Cảm ơn bạn đã ghé thăm Nature.com.Phiên bản trình duyệt bạn đang sử dụng có hỗ trợ CSS hạn chế.Để có trải nghiệm tốt nhất, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng trình duyệt cập nhật (hoặc tắt Chế độ tương thích trong Internet Explorer).Trong thời gian chờ đợi, để đảm bảo hỗ trợ liên tục, chúng tôi sẽ hiển thị trang web không có kiểu và JavaScript.
Cần có một hệ thống in vitro đáng tin cậy có thể tái tạo chính xác môi trường sinh lý của tim để thử nghiệm thuốc.Sự sẵn có hạn chế của các hệ thống nuôi cấy mô tim của con người đã dẫn đến những diễn giải không chính xác về tác dụng của thuốc đối với tim.Ở đây, chúng tôi đã phát triển một mô hình nuôi cấy mô tim (CTCM) kích thích điện cơ các lát cắt tim và trải qua quá trình kéo dài sinh lý trong các giai đoạn tâm thu và tâm trương của chu kỳ tim.Sau 12 ngày nuôi cấy, phương pháp này đã cải thiện một phần khả năng tồn tại của các phần tim, nhưng không bảo toàn hoàn toàn tính toàn vẹn cấu trúc của chúng.Do đó, sau khi sàng lọc phân tử nhỏ, chúng tôi thấy rằng việc bổ sung 100 nM triiodothyronine (T3) và 1 μM dexamethasone (Dex) vào môi trường của chúng tôi đã duy trì cấu trúc vi mô của các phần trong 12 ngày.Kết hợp với điều trị T3/Dex, hệ thống CTCM duy trì cấu hình phiên mã, khả năng tồn tại, hoạt động trao đổi chất và tính toàn vẹn cấu trúc ở cùng mức độ như mô tim tươi trong 12 ngày.Ngoài ra, sự kéo căng quá mức của mô tim trong nuôi cấy gây ra tín hiệu tim phì đại, cung cấp bằng chứng cho khả năng của CTCM bắt chước các tình trạng phì đại do căng tim gây ra.Tóm lại, CTCM có thể mô hình hóa sinh lý và sinh lý bệnh của tim trong nuôi cấy trong thời gian dài, cho phép sàng lọc thuốc đáng tin cậy.
Trước khi nghiên cứu lâm sàng, cần có các hệ thống in vitro đáng tin cậy có thể tái tạo chính xác môi trường sinh lý của tim người.Các hệ thống như vậy sẽ bắt chước các đặc tính kéo dài cơ học, nhịp tim và điện sinh lý đã thay đổi.Các mô hình động vật thường được sử dụng làm nền tảng sàng lọc sinh lý tim với độ tin cậy hạn chế trong việc phản ánh tác dụng của thuốc đối với tim người1,2.Cuối cùng, Mô hình thí nghiệm nuôi cấy mô tim lý tưởng (CTCM) là một mô hình có độ nhạy cao và đặc hiệu cho các can thiệp điều trị và dược lý khác nhau, tái tạo chính xác sinh lý học và sinh lý bệnh của tim người3.Sự vắng mặt của một hệ thống như vậy đã hạn chế việc phát hiện ra các phương pháp điều trị mới cho bệnh suy tim4,5 và đã dẫn đến độc tính trên tim của thuốc như một lý do chính để rút khỏi thị trường6.
Trong thập kỷ qua, tám loại thuốc không phải tim mạch đã bị ngừng sử dụng trong lâm sàng vì chúng gây kéo dài khoảng QT dẫn đến rối loạn nhịp thất và đột tử7.Do đó, ngày càng có nhiều nhu cầu về các chiến lược sàng lọc tiền lâm sàng đáng tin cậy để đánh giá hiệu quả và độc tính trên tim mạch.Việc sử dụng gần đây các tế bào cơ tim có nguồn gốc từ tế bào gốc đa năng do con người gây ra (hiPS-CM) trong sàng lọc thuốc và thử nghiệm độc tính cung cấp một phần giải pháp cho vấn đề này.Tuy nhiên, bản chất chưa trưởng thành của hiPS-CM và sự thiếu phức tạp đa bào của mô tim là những hạn chế chính của phương pháp này.Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng hạn chế này có thể được khắc phục một phần bằng cách sử dụng hiPS-CM sớm để hình thành hydrogel mô tim ngay sau khi bắt đầu các cơn co thắt tự phát và tăng dần kích thích điện theo thời gian.Tuy nhiên, các vi mô hiPS-CM này thiếu các đặc tính điện sinh lý và co bóp trưởng thành của cơ tim trưởng thành.Ngoài ra, mô tim của con người có cấu trúc phức tạp hơn, bao gồm một hỗn hợp không đồng nhất của các loại tế bào khác nhau, bao gồm tế bào nội mô, tế bào thần kinh và nguyên bào sợi mô đệm, được kết nối với nhau bằng các bộ protein ma trận ngoại bào cụ thể.Sự không đồng nhất này của các quần thể không phải tế bào cơ tim11,12,13 ở tim động vật có vú trưởng thành là một rào cản lớn đối với việc mô hình hóa mô tim bằng cách sử dụng các loại tế bào riêng lẻ.Những hạn chế chính này nhấn mạnh tầm quan trọng của việc phát triển các phương pháp nuôi cấy mô cơ tim nguyên vẹn trong điều kiện sinh lý và bệnh lý.
Các phần mỏng (300 µm) được nuôi cấy của tim người đã được chứng minh là một mô hình đầy hứa hẹn của cơ tim nguyên vẹn của con người.Phương pháp này cung cấp quyền truy cập vào một hệ thống đa bào 3D hoàn chỉnh tương tự như mô tim của con người.Tuy nhiên, cho đến năm 2019, việc sử dụng các phần tim nuôi cấy bị hạn chế do thời gian nuôi cấy ngắn (24 giờ).Điều này là do một số yếu tố bao gồm thiếu độ giãn vật lý-cơ học, giao diện không khí-lỏng và việc sử dụng các phương tiện đơn giản không hỗ trợ nhu cầu của mô tim.Vào năm 2019, một số nhóm nghiên cứu đã chứng minh rằng việc kết hợp các yếu tố cơ học vào hệ thống nuôi cấy mô tim có thể kéo dài thời gian nuôi cấy, cải thiện biểu hiện của tim và bắt chước bệnh lý tim.Hai nghiên cứu tao nhã 17 và 18 cho thấy tải cơ học đơn phương có tác động tích cực đến kiểu hình tim trong quá trình nuôi cấy.Tuy nhiên, những nghiên cứu này không sử dụng tải trọng vật lý ba chiều động của chu kỳ tim, do các phần tim được tải bằng lực căng đẳng phương 17 hoặc tải phụ trợ tuyến tính 18 .Những phương pháp kéo dài mô này dẫn đến việc ức chế nhiều gen tim hoặc biểu hiện quá mức các gen liên quan đến phản ứng kéo dài bất thường.Đáng chú ý, Pitoulis et al.19 đã phát triển bể nuôi cấy lát cắt tim động để tái tạo chu kỳ tim bằng cách sử dụng phản hồi của bộ chuyển đổi lực và truyền lực căng.Mặc dù hệ thống này cho phép mô hình hóa chu kỳ tim trong ống nghiệm chính xác hơn, nhưng độ phức tạp và thông lượng thấp của phương pháp đã hạn chế ứng dụng của hệ thống này.Phòng thí nghiệm của chúng tôi gần đây đã phát triển một hệ thống nuôi cấy đơn giản hóa bằng cách sử dụng kích thích điện và môi trường được tối ưu hóa để duy trì khả năng tồn tại của các phần mô tim của lợn và người trong tối đa 6 ngày20,21.
Trong bản thảo hiện tại, chúng tôi mô tả một mô hình nuôi cấy mô tim (CTCM) bằng cách sử dụng các phần của tim lợn kết hợp các dấu hiệu hài hước để tóm tắt lại sinh lý tim ba chiều và căng thẳng sinh lý bệnh trong chu kỳ tim.CTCM này có thể tăng độ chính xác của dự đoán thuốc tiền lâm sàng lên mức chưa từng đạt được trước đây bằng cách cung cấp một hệ thống tim thông lượng trung bình, hiệu quả về chi phí, mô phỏng sinh lý/sinh lý bệnh của tim động vật có vú để thử nghiệm thuốc tiền lâm sàng.
