần theo thứ tự 83A:476 > Mandelup > Boregine > Quần thể 22660 (tuy nhiên, ở cả hai biến thể, xu hướng này mạnh hơn ở các cây đối chứng). Trung bình, mức độ biểu hiện gen giảm dần theo thứ tự 83A:476 > Mandelup > Boregine > Quần thể 22660 (tuy nhiên, ở cả hai biến thể, xu hướng này mạnh hơn ở các cây đối chứng). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Dân số 22660 (в обоих вариантах, о днако, эта тенденция была сильнее у контрольных растений). Trung bình, mức độ biểu hiện gen giảm theo thứ tự 83A:476 > Mandelup > Boregine > Quần thể 22660 (tuy nhiên, ở cả hai biến thể, xu hướng này mạnh hơn ở các cây đối chứng).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Dân số 22660 的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强）。平均而言，基因水平按按83a:476>mandelup>boregine> dân số 22660的顺序下降（，在种中，这种在在 植物 中 更）。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Dân số 22660 (однако в обоих варианта х эта тенденция была сильнее у контрольных растений). Trung bình, mức độ biểu hiện gen giảm trong chuỗi 83A:476 > Mandelup > Boregine > Quần thể 22660 (tuy nhiên, ở cả hai biến thể, xu hướng này mạnh hơn ở các cây đối chứng).Việc chủng ngừa dẫn đến việc điều hòa lại biểu hiện gen, đặc biệt là ở các mô-đun 18, 19, 14, 6 và 1 (theo thứ tự tác dụng giảm dần), điều hòa âm tính (ví dụ: mô-đun 9 và 20) hoặc với các hiệu ứng trung tính (ví dụ: mô-đun 11, 22, 8 và 13).Phân tích làm giàu thuật ngữ GO (Bảng bổ trợ S13) đã tiết lộ “GO: 0006952 Phản ứng bảo vệ” cho mô-đun được cấy (18) với kích hoạt tối đa, bao gồm các gen được phân tích bởi qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 và TanjilG_27015), cũng như nhiều mô-đun quang hợp bị ức chế nhất (9).Bộ tập trung mô-đun 18 (Hình 8) được xác định là gen TanjilG_26536 mã hóa protein LlR18B giống PR-10 và bộ tập trung mô-đun 9 được xác định là gen TanjilG_28955 mã hóa protein PsbQ II của hệ thống ảnh.Một ứng cử viên gen kháng bệnh thán thư Lanr1, TanjilG_05042, đã được tìm thấy trong mô-đun 22 (Hình 9) và được liên kết với các thuật ngữ “GO:0044260 Quá trình trao đổi chất đại phân tử tế bào” và “GO:0006355 Quy định phiên mã, tạo khuôn mẫu DNA” mang trung tâm TanjilG_01212.gen mã hóa yếu tố phiên mã stress nhiệt A-4a (HSFA4a).
Phân tích mạng có trọng số về sự đồng biểu hiện gen của các mô-đun với các thuật ngữ quy trình sinh học được biểu hiện quá mức “GO: 0006952 Phản ứng phòng thủ”.Việc thắt được đơn giản hóa để làm nổi bật bốn gen được phân tích bởi qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 và TanjilG_27015).
Phân tích mạng có trọng số về sự đồng biểu hiện gen của một mô-đun với thuật ngữ quy trình sinh học được biểu thị quá mức “GO: 0006355: Điều hòa phiên mã, tạo khuôn mẫu DNA” và mang gen kháng bệnh thán thư ứng cử viên Lanr1 TanjilG_05042.Việc thắt được đơn giản hóa để phân lập gen TanjilG_05042 và gen TanjilG_01212 trung tâm.
Sàng lọc tính kháng bệnh thán thư được thu thập ở Úc cho thấy hầu hết các giống được phát hành sớm đều dễ nhiễm bệnh;Kalya, Coromup và Mandelup được mô tả là kháng trung bình, trong khi Wonga, Tanjil và 83A:476 được mô tả là kháng cao26,27,31.có cùng một alen kháng thuốc, được chỉ định là Lanr1, còn Coromup và Mandelup có một alen khác, được chỉ định là AnMan10, 26, 39, trong khi Kalya truyền một alen khác., lanr2.Sàng lọc tính kháng bệnh thán thư ở Đức đã dẫn đến việc xác định được dòng kháng Bo7212 với một alen ứng cử viên khác ngoài Lanr1, được chỉ định là LanrBo36.
Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy tần số rất thấp (khoảng 6%) của alen Lanr1 trong tế bào mầm được thử nghiệm.Quan sát này phù hợp với kết quả sàng lọc nguồn gen Đông Âu bằng cách sử dụng các dấu hiệu Anseq3 và Anseq4, cho thấy alen Lanr1 chỉ có ở hai dòng Belarus.Điều này cho thấy rằng alen Lanr1 chưa được sử dụng rộng rãi trong các chương trình nhân giống địa phương, không giống như ở Úc, nơi nó là một trong những alen quan trọng để nhân giống có hỗ trợ đánh dấu.Điều này có thể là do mức độ kháng thấp hơn do alen Lanr1 cung cấp trong điều kiện đồng ruộng ở Châu Âu so với báo cáo của Úc.Ngoài ra, các nghiên cứu về bệnh thán thư ở những vùng có lượng mưa lớn ở Úc đã chỉ ra rằng các phản ứng kháng thuốc qua trung gian alen Lanr1 có thể không hiệu quả trong điều kiện thời tiết thuận lợi cho mầm bệnh sinh trưởng và phát triển nhanh19,42.Trên thực tế, trong nghiên cứu này, một số triệu chứng của bệnh thán thư cũng được quan sát thấy ở các kiểu gen mang alen Lanr1, cho thấy rằng tính kháng có thể biến mất trong các điều kiện tối ưu cho sự phát triển của C. lupini.Ngoài ra, các diễn giải dương tính giả về sự hiện diện của các dấu hiệu Anseq3 và Anseq4, cách locus Lanr1 khoảng 1 cM, có thể xảy ra 28,30,43 .
Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy rằng 83A:476, mang alen Lanr1, đã phản ứng với việc cấy C. lupini bằng cách tái lập trình bộ phiên mã quy mô lớn tại thời điểm phân tích đầu tiên (6 hpi), trong khi ở Mandelup, mang alen AnMan, các phản ứng phiên mã được quan sát thấy muộn hơn nhiều.(từ 24 đến 48 mã lực).Những thay đổi theo thời gian trong các phản ứng phòng thủ này có liên quan đến sự khác biệt trong các triệu chứng bệnh, làm nổi bật tầm quan trọng của việc nhận biết mầm bệnh sớm để đáp ứng thành công với sự kháng thuốc.Để lây nhiễm sang mô thực vật, các bào tử bệnh than phải trải qua một số giai đoạn phát triển trên bề mặt vật chủ, bao gồm nảy mầm, phân chia tế bào và hình thành lớp hấp phụ.Phần phụ là một cấu trúc lây nhiễm gắn vào bề mặt của vật chủ và tạo điều kiện xâm nhập vào các mô của vật chủ.Như vậy, bào tử C. gloeosporioides trong dịch chiết đậu Hà Lan cho thấy sự phân chia nhân đầu tiên sau 75-90 phút ủ, hình thành ống mầm sau 90-120 phút và ức chế sau 4 giờ 45 .Xoài C. gloeosporioides cho thấy hơn 40% hạt mầm nảy mầm sau 3 giờ ủ và khoảng 20% ​​hình thành thể kìm sau 4 giờ.Gen CAP20 liên quan đến độc lực của C. gloeosporioides cho thấy hoạt động phiên mã trong bào tử conidia hình thành biểu sinh sau 3,5 giờ ủ trong sáp bề mặt bơ với nồng độ cao protein CAP20 sau 4 giờ 46 phút.Tương tự như vậy, hoạt động của các gen sinh tổng hợp hắc tố ở C. trifolii được tạo ra trong thời gian ủ 2 giờ, sau đó là sự hình thành của một chất hấp phụ sau 1 giờ.Các nghiên cứu về mô lá đã chỉ ra rằng dâu tây được cấy C. acutatum có sự ức chế đầu tiên ở 8 hpi, trong khi cà chua được cấy C. coccodes có sự ức chế đầu tiên ở 4 hpi48,49.phần lớn phù hợp với thang thời gian của Colletotrichum spp.quá trình lây nhiễm.Các phản ứng phòng vệ nhanh đối với 83A:476 cho thấy có sự tham gia của các gen kháng thực vật và gen miễn dịch kích hoạt hiệu ứng (ETI) trong dòng này, trong khi các phản ứng chậm trễ của Mandelup ủng hộ giả thuyết miễn dịch kích hoạt mô hình phân tử (MTI) liên quan đến vi mô 50. Các phản ứng ban đầu đối với 83A: 476 và Mandelup.Sự trùng lặp một phần giữa các gen điều chỉnh tăng hoặc giảm trong phản ứng chậm trễ cũng hỗ trợ khái niệm này, vì ETI thường được coi là phản ứng MTI tăng tốc và tăng cường, dẫn đến chết tế bào theo chương trình tại vị trí nhiễm trùng, được gọi là sốc phản vệ 51,52 .