Các tín hiệu cơ học huyết động đóng một vai trò quan trọng trong việc duy trì chức năng tế bào cơ tim trong ống nghiệm 22,23,24.Trong bản thảo hiện tại, chúng tôi đã phát triển một CTCM (Hình 1a) có thể bắt chước môi trường tim của người trưởng thành bằng cách tạo ra cả kích thích điện và cơ học ở tần số sinh lý (1,2 Hz, 72 nhịp mỗi phút).Để tránh kéo căng mô quá mức trong thời kỳ tâm trương, một thiết bị in 3D đã được sử dụng để tăng kích thước mô lên 25% (Hình 1b).Tạo nhịp điện do hệ thống C-PACE tạo ra đã được hẹn giờ để bắt đầu 100 mili giây trước tâm thu bằng cách sử dụng hệ thống thu thập dữ liệu để tái tạo đầy đủ chu kỳ tim.Hệ thống nuôi cấy mô sử dụng bộ truyền động khí nén có thể lập trình (LB Engineering, Đức) để mở rộng theo chu kỳ màng silicon dẻo nhằm gây ra sự giãn nở của các lát tim ở khoang trên.Hệ thống được kết nối với đường dẫn khí bên ngoài thông qua bộ chuyển đổi áp suất, giúp điều chỉnh chính xác áp suất (± 1 mmHg) và thời gian (± 1 ms) (Hình 1c).
a Gắn phần mô vào vòng đỡ 7 mm, màu xanh lam, bên trong khoang nuôi cấy của thiết bị.Buồng nuôi cấy được ngăn cách với buồng không khí bằng một màng silicon dẻo mỏng.Đặt một miếng đệm giữa mỗi ngăn để tránh rò rỉ.Nắp của thiết bị chứa các điện cực than chì cung cấp kích thích điện.b Biểu diễn sơ đồ của thiết bị mô lớn, vòng dẫn hướng và vòng hỗ trợ.Các phần mô (màu nâu) được đặt trên thiết bị ngoại cỡ với vòng dẫn hướng được đặt trong rãnh ở mép ngoài của thiết bị.Sử dụng hướng dẫn, cẩn thận đặt vòng hỗ trợ được phủ keo acrylic mô lên trên phần mô tim.c Biểu đồ hiển thị thời gian kích thích điện dưới dạng hàm của áp suất buồng khí được điều khiển bởi bộ truyền động khí nén có thể lập trình (PPD).Một thiết bị thu thập dữ liệu đã được sử dụng để đồng bộ hóa kích thích điện bằng cảm biến áp suất.Khi áp suất trong buồng nuôi cấy đạt đến ngưỡng đã đặt, tín hiệu xung sẽ được gửi đến C-PACE-EM để kích hoạt kích thích điện.d Hình ảnh 4 CTCM đặt trên giá tủ ấm.Bốn thiết bị được kết nối với một PPD thông qua mạch khí nén và các cảm biến áp suất được lắp vào van cầm máu để theo dõi áp suất trong mạch khí nén.Mỗi thiết bị chứa sáu phần mô.
Sử dụng một bộ truyền động khí nén duy nhất, chúng tôi có thể điều khiển 4 thiết bị CTCM, mỗi thiết bị có thể chứa 6 phần mô (Hình 1d).Trong CTCM, áp suất không khí trong buồng khí được chuyển đổi thành áp suất đồng bộ trong buồng chất lỏng và gây ra sự giãn nở sinh lý của lát cắt tim (Hình 2a và Phim bổ sung 1).Đánh giá độ căng của mô ở 80 mm Hg.Nghệ thuật.cho thấy các phần mô kéo dài 25% (Hình 2b).Độ giãn phần trăm này đã được chứng minh là tương ứng với chiều dài sarcomere sinh lý là 2,2–2,3 µm đối với khả năng co bóp của phần tim bình thường17,19,25.Chuyển động của mô được đánh giá bằng cài đặt máy ảnh tùy chỉnh (Bổ sung Hình 1).Biên độ và vận tốc của chuyển động mô (Hình 2c, d) tương ứng với độ giãn trong chu kỳ tim và thời gian trong tâm thu và tâm trương (Hình 2b).Độ căng và vận tốc của mô tim trong quá trình co và giãn không đổi trong 12 ngày nuôi cấy (Hình 2f).Để đánh giá tác động của kích thích điện đối với khả năng co bóp trong quá trình nuôi cấy, chúng tôi đã phát triển một phương pháp xác định biến dạng hoạt động bằng thuật toán tạo bóng (Hình bổ sung 2a, b) và có thể phân biệt giữa các biến dạng có và không có kích thích điện.Cùng một phần của trái tim (Hình 2f).Ở vùng di động của vết cắt (R6-9), điện áp trong quá trình kích thích điện cao hơn 20% so với khi không có kích thích điện, điều này cho thấy sự đóng góp của kích thích điện đối với chức năng co bóp.
Các dấu vết đại diện của áp suất buồng khí, áp suất buồng chất lỏng và các phép đo chuyển động của mô xác nhận rằng áp suất buồng thay đổi áp suất buồng chất lỏng, gây ra chuyển động tương ứng của lát cắt mô.b Dấu vết đại diện của phần trăm độ căng (màu xanh) của các phần mô tương ứng với phần trăm độ căng (màu cam).c Chuyển động đo được của lát cắt tim phù hợp với tốc độ chuyển động đo được.( d ) Các quỹ đạo đại diện của chuyển động tuần hoàn (đường màu xanh) và vận tốc (đường chấm màu cam) trong một lát cắt của trái tim.e Định lượng thời gian chu kỳ (n = 19 lát mỗi nhóm, từ những con lợn khác nhau), thời gian co lại (n = 19 lát mỗi nhóm), thời gian thư giãn (n = 19 lát mỗi nhóm, từ những con lợn khác nhau), chuyển động của mô (n = 25 ).lát)/nhóm từ những con lợn khác nhau), vận tốc tâm thu cực đại (n = 24(D0), 25(D12) lát/nhóm từ những con lợn khác nhau) và tốc độ thư giãn tối đa (n=24(D0), 25(D12) lát/nhóm từ những con lợn khác nhau).Bài kiểm tra t của Học sinh hai đuôi cho thấy không có sự khác biệt đáng kể trong bất kỳ tham số nào.f Dấu vết phân tích biến dạng đại diện của các phần mô có kích thích điện (màu đỏ) và không có (màu xanh), mười vùng của các phần mô từ cùng một phần.Các bảng dưới cùng cho thấy định lượng của sự khác biệt phần trăm về biến dạng trong các phần mô có và không có kích thích điện ở mười khu vực từ các phần khác nhau. (n = 8 lát/nhóm từ những con lợn khác nhau, kiểm tra t Sinh viên hai đuôi được thực hiện; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 lát/nhóm từ những con lợn khác nhau, kiểm tra t Sinh viên hai đuôi được thực hiện; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p< 0,01, *p<0,05). (n = 8 phần/nhóm từ những con lợn khác nhau, bài kiểm tra t của Học sinh hai đuôi; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,05）。 （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,05）。 (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 phần/nhóm, từ những con lợn khác nhau, bài kiểm tra t của Học sinh hai đuôi; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Các thanh lỗi biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn.
Trong hệ thống nuôi cấy lát cắt tim mô phỏng sinh học tĩnh trước đây của chúng tôi [20, 21], chúng tôi đã duy trì khả năng tồn tại, chức năng và tính toàn vẹn cấu trúc của các lát cắt tim trong 6 ngày bằng cách áp dụng kích thích điện và tối ưu hóa thành phần môi trường.Tuy nhiên, sau 10 ngày, những con số này đã giảm mạnh.Chúng tôi sẽ đề cập đến các phần được nuôi cấy trong hệ thống nuôi cấy mô phỏng sinh học tĩnh trước đây của chúng tôi 20, 21 điều kiện kiểm soát (Ctrl) và chúng tôi sẽ sử dụng môi trường đã được tối ưu hóa trước đây của chúng tôi làm điều kiện MC và nuôi cấy dưới sự kích thích cơ và điện đồng thời (CTCM).gọi điện .Đầu tiên, chúng tôi xác định rằng kích thích cơ học mà không có kích thích điện là không đủ để duy trì khả năng tồn tại của mô trong 6 ngày (Hình bổ sung 3a, b).Thật thú vị, với sự ra đời của kích thích cơ học và cơ học bằng STCM, khả năng tồn tại của các phần tim 12 ngày vẫn giống như trong các phần tim tươi trong điều kiện MS, nhưng không phải trong điều kiện Ctrl, như phân tích MTT (Hình 1).3a).Điều này cho thấy rằng kích thích cơ học và mô phỏng chu kỳ tim có thể giữ cho các phần mô tồn tại lâu gấp đôi so với báo cáo trong hệ thống nuôi cấy tĩnh trước đây của chúng tôi.Tuy nhiên, việc đánh giá tính toàn vẹn cấu trúc của các phần mô bằng cách dán nhãn miễn dịch cho troponin T tim và connexin 43 cho thấy biểu hiện của connexin 43 ở các mô MC vào ngày 12 cao hơn đáng kể so với nhóm chứng trong cùng ngày.Tuy nhiên, biểu thức connexin 43 thống nhất và sự hình thành đĩa Z không được duy trì đầy đủ (Hình 3b).Chúng tôi sử dụng khung trí tuệ nhân tạo (AI) để định lượng tính toàn vẹn cấu trúc mô26, một quy trình học sâu dựa trên hình ảnh dựa trên troponin-T và nhuộm connexin43 để tự động định lượng tính toàn vẹn cấu trúc và huỳnh quang của các lát cắt tim về cường độ định vị.Phương pháp này sử dụng Mạng thần kinh chuyển đổi (CNN) và khung học sâu để định lượng đáng tin cậy tính toàn vẹn cấu trúc của mô tim theo cách tự động và không thiên vị, như được mô tả trong tài liệu tham khảo.26. Mô MC cho thấy sự tương đồng về cấu trúc được cải thiện so với ngày 0 so với các phần kiểm soát tĩnh.Ngoài ra, nhuộm ba màu của Masson cho thấy tỷ lệ xơ hóa thấp hơn đáng kể trong điều kiện MS so với điều kiện kiểm soát vào ngày nuôi cấy thứ 12 (Hình 3c).Mặc dù CTCM tăng khả năng tồn tại của các phần mô tim ở ngày thứ 12 lên mức tương tự như mô tim tươi, nhưng nó không cải thiện đáng kể tính toàn vẹn cấu trúc của các phần tim.
Biểu đồ dạng thanh thể hiện định lượng khả năng tồn tại MTT của các lát tim tươi (D0) hoặc nuôi cấy lát cắt tim trong 12 ngày trong môi trường nuôi cấy tĩnh (D12 Ctrl) hoặc trong CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 lát/nhóm (D12 MC) từ các con lợn khác nhau, thử nghiệm ANOVA một chiều được thực hiện; ####p < 0,0001 so với D0 và **p < 0,01 so với D 12 Ctrl). Biểu đồ dạng thanh thể hiện định lượng về khả năng tồn tại MTT của các lát tim tươi (D0) hoặc nuôi cấy lát cắt tim trong 12 ngày trong môi trường nuôi cấy tĩnh (D12 Ctrl) hoặc trong CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl ), 12 lát/nhóm (D12 MC) từ các con lợn khác nhau, thử nghiệm ANOVA một chiều được thực hiện; ####p < 0,0001 so với D0 và **p < 0,01 so với D12 Ctrl).biểu đồ cho thấy định lượng khả năng sống của các phần tim tươi MTT (D0) hoặc nuôi cấy các phần tim trong 12 ngày trong môi trường nuôi cấy tĩnh (đối chứng D12) hoặc CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (đối chứng D12) ), 12 phần/nhóm (D12 MC) từ các lợn khác nhau, thử nghiệm ANOVA một chiều được thực hiện;####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 so với D0 và **p < 0,01 so với D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) 或心脏切片培养12天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0,0001，与D12 Ctrl 相比，**p < 0,01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) ，来自不同猪的12 (D1) 2 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p。)biểu đồ thể hiện việc định lượng khả năng sống của MTT trong các phần tim tươi (D0) hoặc các phần tim được nuôi cấy trong 12 ngày trong môi trường nuôi cấy tĩnh (đối chứng D12) hoặc CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (đối chứng D12)), 12 phần/nhóm (D12 MC) từ các lợn khác nhau, xét nghiệm ANOVA một chiều;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 so với D0, **p < 0,01 so với D12 Ctrl).b Troponin-T (xanh lá cây), connexin 43 (đỏ) và DAPI (xanh dương) trong các phần tim mới phân lập (D0) hoặc các phần tim được nuôi cấy trong điều kiện tĩnh (Ctrl) hoặc điều kiện CTCM (MC) trong 12 ngày) của hình ảnh miễn dịch huỳnh quang đại diện (tỷ lệ trống = 100 µm). Trí tuệ nhân tạo định lượng tính toàn vẹn cấu trúc mô tim (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) lát/nhóm từ mỗi con lợn khác nhau, thử nghiệm ANOVA một chiều được thực hiện; ####p < 0,0001 so với D0 và ****p < 0,0001 so với D12 Ctrl). Trí tuệ nhân tạo định lượng tính toàn vẹn cấu trúc mô tim (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) lát/nhóm từ mỗi con lợn khác nhau, thử nghiệm ANOVA một chiều được thực hiện; ####p < 0,0001 so với D0 và ****p < 0,0001 so với D12 Ctrl). N = 7 (D0) ), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сра внению с D0 и ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Định lượng tính toàn vẹn cấu trúc của mô tim bằng trí tuệ nhân tạo (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) phần/nhóm từ các lợn khác nhau, thử nghiệm ANOVA một chiều được thực hiện; ####p < 0,0001 so với D0 và ****p < 0,0001 so với D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) lát/nhóm mỗi con lợn khác nhau, thử nghiệm ANOVA một chiều;####p < 0,0001 与D0 相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) lát/nhóm mỗi con lợn khác nhau, kiểm tra ANOVA một chiều;####p < 0,0001 与D0相比，****p < 0 .0001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной сткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 so với D0 Дл я сравнения ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Trí tuệ nhân tạo để định lượng tính toàn vẹn cấu trúc của mô tim (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) phần/nhóm mỗi con lợn khác nhau, xét nghiệm ANOVA một chiều; ####p<0,0001 so với .D0 Để so sánh ****p < 0,0001 so với D12 Ctrl). c Hình ảnh đại diện (trái) và định lượng (phải) cho các lát cắt trái tim được nhuộm bằng thuốc nhuộm ba màu của Masson (Scale bare = 500 µm) (n = 10 lát/nhóm từ mỗi con lợn khác nhau, thử nghiệm ANOVA một chiều được thực hiện; ####p < 0,0001 so với D0 và ***p < 0,001 so với D12 Ctrl). c Hình ảnh đại diện (trái) và định lượng (phải) cho các lát tim được nhuộm bằng thuốc nhuộm ba màu của Masson (Tỷ lệ trần = 500 µm) (n = 10 lát/mỗi nhóm từ các con lợn khác nhau, thử nghiệm ANOVA một chiều được thực hiện; #### p < 0,0001 so với D0 và ***p < 0,001 so với D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) và количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенны х трихромным красителем Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу о разнтых свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Hình ảnh đại diện (trái) và định lượng (phải) của các phần tim được nhuộm bằng thuốc nhuộm ba màu của Masson (tỷ lệ không phủ = 500 µm) (n = 10 phần/nhóm từ những con lợn khác nhau, thử nghiệm ANOVA một chiều được thực hiện; #### p < 0,0001 so với D0 và ***p < 0,001 so với D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度= 500 µm）（n = 10 个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 C 用 masson 三色染料的心脏切片的代表性（左左）量化（右）裸尺度裸尺度裸尺度裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 Anova 测试；#### p < 0,0001 与D0相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Репрезентативные изображения (слева) và количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенны х трихромным красителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый о друтго й свиньи, протестировано с помощью однофакторного дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Hình ảnh đại diện (trái) và định lượng (phải) của các phần tim được nhuộm bằng thuốc nhuộm ba màu của Masson (trống = 500 µm) (n = 10 phần/nhóm, mỗi phần từ một con lợn khác nhau, được thử nghiệm bằng phân tích phương sai một chiều; ### # p < 0,0001 so với D0, ***p < 0,001 so với D12 Ctrl).Các thanh lỗi biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn.
Chúng tôi đã đưa ra giả thuyết rằng bằng cách thêm các phân tử nhỏ vào môi trường nuôi cấy, tính toàn vẹn của tế bào cơ tim có thể được cải thiện và giảm sự phát triển xơ hóa trong quá trình nuôi cấy CTCM.Do đó, chúng tôi đã sàng lọc các phân tử nhỏ bằng cách sử dụng các nền văn hóa kiểm soát tĩnh của chúng tôi20,21 do số lượng nhỏ các yếu tố gây nhiễu.Dexamethasone (Dex), triiodothyronine (T3) và SB431542 (SB) đã được chọn cho màn hình này.Những phân tử nhỏ này trước đây đã được sử dụng trong môi trường nuôi cấy hiPSC-CM để tạo ra sự trưởng thành của tế bào cơ tim bằng cách tăng chiều dài sarcomere, ống T và tốc độ dẫn truyền.Ngoài ra, cả Dex (một loại glucocorticoid) và SB đều được biết là có tác dụng ức chế viêm29,30.Do đó, chúng tôi đã kiểm tra xem việc bao gồm một hoặc sự kết hợp của các phân tử nhỏ này có cải thiện tính toàn vẹn cấu trúc của các phần tim hay không.Để sàng lọc ban đầu, liều lượng của từng hợp chất được chọn dựa trên nồng độ thường được sử dụng trong các mô hình nuôi cấy tế bào (1 μM Dex27, 100 nM T327 và 2,5 μM SB31).Sau 12 ngày nuôi cấy, sự kết hợp giữa T3 và Dex dẫn đến tính toàn vẹn cấu trúc tế bào cơ tim tối ưu và tái tạo xơ tối thiểu (Hình bổ sung 4 và 5).Ngoài ra, việc sử dụng gấp đôi hoặc gấp đôi các nồng độ T3 và Dex này tạo ra các tác động có hại so với nồng độ bình thường (Hình bổ sung 6a, b).