Hầu hết các gen được gán cho thuật ngữ Gene Onology GO: 0006952 “Phản ứng phòng thủ” được biểu thị quá mức là 11 điểm tương đồng của protein 22 thông báo nhịn ăn do căng thẳng (tương tự như SAM22) và bảy loại protein latex chính (MLPs) tương tự.-các protein giống như 31, 34, 43 và 423 cho thấy sự tương đồng về trình tự.Các gen giống SAM22 cho thấy sự kích hoạt đáng kể tồn tại lâu hơn, cho thấy mức độ kháng bệnh thán thư tăng lên (83A:476 và Boregine).Tuy nhiên, các gen giống MLP chỉ được điều hòa giảm ở các dòng mang alen kháng ứng cử viên (83A:476/Lanr1 ở 6 hpi và Mandelup/AnMan ở 24 hpi).Cần lưu ý rằng tất cả các điểm tương đồng giống SAM22 đã xác định đều bắt nguồn từ một cụm gen kéo dài khoảng 105 kb, trong khi các gen giống MLP bắt nguồn từ các vùng riêng biệt của bộ gen.Sự kích hoạt phối hợp của các gen giống SAM22 như vậy cũng đã được tìm thấy trong nghiên cứu trước đây của chúng tôi về khả năng kháng NLL đối với việc tiêm chủng Diaporthetoxica, cho thấy rằng chúng có liên quan đến các thành phần ngang của phản ứng phòng vệ.Kết luận này cũng được hỗ trợ bởi các báo cáo về phản ứng tích cực của các gen giống SAM22 đối với tổn thương hoặc điều trị bằng axit salicylic, chất gây cảm ứng nấm hoặc hydro peroxide.
Các gen giống MLP đã được chứng minh là phản ứng với các căng thẳng sinh học và phi sinh học khác nhau, bao gồm nhiễm vi khuẩn, vi rút và nấm gây bệnh ở nhiều loài thực vật55.Các hướng phản ứng đối với các tương tác nhất định giữa thực vật và mầm bệnh dao động từ tăng mạnh (tức là trong quá trình nhiễm Verticillium dahliae trên cây bông) đến giảm đáng kể (tức là sau khi nhiễm bệnh cây táo với Alternaria spp.)56,57.Quá trình điều hòa giảm đáng kể của gen 423 giống MLP đã được quan sát thấy trong quá trình bảo vệ bơ đối với nhiễm F. niger và trong quá trình lây nhiễm cây táo Botryosphaeria berengeriana f.cn.piricola và Alternaria alternata là các kiểu bệnh của táo58,59.Ngoài ra, mô sẹo táo biểu hiện quá mức gen 423 giống MLP có biểu hiện thấp hơn của các gen liên quan đến tính kháng và dễ bị nhiễm nấm hơn59.Tiếp theo Fusarium oxysporum f, gen 423 giống MLP cũng bị ức chế trong nguồn gen đậu thông thường kháng bệnh.cn.Nhiễm đậu 60 .