Sau khi sàng lọc ban đầu, chúng tôi đã thực hiện so sánh trực tiếp 4 điều kiện nuôi cấy (Hình 4a): Ctrl: các phần tim được nuôi cấy trong môi trường nuôi cấy tĩnh được mô tả trước đây của chúng tôi bằng môi trường được tối ưu hóa;20.21 TD: T3 và Ctrl s Đã thêm Dex vào thứ Tư;MC: các phần tim được nuôi cấy trong CTCM bằng môi trường đã được tối ưu hóa trước đây của chúng tôi;và MT: CTCM với T3 và Dex được thêm vào môi trường.Sau 12 ngày canh tác, khả năng tồn tại của các mô MS và MT vẫn giống như trong các mô tươi được đánh giá bằng xét nghiệm MTT (Hình 4b).Thật thú vị, việc bổ sung T3 và Dex vào môi trường nuôi cấy xuyên giếng (TD) không dẫn đến sự cải thiện đáng kể về khả năng sống sót so với điều kiện Ctrl, cho thấy vai trò quan trọng của kích thích cơ học trong việc duy trì khả năng sống sót của các phần tim.
một sơ đồ thiết kế thí nghiệm mô tả bốn điều kiện nuôi cấy được sử dụng để đánh giá tác động của kích thích cơ học và bổ sung T3/Dex trên môi trường trong 12 ngày. b Biểu đồ dạng thanh thể hiện định lượng về khả năng sống sau 12 ngày nuôi cấy trong cả 4 điều kiện nuôi cấy (Ctrl, TD, MC và MT) so với các lát tim tươi (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD và D12 MT), 12 (D12 MC) lát/nhóm từ các lợn khác nhau, kiểm tra ANOVA một chiều được thực hiện; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 so với D0 và **p < 0,01 so với D12 Ctrl). b Biểu đồ dạng thanh thể hiện định lượng về khả năng sống sau 12 ngày nuôi cấy trong cả 4 điều kiện nuôi cấy (Ctrl, TD, MC và MT) so với các lát tim tươi (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD và D12 MT), 12 (D12 MC) lát/nhóm từ các lợn khác nhau, kiểm tra ANOVA một chiều được thực hiện; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 so với D0 và **p < 0,01 so với D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культи вирования во всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится одностороннн ий тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b Biểu đồ dạng thanh thể hiện định lượng về khả năng sống sót sau 12 ngày nuôi cấy trong cả 4 điều kiện nuôi cấy (đối chứng, TD, MC và MT) so với các phần tim tươi (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD và D12 MT), 12 phần/nhóm (D12 MC) từ các lợn khác nhau, kiểm tra ANOVA một chiều; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 so với D0 và **p < 0,01 so với D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl、D12 TD 和D12 MT )，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0,0001，###p < 0,001 与D0 相比，**p < 0,01 与D12控制）。b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со с вежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, одностор онний тест ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Histogram showing all 4 culture conditions (control, TD, MC and MT) compared to fresh heart sections (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD and D12 MT), from different pigs 12 (D12 MC) sections/group, one-way ANOVA test; ####p<0.0001, ###p<0.001 vs. D0, **p<0.01 vs. control D12). c Biểu đồ dạng thanh biểu thị định lượng dòng glucose sau 12 ngày nuôi cấy ở cả 4 điều kiện nuôi cấy (Ctrl, TD, MC và MT) so với các lát tim tươi (D0) (n = 6 lát/nhóm từ các lợn khác nhau, thử nghiệm ANOVA một chiều được thực hiện; ###p < 0,001, so với D0 và ***p < 0,001 so với D12 Ctrl). c Biểu đồ dạng thanh biểu thị định lượng dòng glucose sau 12 ngày nuôi cấy ở cả 4 điều kiện nuôi cấy (Ctrl, TD, MC và MT) so với các lát tim tươi (D0) (n = 6 lát/nhóm từ các lợn khác nhau, thử nghiệm ANOVA một chiều được thực hiện; ###p < 0,001, so với D0 và ***p < 0,001 so với D12 Ctrl). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после куль тивирования во всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезам и сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных свиней, односторонний Выполняется тест ANOVA; ###p < 0,001 по ср авнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Biểu đồ cho thấy định lượng thông lượng glucose sau 12 ngày nuôi cấy trong cả 4 điều kiện nuôi cấy (đối chứng, TD, MC và MT) so với các phần tim tươi (D0) (n = 6 phần/nhóm từ các con lợn khác nhau, thử nghiệm ANOVA một chiều được thực hiện ; ###p < 0,001 so với D0 và ***p < 0,001 so với D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比，培养后12 天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl相比）。 C条形图显示所有4种条件（ctrl、td、mc和mt）新鲜心脏切片切片切片相比，培养后后12天的通量定量（n=6片/组，来自猪，，，，，，，猪猪单向执行ANOVA测试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после к ультивирования для всех 4 условий культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими с резами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от разных свиней, односторонний Были проведены тесы ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c Biểu đồ cho thấy định lượng thông lượng glucose sau 12 ngày sau nuôi cấy đối với cả 4 điều kiện nuôi cấy (đối chứng, TD, MC và MT) so với các phần tim tươi (D0) (n = 6 phần/nhóm, từ các con lợn khác nhau, các xét nghiệm ANOVA đơn phương đã được thực hiện, ###p <0,001 so với D0, ***p <0,001 so với D12 (đối chứng).d Biểu đồ phân tích biến dạng của các mô tươi (xanh dương), ngày 12 MC (xanh lục) và ngày 12 MT (đỏ) tại mười điểm phần mô khu vực (n = 4 lát / nhóm, thử nghiệm ANOVA một chiều; không có sự khác biệt đáng kể giữa các nhóm).e Biểu đồ núi lửa hiển thị các gen biểu hiện khác nhau trong các phần tim tươi (D0) so với các phần tim được nuôi cấy trong điều kiện tĩnh (Ctrl) hoặc trong điều kiện MT (MT) trong 10-12 ngày.f Sơ đồ nhiệt của các gen sarcomere cho các phần tim được nuôi cấy trong từng điều kiện nuôi cấy.Các thanh lỗi biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn.
Sự phụ thuộc trao đổi chất vào việc chuyển đổi từ quá trình oxy hóa axit béo sang quá trình đường phân là một dấu hiệu đặc trưng của quá trình biệt hóa tế bào cơ tim.Các tế bào cơ tim chưa trưởng thành chủ yếu sử dụng glucose để sản xuất ATP và có ty thể giảm sản với ít cristae5,32.Các phân tích sử dụng glucose cho thấy rằng trong điều kiện MC và MT, việc sử dụng glucose tương tự như ở các mô ngày 0 (Hình 4c).Tuy nhiên, các mẫu Ctrl cho thấy mức sử dụng glucose tăng đáng kể so với mô tươi.Điều này chỉ ra rằng sự kết hợp giữa CTCM và T3/Dex giúp tăng cường khả năng tồn tại của mô và bảo tồn kiểu hình trao đổi chất của các phần tim được nuôi cấy trong 12 ngày.Ngoài ra, phân tích biến dạng cho thấy mức độ biến dạng vẫn giữ nguyên như trong mô tim tươi trong 12 ngày ở điều kiện MT và MS (Hình 4d).
Để phân tích tác động tổng thể của CTCM và T3/Dex đối với bối cảnh phiên mã toàn cầu của mô lát tim, chúng tôi đã thực hiện RNAseq trên các lát cắt tim từ cả bốn điều kiện nuôi cấy khác nhau (Dữ liệu bổ sung 1).Thật thú vị, các phần MT cho thấy sự tương đồng phiên mã cao với mô tim tươi, chỉ có 16 biểu hiện khác biệt trong số 13.642 gen.Tuy nhiên, như chúng tôi đã trình bày trước đó, các lát Ctrl hiển thị 1229 gen được biểu hiện khác nhau sau 10–12 ngày nuôi cấy (Hình 4e).Những dữ liệu này đã được xác nhận bằng qRT-PCR của gen tim và nguyên bào sợi (Hình bổ sung 7a-c).Thật thú vị, các phần Ctrl cho thấy sự điều hòa giảm của các gen chu kỳ tế bào và tim và kích hoạt các chương trình gen gây viêm.Những dữ liệu này cho thấy rằng sự phân biệt, thường xảy ra sau quá trình nuôi cấy lâu dài, bị suy giảm hoàn toàn trong điều kiện MT (Hình bổ sung 8a, b).Nghiên cứu cẩn thận về các gen sarcomere cho thấy rằng chỉ trong điều kiện MT, các gen mã hóa sarcomere (Hình 4f) và kênh ion (Hình bổ sung 9) mới được bảo tồn, bảo vệ chúng khỏi bị ức chế trong các điều kiện Ctrl, TD và MC.Những dữ liệu này chứng minh rằng với sự kết hợp giữa kích thích cơ học và thể dịch (T3/Dex), bản phiên mã của lát cắt tim có thể vẫn tương tự như lát cắt tim tươi sau 12 ngày nuôi cấy.
Những phát hiện phiên mã này được hỗ trợ bởi thực tế là tính toàn vẹn cấu trúc của tế bào cơ tim trong các phần tim được bảo quản tốt nhất trong điều kiện MT trong 12 ngày, như thể hiện bởi connexin 43 nguyên vẹn và cục bộ (Hình 5a).Ngoài ra, xơ hóa ở các phần tim trong điều kiện MT đã giảm đáng kể so với Ctrl và tương tự như các phần tim tươi (Hình 5b).Những dữ liệu này chứng minh rằng sự kết hợp giữa kích thích cơ học và xử lý T3/Dex giúp bảo tồn hiệu quả cấu trúc tim trong các phần tim được nuôi cấy.
một hình ảnh miễn dịch huỳnh quang đại diện của troponin-T (xanh lục), connexin 43 (đỏ) và DAPI (xanh dương) trong các phần tim mới phân lập (D0) hoặc nuôi cấy trong 12 ngày trong cả bốn điều kiện nuôi cấy phần tim (thanh tỷ lệ = 100 µm).). Trí tuệ nhân tạo định lượng tính toàn vẹn cấu trúc mô tim (n = 7 (D0 và D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC và D12 MT) lát/nhóm từ những con lợn khác nhau, thử nghiệm ANOVA một chiều được thực hiện; ####p < 0,0001 so với D0 và *p < 0,05 hoặc ****p < 0,0001 so với D12 Ctrl). Trí tuệ nhân tạo định lượng tính toàn vẹn cấu trúc mô tim (n = 7 (D0 và D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC và D12 MT) lát/nhóm từ những con lợn khác nhau, thử nghiệm ANOVA một chiều được thực hiện; #### p < 0,0001 so với D0 và *p < 0,05 hoặc ****p < 0,0001 so với D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллект а (n = 7 (D0 и D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC и D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; #### p < 0,0001 сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Định lượng tính toàn vẹn cấu trúc của mô tim bằng cách sử dụng trí tuệ nhân tạo (n = 7 (D0 và D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC và D12 MT) phần/nhóm từ các lợn khác nhau, thử nghiệm ANOVA một chiều được thực hiện; #### p < 0,0001 so với D0 và *p < 0,05 hoặc ****p < 0,0001 so với D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。对不同猪的心脏结构完整性（n=7（d0和d12 ctrl）（5（d12 td、d12 mc和d12 mt）组）人工智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。Định lượng tính toàn vẹn cấu trúc của mô tim bằng trí tuệ nhân tạo ở các lợn khác nhau (n = 7 (D0 và D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC và D12 MT) phần/nhóm) bằng xét nghiệm ANOVA một chiều;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0,0001 so với D0 và *p < 0,05 hoặc ****p < 0,0001 so với D12 Ctrl). b Hình ảnh đại diện và định lượng cho các lát cắt tim được nhuộm bằng thuốc nhuộm ba màu của Masson (Thanh tỷ lệ = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD và D12 MC), 9 (D12 MT) lát/nhóm từ những con lợn khác nhau, thử nghiệm ANOVA một chiều được thực hiện; ####p < 0,0001 so với D0 và ***p < 0,001 hoặc ****p < 0,000 1 so với D12 Ctrl). b Hình ảnh đại diện và định lượng cho các lát cắt tim được nhuộm bằng thuốc nhuộm ba màu của Masson (Thanh tỷ lệ = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD và D12 MC), 9 (D12 MT) lát/nhóm từ những con lợn khác nhau, thử nghiệm ANOVA một chiều được thực hiện; ####p < 0,0001 so với D0 và ***p < 0,001 hoặc ****p < 0,000 1 so với D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения và количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным к расителем Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разн ых свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по ср авнению с D12 Ctrl). b Hình ảnh đại diện và định lượng của các phần tim được nhuộm bằng vết ba màu của Masson (thanh tỷ lệ = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD và D12 MC), 9 phần/nhóm (D12 MT) từ những con lợn khác nhau, được thực hiện ANOVA một chiều; ####p < 0,0001 so với D0 và ***p < 0,001 hoặc ****p < 0,0001 so với D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.00 1，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b用 masson三色染料的心脏切片的代表性和量化（比例尺尺=500 µm）（n=10（d0、d12 ct rl、d12 td和d12 mc）来自不同的9个d12mt）切片切片切片切片切片切片切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Репрезентативные изображения và количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Мас сона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Hình ảnh đại diện và định lượng của các phần tim được nhuộm bằng bộ ba màu của Masson (thanh tỷ lệ = 500 Pha) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD và D12 MC), 9 (D12 MT) từ các lợn/nhóm khác nhau, một phương pháp ANOVA; ####p <0,0001 so với D0, ***p <0,001 hoặc ****p <0,0001 so với D12 Ctrl).Các thanh lỗi biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn.
Cuối cùng, khả năng mô phỏng chứng phì đại tim của CTCM được đánh giá bằng cách tăng độ căng của mô tim.Trong CTCM, đỉnh áp suất buồng khí tăng từ 80 mmHg lên 80 mmHg.Nghệ thuật.(độ căng bình thường) lên đến 140 mmHg Art.(Hình 6a).Điều này tương ứng với mức tăng 32% độ giãn (Hình 6b), trước đây được hiển thị là độ giãn phần trăm tương ứng cần thiết cho các phần tim để đạt được độ dài sarcomere tương tự như độ dài được thấy trong chứng phì đại.Độ căng và vận tốc của mô tim trong quá trình co và giãn không đổi trong sáu ngày nuôi cấy (Hình 6c).Mô tim từ các điều kiện MT đã bị kéo căng bình thường (MT (Bình thường)) hoặc điều kiện căng quá mức (MT (OS)) trong sáu ngày.Sau bốn ngày nuôi cấy, dấu ấn sinh học phì đại NT-ProBNP đã tăng đáng kể trong môi trường ở điều kiện MT (OS) so với điều kiện MT (bình thường) (Hình 7a).Ngoài ra, sau sáu ngày nuôi cấy, kích thước tế bào trong MT (OS) (Hình 7b) tăng đáng kể so với các phần của tim MT (bình thường).Ngoài ra, sự chuyển vị hạt nhân NFATC4 đã tăng lên đáng kể ở các mô bị kéo căng quá mức (Hình 7c).Những kết quả này cho thấy sự phát triển tiến bộ của việc tái tạo bệnh lý sau khi tăng huyết áp và ủng hộ khái niệm rằng thiết bị CTCM có thể được sử dụng như một nền tảng để nghiên cứu tín hiệu phì đại cơ tim do căng.
Các dấu vết đại diện của áp suất buồng khí, áp suất buồng chất lỏng và các phép đo chuyển động của mô xác nhận rằng áp suất buồng thay đổi áp suất buồng chất lỏng, gây ra chuyển động tương ứng của lát cắt mô.b Đường cong tỷ lệ kéo dài và tỷ lệ kéo dài đại diện cho các phần mô bị kéo dài bình thường (màu cam) và quá mức (màu xanh).c Biểu đồ dạng thanh hiển thị thời gian chu kỳ (n = 19 lát mỗi nhóm, từ những con lợn khác nhau), thời gian co (n = 18-19 lát mỗi nhóm, từ những con lợn khác nhau), thời gian thư giãn (n = 19 lát mỗi nhóm, từ những con lợn khác nhau) ), biên độ chuyển động của mô (n = 14 lát/nhóm, từ những con lợn khác nhau), vận tốc tâm thu cực đại (n = 14 lát/nhóm, từ những con lợn khác nhau) và tốc độ thư giãn tối đa (n = 14 (D0), 15 (D6) ) phần/nhóm ) từ những con lợn khác nhau), thử nghiệm t của Sinh viên hai đuôi cho thấy không có sự khác biệt đáng kể trong bất kỳ tham số nào, cho thấy rằng các tham số này không đổi trong 6 ngày nuôi cấy với điện áp quá cao.Các thanh lỗi biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn.