Các thành viên khác của họ PR-10 được xác định trong nghiên cứu RNA-seq của chúng tôi là gen LlR18A và LlR18B để đáp ứng với quá trình điều hòa ngược, cũng như gen điều hòa ngược (1 gen) hoặc điều hòa ngược (3 gen) cho protein chuyển lipid DIR1..Ngoài ra, WGCNA làm nổi bật gen LlR18B như một trung tâm trong mô-đun này, gen này rất nhạy cảm với việc tiêm phòng và mang một số gen phản ứng bảo vệ.Các gen LlR18A và LlR18B được tạo ra trong lá lupin màu vàng để đáp ứng với vi khuẩn gây bệnh, cũng như trong thân cây NLL sau khi cấy D. Toxica, trong khi gen tương đồng của các gen này, RSOsPR10, nhanh chóng được tạo ra bởi một bệnh nhiễm nấm có lẽ liên quan đến con đường truyền tín hiệu axit jasmonic53,61, 62. Gen DIR1 mã hóa các protein vận chuyển lipid không đặc hiệu cần thiết cho sự khởi đầu của tính kháng thu được toàn thân (SAR).Với sự phát triển của các phản ứng bảo vệ, protein DIR1 được vận chuyển từ tâm điểm của nhiễm trùng qua màng libe để gây ra SAR ở các cơ quan ở xa.Điều thú vị là gen TanjilG_02313 DIR1 đã được tạo ra một cách đáng kể tại thời điểm đầu tiên ở dòng 84A:476 và Quần thể 22660, nhưng tính kháng bệnh thán thư chỉ phát triển thành công ở dòng 84A:476.Điều này có thể chỉ ra một số chức năng con của gen DIR1 trong NLL, vì ba thể tương đồng còn lại chỉ phản ứng với việc cấy trong dòng 83A:476 ở 6 hpi và phản ứng này được hướng xuống dưới.
Trong nghiên cứu của chúng tôi, các thành phần phổ biến nhất tương ứng với quá trình sinh học được gọi là “GO:0055114 Quá trình oxy hóa khử” là protein cytochrom P450, peroxidase, axit linoleic 9S-/13S-lipoxygenase và 1-aminocyclopropane-1-carboxylic axit oxyase.Ngoài ra, WGCNA của chúng tôi định nghĩa tương đồng HSFA4a là một trung tâm mang các mô-đun, chẳng hạn như ứng cử viên gen kháng Lanr1 TanjilG_05042.HSFA4a là một thành phần của quá trình điều hòa phiên mã hạt nhân phụ thuộc vào quá trình oxy hóa khử ở thực vật.
Protein Cytochrom P450 là các chất oxy hóa xúc tác phản ứng hydroxyl hóa NADPH và/hoặc phụ thuộc O2 trong quá trình chuyển hóa sơ cấp và thứ cấp, bao gồm chuyển hóa xenobiotics, cũng như hormone, axit béo, sterol, thành phần thành tế bào, polyme sinh học và sinh tổng hợp các hợp chất bảo vệ 69. Trong một nghiên cứu của chúng tôi, sự thay đổi trong chức năng của cytochrom P450 thực vật đã giảm từ -10,6 log2 (thay đổi nếp gấp) xuống 5,7 do một số lượng lớn các điểm tương đồng bị thay đổi (37) và sự khác biệt trong các kiểu phản ứng giữa các gen cụ thể, phản ánh sự sửa đổi đi lên..Chỉ sử dụng dữ liệu RNA-seq để làm sáng tỏ chức năng sinh học giả định của các gen NLL trong một siêu họ protein lớn như vậy sẽ mang tính suy đoán cao.Tuy nhiên, điều đáng chú ý là một số gen cytochrom P450 có liên quan đến việc tăng khả năng kháng nấm hoặc vi khuẩn gây bệnh, bao gồm cả việc góp phần gây ra các phản ứng dị ứng69,70,71.
Peroxidase loại III là các enzyme thực vật đa chức năng tham gia vào một loạt các quá trình trao đổi chất trong quá trình sinh trưởng và phát triển của cây, cũng như phản ứng với các áp lực môi trường như độ mặn, hạn hán, cường độ ánh sáng cao và sự tấn công của mầm bệnh72.Peroxidase có liên quan đến sự tương tác của một số loài thực vật với bệnh than, bao gồm Stylosanthes humilis và C. gloeosporioides, Lens culinaris và C. truncatum, Phaseolus Vulgaris và C. lindemuthianum, Cucumis sativus và C. lagenarium73,74,75,76.Phản ứng rất nhanh, thậm chí đôi khi ở 4 HPI, trước khi nấm xâm nhập vào mô thực vật73.Gen peroxidase cũng phản ứng với việc cấy D. độc tố NLL.Ngoài các chức năng điển hình của chúng để điều chỉnh sự bùng nổ oxy hóa hoặc loại bỏ stress oxy hóa, peroxidase có thể cản trở sự phát triển của mầm bệnh bằng cách tạo ra các rào cản vật lý dựa trên sự củng cố thành tế bào trong quá trình phân lớp, tiểu đơn vị hoặc liên kết ngang của các hợp chất cụ thể.Chức năng này có thể được quy cho gen TanjilG_03329 trong silico mã hóa một anion peroxidase hình thành lignin giả định đã được điều chỉnh tăng đáng kể trong nghiên cứu của chúng tôi trong dòng kháng 83A:476 ở 6 HPI, nhưng không phải ở các chủng và thời điểm khác không đáp ứng.