một đồ thị định lượng nồng độ NT-ProBNP trong môi trường nuôi cấy từ các lát tim được nuôi cấy trong các điều kiện MT bình thường (Norm) hoặc kéo dài quá mức (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm và D4 MTOS) từ các con lợn khác nhau, ANOVA hai chiều được thực hiện; **p < 0,01 so với độ giãn bình thường). một biểu đồ thanh định lượng nồng độ NT-ProBNP trong môi trường nuôi cấy từ các lát tim được nuôi cấy trong các điều kiện MT bình thường (Norm) hoặc quá căng (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm và D4 MTOS) các lát/nhóm từ những con lợn khác nhau, ANOVA hai chiều được thực hiện; **p < 0,01 so với độ giãn bình thường).Biểu đồ định lượng về nồng độ NT-ProBNP trong môi trường nuôi cấy từ các lát cắt tim được nuôi cấy trong điều kiện kéo dài MT bình thường (chuẩn) hoặc kéo dài quá mức (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTNorm, D4 MTNorm và D4).MTOS) lát/nhóm từ những con lợn khác nhau, phân tích phương sai hai yếu tố được thực hiện;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). ** p < 0,01 so với độ giãn bình thường). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p < 0,01）。 a Định lượng nồng độ NT-ProBNP trong các lát cắt tim được nuôi cấy trong các điều kiện MT normal (Norm) hoặc overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) from other 猪的切片/组，可以双向方方发发动; **so sánh với kéo dài bình thường, p <0,01).biểu đồ Định lượng nồng độ NT-ProBNP trong lát cắt tim được nuôi cấy trong điều kiện MT bình thường kéo dài (chuẩn) hoặc kéo dài quá mức (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) và D4 MTOS) lát/nhóm từ những con lợn khác nhau, phân tích phương sai hai chiều;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). ** p < 0,01 so với độ giãn bình thường). b Hình ảnh đại diện cho các lát cắt tim được nhuộm bằng troponin-T và WGA (trái) và định lượng kích thước tế bào (phải) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) tế bào/nhóm từ 10 lát cắt khác nhau từ các con lợn khác nhau, thực hiện kiểm tra t Sinh viên hai đuôi; ****p < 0,0001 so với độ căng bình thường). b Hình ảnh đại diện cho các lát cắt tim được nhuộm troponin-T và WGA (trái) và định lượng kích thước tế bào (phải) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) tế bào/nhóm từ 10 lát cắt khác nhau từ các con lợn khác nhau, thực hiện kiểm tra t Sinh viên hai đuôi; ****p < 0,0001 so với độ căng bình thường). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количест венного определения размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срез ов от разных свиней, два- проводится хвостовой t-критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нор мальным растяжением). b Hình ảnh đại diện của các phần tim được nhuộm troponin-T và AZP (trái) và định lượng kích thước tế bào (phải) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) tế bào/nhóm từ 10 phần khác nhau từ các con lợn khác nhau, t-test của Sinh viên hai đuôi đã được thực hiện; ****p < 0,0001 so với chủng bình thường). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性图像（n = 330（D6 MTOS） ，来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t 检验；与正常拉伸相比，**** p < 0,0001）。 b Hình ảnh đại diện của các lát cắt trái tim được nhuộm bằng calcarein-T và WGA (trái) và kích thước tế bào (phải) (n = 330 (D6 MTOS), 369 từ 10 lát cắt khác nhau (D6 MTNorm)) Tế bào/组，两方法有尾学生t test；so với kéo dài bình thường，****p < 0,0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количест венная оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) và 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным расяжение м). b Hình ảnh đại diện của các phần tim được nhuộm bằng troponin-T và AZP (trái) và định lượng kích thước tế bào (phải) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) từ 10 phần khác nhau từ các con lợn khác nhau) Tế bào/nhóm, tiêu chí hai đuôi Student's t;****p < 0,0001 so với chủng bình thường). c Hình ảnh đại diện cho các lát cắt tim MTOS ngày 0 và ngày 6 được dán nhãn miễn dịch cho troponin-T và NFATC4 và định lượng sự chuyển vị của NFATC4 sang nhân của CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) lát/nhóm từ những con lợn khác nhau, kiểm tra t Sinh viên hai đuôi được thực hiện; *p <0,05). c Hình ảnh đại diện cho các lát cắt tim MTOS ngày 0 và ngày 6 được dán nhãn miễn dịch cho troponin-T và NFATC4 và định lượng sự chuyển vị của NFATC4 sang nhân của CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) lát/nhóm từ các lợn khác nhau , kiểm tra t Sinh viên hai đuôi được thực hiện; * p <0,05). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т và NFATC4, và количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/ группу от разных свиней , выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Hình ảnh đại diện cho các phần tim ở MTOS 0 và 6 ngày, được dán nhãn miễn dịch cho troponin-T và NFATC4, và định lượng chuyển vị NFATC4 trong nhân của các tế bào hang (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) lát / nhóm từ những con lợn khác nhau) đã thực hiện bài kiểm tra t của Sinh viên hai đuôi;* p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS 心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0,05)。 c Hình ảnh đại diện của dán nhãn miễn dịch calcanin-T và NFATC4 第0天和第6天MTOS lát cắt tim và NFATC4 từ các nhân tế bào NFATC4 易位至CM khác nhau的số lượng (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) 切礼/组, 时间双尾学生et 电影；*p < 0,05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки тропонином-Т и NFATC4 và количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/групп а, два- хвостатый t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Hình ảnh đại diện của các lát cắt tim MTOS vào ngày 0 và 6 để dán nhãn miễn dịch troponin-T và NFATC4 và định lượng chuyển vị NFATC4 trong nhân CM từ các con lợn khác nhau (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) lát/nhóm, tiêu chí t hai đuôi của Sinh viên; *p <0,05).Các thanh lỗi đại diện cho giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn.
Nghiên cứu tim mạch tịnh tiến yêu cầu các mô hình tế bào tái tạo chính xác môi trường tim.Trong nghiên cứu này, một thiết bị CTCM đã được phát triển và có đặc điểm là có thể kích thích các phần siêu mỏng của tim.Hệ thống CTCM bao gồm kích thích điện cơ đồng bộ sinh lý và làm giàu chất lỏng T3 và Dex.Khi các phần tim lợn tiếp xúc với các yếu tố này, khả năng sống sót, tính toàn vẹn cấu trúc, hoạt động trao đổi chất và biểu hiện phiên mã của chúng vẫn giống như trong mô tim tươi sau 12 ngày nuôi cấy.Ngoài ra, mô tim bị kéo căng quá mức có thể gây phì đại tim do quá căng.Nhìn chung, những kết quả này hỗ trợ vai trò quan trọng của các điều kiện nuôi cấy sinh lý trong việc duy trì kiểu hình tim bình thường và cung cấp một nền tảng để sàng lọc thuốc.
Nhiều yếu tố góp phần tạo ra một môi trường tối ưu cho hoạt động và sự sống của các tế bào cơ tim.Yếu tố rõ ràng nhất có liên quan đến (1) tương tác giữa các tế bào, (2) kích thích điện cơ, (3) yếu tố thể dịch và (4) cơ chất trao đổi chất.Các tương tác sinh lý giữa tế bào với tế bào đòi hỏi các mạng ba chiều phức tạp gồm nhiều loại tế bào được hỗ trợ bởi một ma trận ngoại bào.Các tương tác tế bào phức tạp như vậy rất khó tái tạo trong ống nghiệm bằng cách đồng nuôi cấy các loại tế bào riêng lẻ, nhưng có thể dễ dàng đạt được bằng cách sử dụng bản chất tổ chức của các phần tim.
Kéo căng cơ học và kích thích điện của tế bào cơ tim là rất quan trọng để duy trì kiểu hình tim33,34,35.Mặc dù kích thích cơ học đã được sử dụng rộng rãi để điều hòa và trưởng thành hiPSC-CM, một số nghiên cứu tao nhã gần đây đã thử kích thích cơ học các lát tim trong nuôi cấy bằng cách sử dụng tải đơn phương.Những nghiên cứu này cho thấy tải trọng cơ học một trục 2D có tác động tích cực đến kiểu hình của tim trong quá trình nuôi cấy.Trong các nghiên cứu này, các phần của tim được tải bằng lực kéo đẳng cự17, tải phụ trợ tuyến tính18 hoặc chu kỳ tim được tái tạo bằng cách sử dụng phản hồi đầu dò lực và truyền lực căng.Tuy nhiên, các phương pháp này sử dụng kéo căng mô đơn trục mà không tối ưu hóa môi trường, dẫn đến ức chế nhiều gen tim hoặc biểu hiện quá mức các gen liên quan đến phản ứng kéo dài bất thường.CTCM được mô tả ở đây cung cấp kích thích điện cơ 3D mô phỏng chu kỳ tim tự nhiên về thời gian chu kỳ và độ giãn sinh lý (độ giãn 25%, tâm thu 40%, tâm trương 60% và 72 nhịp mỗi phút).Mặc dù kích thích cơ học ba chiều này không đủ để duy trì tính toàn vẹn của mô, nhưng cần có sự kết hợp giữa kích thích thể dịch và cơ học bằng cách sử dụng T3/Dex để duy trì đầy đủ khả năng tồn tại, chức năng và tính toàn vẹn của mô.
Các yếu tố thể dịch đóng một vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh kiểu hình tim trưởng thành.Điều này đã được nhấn mạnh trong các nghiên cứu HiPS-CM trong đó T3 và Dex được thêm vào môi trường nuôi cấy để đẩy nhanh quá trình trưởng thành của tế bào.T3 có thể ảnh hưởng đến việc vận chuyển axit amin, đường và canxi qua màng tế bào36.Ngoài ra, T3 thúc đẩy sự biểu hiện MHC-α và quá trình điều hòa giảm MHC-β, thúc đẩy sự hình thành các sợi cơ co giật nhanh trong các tế bào cơ tim trưởng thành so với các sợi cơ co giật chậm ở CM bào thai.Sự thiếu hụt T3 ở bệnh nhân suy giáp dẫn đến mất các dải tơ cơ và giảm tốc độ phát triển trương lực37.Dex tác động lên các thụ thể glucocorticoid và đã được chứng minh là làm tăng khả năng co bóp của cơ tim ở những trái tim được tưới máu bị cô lập;38 sự cải thiện này được cho là có liên quan đến tác động đối với sự xâm nhập do lắng đọng canxi (SOCE) 39,40.Ngoài ra, Dex liên kết với các thụ thể của nó, gây ra phản ứng nội bào rộng rãi ngăn chặn chức năng miễn dịch và viêm30.
Kết quả của chúng tôi chỉ ra rằng kích thích cơ học vật lý (MS) đã cải thiện hiệu suất nuôi cấy tổng thể so với Ctrl, nhưng không duy trì được khả năng tồn tại, tính toàn vẹn cấu trúc và biểu hiện của tim trong 12 ngày nuôi cấy.So với Ctrl, việc bổ sung nuôi cấy T3 và Dex vào CTCM (MT) đã cải thiện khả năng sống sót và duy trì cấu hình phiên mã tương tự, tính toàn vẹn cấu trúc và hoạt động trao đổi chất với mô tim tươi trong 12 ngày.Ngoài ra, bằng cách kiểm soát mức độ căng của mô, một mô hình phì đại cơ tim do căng quá mức đã được tạo ra bằng cách sử dụng STCM, minh họa cho tính linh hoạt của hệ thống STCM.Cần lưu ý rằng mặc dù quá trình tái tạo và xơ hóa tim thường liên quan đến các cơ quan còn nguyên vẹn mà các tế bào tuần hoàn có thể cung cấp các cytokine thích hợp cũng như quá trình thực bào và các yếu tố tái tạo khác, các phần của tim vẫn có thể bắt chước quá trình xơ hóa để đáp ứng với căng thẳng và chấn thương.thành myofibroblasts.Điều này đã được đánh giá trước đây trong mô hình lát cắt tim này.Cần lưu ý rằng các thông số CTCM có thể được điều chỉnh bằng cách thay đổi biên độ và tần số áp suất/điện để mô phỏng nhiều tình trạng như nhịp tim nhanh, nhịp tim chậm và hỗ trợ tuần hoàn cơ học (tim không tải cơ học).Điều này làm cho hệ thống trở thành một thông lượng trung bình để thử nghiệm thuốc.Khả năng mô hình hóa chứng phì đại tim do gắng sức quá mức của CTCM mở đường cho việc thử nghiệm hệ thống này cho liệu pháp cá nhân hóa.Tóm lại, nghiên cứu hiện tại chứng minh rằng sự kéo dài cơ học và kích thích thể dịch là rất quan trọng để duy trì việc nuôi cấy các phần mô tim.
Mặc dù dữ liệu được trình bày ở đây cho thấy rằng CTCM là một nền tảng rất hứa hẹn để mô hình hóa cơ tim nguyên vẹn, phương pháp nuôi cấy này có một số hạn chế.Hạn chế chính của nuôi cấy CTCM là nó tạo ra các ứng suất cơ học động liên tục lên các lát cắt, điều này ngăn cản khả năng theo dõi chủ động các cơn co thắt của lát cắt tim trong mỗi chu kỳ.Ngoài ra, do kích thước của các phần tim nhỏ (7 mm), khả năng đánh giá chức năng tâm thu bên ngoài hệ thống nuôi cấy sử dụng cảm biến lực truyền thống bị hạn chế.Trong bản thảo hiện tại, chúng tôi đã khắc phục một phần hạn chế này bằng cách đánh giá điện áp quang như một chỉ báo về chức năng co bóp.Tuy nhiên, hạn chế này sẽ cần nghiên cứu thêm và có thể được giải quyết trong tương lai bằng cách giới thiệu các phương pháp theo dõi quang học chức năng của các lát cắt tim trong nuôi cấy, chẳng hạn như lập bản đồ quang học sử dụng canxi và thuốc nhuộm nhạy cảm với điện áp.Một hạn chế khác của CTCM là mô hình làm việc không điều khiển được stress sinh lý (tiền tải và hậu tải).Trong CTCM, áp suất được tạo ra theo các hướng ngược nhau để tái tạo 25% độ giãn sinh lý ở tâm trương (độ căng hoàn toàn) và tâm thu (độ dài co bóp trong quá trình kích thích điện) trong các mô rất lớn.Hạn chế này nên được loại bỏ trong các thiết kế CTCM trong tương lai bằng cách tạo áp lực thích hợp lên mô tim từ cả hai phía và bằng cách áp dụng các mối quan hệ thể tích-áp suất chính xác xảy ra trong các buồng tim.
Việc tu sửa do quá mức gây ra được báo cáo trong bản thảo này chỉ giới hạn ở việc bắt chước các tín hiệu quá mức phì đại.Do đó, mô hình này có thể giúp nghiên cứu tín hiệu phì đại do kéo dài mà không cần đến các yếu tố thể dịch hoặc thần kinh (không tồn tại trong hệ thống này).Cần có các nghiên cứu sâu hơn để tăng tính đa dạng của CTCM, ví dụ, đồng nuôi cấy với các tế bào miễn dịch, lưu thông các yếu tố thể dịch trong huyết tương và bảo tồn khi đồng nuôi cấy với các tế bào thần kinh sẽ cải thiện khả năng mô hình hóa bệnh bằng CTCM.
Mười ba con lợn đã được sử dụng trong nghiên cứu này.Tất cả các quy trình trên động vật được thực hiện theo hướng dẫn của tổ chức và đã được phê duyệt bởi Ủy ban Chăm sóc và Sử dụng Động vật của Thể chế Đại học Louisville.Kẹp cung động mạch chủ và tim được tưới máu bằng 1 L dung dịch liệt cơ tim vô trùng (NaCl 110 mM, CaCl2 1,2 mM, KCl 16 mM, MgCl2 16 mM, NaHCO3 10 mM, heparin 5 U/mL, pH lên đến 7,4); trái tim được bảo quản trong dung dịch liệt cơ tim lạnh như băng cho đến khi được vận chuyển đến phòng thí nghiệm trên băng, thường là <10 phút. trái tim được bảo quản trong dung dịch liệt cơ tim lạnh như băng cho đến khi được vận chuyển đến phòng thí nghiệm trên băng, thường là <10 phút. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льд у, что обычно занимает <10 мин. trái tim được bảo quản trong dung dịch liệt cơ tim lạnh như băng cho đến khi vận chuyển đến phòng thí nghiệm trên băng, thường mất <10 phút.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 м ин. Giữ tim trên băng liệt cơ tim cho đến khi vận chuyển đến phòng thí nghiệm trên băng, thường là <10 phút.
Thiết bị CTCM được phát triển trong phần mềm thiết kế hỗ trợ máy tính (CAD) của SolidWorks.Các buồng nuôi cấy, ngăn và buồng khí được làm bằng nhựa acrylic trong suốt CNC.Vòng dự phòng có đường kính 7 mm được làm bằng polyetylen mật độ cao (HDPE) ở trung tâm và có rãnh vòng chữ o để chứa vòng chữ o silicon được sử dụng để bịt kín phương tiện bên dưới.Một màng silica mỏng ngăn cách khoang nuôi cấy với tấm tách.Màng silicon được cắt bằng laser từ tấm silicon dày 0,02″ và có độ cứng 35A.Các miếng đệm silicon trên và dưới được cắt bằng laze từ tấm silicon dày 1/16″ và có độ cứng 50A.Vít và đai ốc cánh bằng thép không gỉ 316L được sử dụng để siết chặt khối và tạo độ kín khí.
Bảng mạch in chuyên dụng (PCB) được thiết kế để tích hợp với hệ thống C-PACE-EM.Các ổ cắm đầu nối máy Thụy Sĩ trên PCB được kết nối với các điện cực than chì bằng dây đồng mạ bạc và các vít 0-60 bằng đồng được vặn vào các điện cực.Bảng mạch in được đặt trong vỏ máy in 3D.