9S-/13S-lipoxygenase của axit linoleic là bước đầu tiên trong con đường oxy hóa của quá trình sinh tổng hợp lipid78.Các sản phẩm của con đường này có nhiều chức năng trong việc bảo vệ thực vật, bao gồm tăng cường thành tế bào thông qua sự hình thành của callose và pectin lắng đọng, và điều hòa stress oxy hóa thông qua việc sản xuất các loại oxy phản ứng79,80,81,82,83.Trong nghiên cứu hiện tại, sự biểu hiện của axit linoleic 9S-/13S-lipoxygenase đã bị thay đổi ở tất cả các chủng, nhưng ở quần thể nhạy cảm 22660, quá trình điều hòa ngược chiếm ưu thế ở các thời điểm khác nhau, trong khi ở các chủng mang alen Lanr1 và AnMan kháng thuốc, nó nhấn mạnh đến sự đa dạng hóa của lớp oxylipin trong các phản ứng bảo vệ bệnh than giữa các kiểu gen này.
Chất tương đồng 1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase (ACO) được điều hòa tăng đáng kể (9 gen) hoặc điều hòa giảm (2 gen) khi được cấy bằng lupin.Với hai trường hợp ngoại lệ, tất cả các phản hồi này xảy ra ở mức 6 mã lực.tại 83A:476.Phản ứng enzym qua trung gian protein ACO là bước giới hạn tốc độ trong quá trình sản xuất ethylene và do đó được kiểm soát chặt chẽ84.Ethylene là một loại hormone thực vật đóng nhiều vai trò khác nhau trong việc điều chỉnh sự phát triển của cây và phản ứng với các điều kiện căng thẳng phi sinh học và sinh học.Việc tạo ra phiên mã ACO và kích hoạt con đường truyền tín hiệu ethylene có liên quan đến việc tăng sức đề kháng của cây lúa đối với nấm oryzae oryzae hemibiotrophic bằng cách điều chỉnh việc sản xuất các loại oxy phản ứng và phytoalexin.Một quá trình lây nhiễm trên lá rất giống nhau được tìm thấy giữa M. oryzae và C. lupini88,89, trong bối cảnh có sự điều chỉnh tăng đáng kể các chất tương đồng ACO trong dòng 83A:476 được báo cáo trong nghiên cứu này, chuyển khả năng tạo ra tính kháng đối với bệnh thán thư NLL Ethylene thành một bước trung tâm báo hiệu trong con đường phân tử .
Trong nghiên cứu hiện tại, sự ức chế quy mô lớn của nhiều gen liên quan đến quang hợp đã được quan sát thấy ở 6 hpi ở 83A:476 và ở 48 hpi ở Mandeloop và quần thể 22660.Mức độ và diễn tiến của những thay đổi này tỷ lệ thuận với mức độ.Khả năng kháng bệnh thán thư đã được quan sát thấy trong thí nghiệm này.Gần đây, sự ức chế mạnh mẽ và sớm của các bản phiên mã liên quan đến quang hợp đã được báo cáo trong một số mô hình tương tác giữa mầm bệnh thực vật, bao gồm cả vi khuẩn và nấm gây bệnh.Sự vội vàng (từ 2 HPI trong một số tương tác) và ức chế toàn bộ các gen liên quan đến quá trình quang hợp để đáp ứng với nhiễm trùng có thể kích hoạt khả năng miễn dịch của thực vật dựa trên việc triển khai các loại oxy phản ứng và tương tác của chúng với con đường axit salicylic để điều hòa các phản ứng dị ứng 90,94.
Tóm lại, các cơ chế phản ứng bảo vệ được đề xuất cho dòng kháng thuốc cao nhất (83A:476) bao gồm khả năng nhận biết mầm bệnh nhanh chóng bằng gen R (có lẽ là TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) và tín hiệu ethylene và axit salicylic qua trung gian phản ứng dị ứng, sau đó là thiết lập SAR tầm xa.hành động được hỗ trợ bởi protein DIR-1.Cần lưu ý rằng giai đoạn sinh dưỡng đối với nhiễm trùng C. lupini là rất ngắn (khoảng 2 ngày), sau đó là giai đoạn phát triển hoại tử95.Quá trình chuyển đổi giữa các giai đoạn này có thể liên quan đến sự hoại tử và biểu hiện của các protein cảm ứng ethylene hoạt động như các chất kích hoạt phản ứng quá mẫn cảm ở cây ký chủ.Do đó, khoảng thời gian để bắt thành công C. lupini ở giai đoạn sinh dưỡng là rất hẹp.Việc lập trình lại các gen liên quan đến quá trình oxy hóa khử và quang hợp được quan sát thấy ở 83A:476 ở 6 hpi phù hợp với sự phát triển của sợi nấm và báo trước sự phát triển của phản ứng bảo vệ thành công ở giai đoạn sinh dưỡng.Các phản ứng phiên mã của Mandelup và quần thể 22660 có thể quá chậm để bắt nấm trước khi chuyển sang giai đoạn phát triển hoại tử, tuy nhiên, Mandelup có thể hiệu quả hơn quần thể 22660 vì protein PR-10 điều hòa tương đối nhanh thúc đẩy tính kháng ngang.
ETI, được điều khiển bởi gen R chính tắc, dường như là một cơ chế phổ biến để đậu kháng lại bệnh thán thư.Do đó, ở cây họ đậu mô hình Medicago truncatula, tính kháng bệnh thán thư được quy định bởi gen RCT1, một thành viên của lớp gen R thực vật TIR-NBS-LRR97.Gen này cũng tạo ra khả năng kháng bệnh thán thư phổ rộng ở cỏ linh lăng khi được chuyển sang các cây mẫn cảm.Ở đậu thường (P. Vulgaris), cho đến nay, hơn hai chục gen kháng bệnh thán thư đã được xác định.Một số gen này được tìm thấy ở những vùng thiếu bất kỳ gen R chính tắc nào, tuy nhiên, nhiều gen khác nằm ở rìa của nhiễm sắc thể mang cụm gen NBS-LRR, bao gồm TIR-NBS-LRRs99.Nghiên cứu SSR trên toàn bộ bộ gen cũng xác nhận mối liên hệ của gen NBS-LRR với khả năng kháng bệnh thán thư ở cây đậu thông thường.Gen R chính tắc cũng được tìm thấy trong vùng gen mang locus kháng bệnh thán thư chính ở lupin trắng 101.
Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy rằng một phản ứng kháng thuốc ngay lập tức, được kích hoạt ở giai đoạn đầu của quá trình lây nhiễm thực vật (tốt nhất là không quá 12 hpi), bảo vệ hiệu quả cây lupin lá hẹp khỏi bệnh thán thư do nấm gây bệnh Collelotrichum lupini gây ra.Sử dụng giải trình tự thông lượng cao, chúng tôi đã chứng minh các biểu hiện khác biệt của các gen kháng bệnh thán thư trong các cây NLL được trung gian bởi các gen kháng Lanr1 và AnMan.Phòng thủ thành công liên quan đến việc thiết kế cẩn thận các gen cho các protein liên quan đến quá trình oxy hóa khử, quang hợp và sinh bệnh học trong vòng vài giờ kể từ lần tiếp xúc đầu tiên của cây trồng với mầm bệnh.Các phản ứng bảo vệ tương tự, nhưng bị trì hoãn kịp thời, kém hiệu quả hơn nhiều trong việc bảo vệ cây trồng khỏi bệnh tật.Khả năng kháng bệnh than qua trung gian gen Lanr1 giống với phản ứng nhanh điển hình của gen R (miễn dịch do tác nhân kích hoạt), trong khi gen AnMan rất có thể cung cấp phản ứng ngang (miễn dịch được kích hoạt bởi mô hình phân tử liên quan đến vi khuẩn), mang lại mức độ bền vững vừa phải.
215 dòng NLL được sử dụng để sàng lọc các dấu hiệu bệnh thán thư bao gồm 74 giống cây trồng, 60 dòng thu được bằng cách lai tạo hoặc nhân giống, 5 dòng đột biến và 76 dòng tế bào mầm hoang dã hoặc nguyên thủy.Các dòng đến từ 17 quốc gia, chủ yếu từ Ba Lan (58), Tây Ban Nha (47), Đức (27), Úc (26), Nga (19), Belarus (7), Ý (5) và các dòng khác.từ 10 quốc gia.Bộ này cũng bao gồm các dòng kháng tham khảo: 83A:476, Tanjil, Wonga mang alen Lanr1 và Mandelup mang alen AnMan.Các dòng được lấy từ Cơ sở dữ liệu tài nguyên di truyền Lupin châu Âu được duy trì bởi Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Ba Lan (Bảng bổ trợ S1).
Cây được trồng trong điều kiện có kiểm soát (thời gian chiếu sáng 16 giờ, nhiệt độ 25°C vào ban ngày và 18°C ​​vào ban đêm).Hai bản sao sinh học đã được phân tích.DNA được phân lập từ những chiếc lá ba tuần tuổi bằng DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Đức) theo giao thức.Chất lượng và nồng độ của DNA phân lập được đánh giá bằng phương pháp trắc quang (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).Dấu hiệu AnManM1 đánh dấu gen kháng bệnh thán thư AnMan (có nguồn gốc từ cv. Mandelup) và các dấu hiệu Anseq3 và Anseq4 bên cạnh gen Lanr1 (có nguồn gốc từ cv. Tanjil) đã được phân tích 11,26,28.Các thể đồng hợp tử cho alen kháng thuốc được cho điểm là “1″, mẫn cảm – là “0″ và dị hợp tử – là 0,5.
Dựa trên kết quả sàng lọc các dấu hiệu AnManM1, AnSeq3 và AnSeq4 và sự sẵn có của hạt giống cho các thí nghiệm tiếp theo cuối cùng, 50 dòng NLL đã được chọn cho kiểu hình kháng bệnh thán thư.Phân tích được thực hiện lặp lại trong nhà kính điều khiển bằng máy tính với chu kỳ quang 14 giờ với phạm vi nhiệt độ là 22°C vào ban ngày và 19°C vào ban đêm.Hạt được cào (dùng dao sắc cắt bỏ vỏ hạt ở mặt đối diện của phôi) trước khi gieo để tránh hạt bị ngủ nghỉ do vỏ hạt quá cứng và để đảm bảo hạt nảy mầm đồng đều.Cây được trồng trong chậu (11 × 11 × 21 cm) với đất vô trùng (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Warsaw, Ba Lan).Việc cấy được thực hiện với chủng Colletotrichum lupini Col-08, được trồng vào năm 1999 từ thân của cây lupin lá hẹp được trồng trên một cánh đồng ở Verzhenitsa, Greater Ba Lan (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E ).Nhận một khu vực.Các chủng phân lập được nuôi cấy trong môi trường SNA ở 20° C. dưới ánh sáng đen trong 21 ngày để tạo ra bào tử.Bốn tuần sau khi gieo, khi cây đã đạt đến giai đoạn 4-6 lá, việc cấy được thực hiện bằng cách phun huyền phù conidia với nồng độ 0,5 x 106 conidia mỗi ml.Sau khi cấy, cây được giữ trong bóng tối trong 24 giờ ở độ ẩm khoảng 98% và nhiệt độ 25°C để tạo điều kiện thuận lợi cho sự nảy mầm của conidia và quá trình lây nhiễm.Sau đó, các cây này được trồng trong điều kiện quang chu kỳ 14 giờ ở nhiệt độ 22°C ngày/19°C đêm và độ ẩm 70%.Điểm số bệnh được thực hiện 22 ngày sau khi cấy và nằm trong khoảng từ 0 (miễn dịch) đến 9 (rất mẫn cảm) tùy thuộc vào sự hiện diện hay vắng mặt của các tổn thương hoại tử trên thân và lá.Ngoài ra, sau khi cho điểm, trọng lượng của cây được đo.Mối quan hệ giữa các kiểu gen đánh dấu và các kiểu hình bệnh được tính toán như là mối tương quan hai trình tự điểm (không có các dấu hiệu dị hợp tử trong tập hợp các dòng để phân tích kiểu hình kháng bệnh thán thư).