Thiết bị CTCM được điều khiển bởi bộ truyền động khí nén có thể lập trình (PPD) tạo ra áp suất tuần hoàn được kiểm soát tương tự như chu kỳ tim.Khi áp suất bên trong buồng khí tăng lên, màng silicon dẻo sẽ nở ra phía trên, ép môi trường bên dưới vị trí mô.Khu vực mô sau đó sẽ được kéo dài bởi sự trục xuất chất lỏng này, bắt chước sự giãn nở sinh lý của tim trong thời kỳ tâm trương.Ở đỉnh điểm của sự thư giãn, kích thích điện được áp dụng thông qua các điện cực than chì, làm giảm áp suất trong buồng khí và gây ra sự co lại của các phần mô.Bên trong đường ống là một van cầm máu với cảm biến áp suất để phát hiện áp suất trong hệ thống không khí.Áp suất do cảm biến áp suất cảm nhận được áp dụng cho bộ thu thập dữ liệu được kết nối với máy tính xách tay.Điều này cho phép theo dõi liên tục áp suất bên trong buồng khí.Khi đạt đến áp suất buồng tối đa (hệ điều hành tiêu chuẩn 80 mmHg, 140 mmHg), thiết bị thu thập dữ liệu được lệnh gửi tín hiệu đến hệ thống C-PACE-EM để tạo tín hiệu điện áp hai pha trong 2 mili giây, được đặt thành 4 V.
Các phần tim được lấy và điều kiện nuôi cấy trong 6 giếng được thực hiện như sau: Chuyển tim đã thu hoạch từ bình chuyển sang khay chứa liệt cơ tim lạnh (4° C.).Tâm thất trái được tách ra bằng một lưỡi dao vô trùng và cắt thành từng mảnh 1-2 cm3.Các khối mô này được gắn vào các giá đỡ mô bằng chất kết dính mô và được đặt trong bể mô microtome đang rung có chứa dung dịch Tyrode và được cung cấp oxy liên tục (3 g/L 2,3-butanedione monooxime (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g). , 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-glucose (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl 2 (1 ml dung dịch 1 M), CaCl2 1,8 mM (1,8 ml dung dịch 1 M), tối đa 1 L ddH2O).Microtome rung được thiết lập để cắt các lát dày 300 µm ở tần số 80 Hz, biên độ rung ngang là 2 mm và tốc độ trước là 0,03 mm/s.Bể mô được bao quanh bởi nước đá để giữ cho dung dịch mát và nhiệt độ được duy trì ở 4°C.Chuyển các phần mô từ bể microtome sang bể ủ chứa dung dịch Tyrode được oxy hóa liên tục trên đá cho đến khi thu được đủ các phần cho một đĩa nuôi cấy.Đối với nuôi cấy transwell, các phần mô được gắn vào các giá đỡ polyurethane rộng 6 mm vô trùng và được đặt trong 6 ml môi trường tối ưu hóa (môi trường 199, bổ sung 1x ITS, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-kiềm và 2X kháng sinh-kháng nấm).Kích thích điện (10 V, tần số 1,2 Hz) được áp dụng cho các phần mô thông qua C-Pace.Đối với điều kiện TD, T3 và Dex mới được thêm vào ở mức 100 nM và 1 μM ở mỗi lần thay đổi phương tiện.Môi trường được bão hòa oxy trước khi thay thế 3 lần một ngày.Các phần mô được nuôi cấy trong tủ ấm ở 37°C và 5% CO2.
Đối với nuôi cấy CTCM, các phần mô được đặt trên máy in 3D tùy chỉnh trong đĩa Petri chứa dung dịch Tyrode đã biến đổi.Máy được thiết kế để tăng kích thước của lát cắt tim lên 25% diện tích của vòng đỡ.Điều này được thực hiện để các phần của tim không bị căng ra sau khi được chuyển từ dung dịch Tyrode sang môi trường và trong quá trình tâm trương.Sử dụng keo histoacrylic, các phần dày 300 µm được cố định trên một vòng đỡ có đường kính 7 mm.Sau khi gắn các phần mô vào vòng đỡ, hãy cắt bỏ các phần mô thừa và đặt các phần mô đã đính kèm trở lại bể chứa dung dịch Tyrode trên đá (4°C) cho đến khi chuẩn bị đủ các phần cho một thiết bị.Tổng thời gian xử lý cho tất cả các thiết bị không được vượt quá 2 giờ.Sau khi 6 phần mô được gắn vào các vòng đỡ của chúng, thiết bị CTCM đã được lắp ráp.Buồng nuôi cấy CTCM được nạp sẵn 21 ml môi trường oxy hóa trước.Chuyển các phần mô vào buồng nuôi cấy và cẩn thận loại bỏ bọt khí bằng pipet.Sau đó, phần mô được dẫn vào lỗ và ấn nhẹ vào vị trí.Cuối cùng, đậy nắp điện cực lên thiết bị và chuyển thiết bị vào tủ ấm.Sau đó kết nối CTCM với ống khí và hệ thống C-PACE-EM.Bộ truyền động khí nén mở ra và van khí mở CTCM.Hệ thống C-PACE-EM được định cấu hình để cung cấp điện áp 4 V ở tần số 1,2 Hz trong quá trình tạo nhịp hai pha trong 2 mili giây.Môi trường được thay đổi hai lần một ngày và các điện cực được thay đổi mỗi ngày một lần để tránh tích tụ than chì trên các điện cực.Nếu cần thiết, các phần mô có thể được lấy ra khỏi giếng nuôi cấy để loại bỏ bất kỳ bọt khí nào có thể rơi xuống bên dưới chúng.Đối với các điều kiện xử lý MT, T3/Dex được bổ sung mới với mỗi lần thay đổi môi trường với 100 nM T3 và 1 μM Dex.Các thiết bị CTCM được nuôi cấy trong tủ ấm ở 37°C và 5% CO2.
Để thu được quỹ đạo kéo dài của các lát cắt trái tim, một hệ thống camera đặc biệt đã được phát triển.Máy ảnh SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Nhật Bản) đã được sử dụng với ống kính macro Navitar Zoom 7000 18-108mm (Navitar, San Francisco, CA).Hình dung được thực hiện ở nhiệt độ phòng sau khi thay thế môi trường bằng môi trường mới.Máy ảnh được định vị ở góc 51° và video được quay ở 30 khung hình mỗi giây.Đầu tiên, phần mềm mã nguồn mở (MUSCLEMOTION43) được sử dụng với Image-J để định lượng chuyển động của các lát cắt trái tim.Mặt nạ được tạo bằng MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) để xác định các vùng quan tâm để đập các lát trái tim để tránh nhiễu.Mặt nạ được phân đoạn thủ công được áp dụng cho tất cả các hình ảnh trong chuỗi khung hình và sau đó được chuyển đến phần bổ trợ MUSCLEMOTION.Chuyển động cơ bắp sử dụng cường độ trung bình của các pixel trong mỗi khung để định lượng chuyển động của nó so với khung tham chiếu.Dữ liệu được ghi lại, lọc và sử dụng để định lượng thời gian chu kỳ và đánh giá độ căng của mô trong chu kỳ tim.Video đã ghi được xử lý hậu kỳ bằng bộ lọc kỹ thuật số không pha bậc một.Để định lượng độ giãn của mô (từ đỉnh đến đỉnh), phân tích từ đỉnh đến đỉnh được thực hiện để phân biệt giữa các đỉnh và đáy trong tín hiệu được ghi lại.Ngoài ra, việc giảm xu hướng được thực hiện bằng cách sử dụng đa thức bậc 6 để loại bỏ độ lệch tín hiệu.Mã chương trình được phát triển trong MATLAB để xác định chuyển động mô toàn cầu, thời gian chu kỳ, thời gian thư giãn và thời gian co lại (Mã chương trình bổ sung 44).
Để phân tích biến dạng, bằng cách sử dụng cùng một video được tạo để đánh giá độ căng cơ học, trước tiên chúng tôi theo dõi hai hình ảnh biểu thị các đỉnh chuyển động (điểm chuyển động cao nhất (trên) và thấp nhất (dưới)) theo phần mềm MUSCLEMOTION.Sau đó, chúng tôi đã phân đoạn các vùng mô và áp dụng một dạng thuật toán tạo bóng cho mô được phân đoạn (Hình bổ sung 2a).Sau đó, mô được phân đoạn được chia thành mười bề mặt phụ và ứng suất trên mỗi bề mặt được tính theo phương trình sau: Strain = (Sup-Sdown)/Sdown, trong đó Sup và Sdown lần lượt là khoảng cách của hình dạng từ bóng trên và bóng dưới của vải (Hình bổ sung. .2b).
Các phần tim đã được cố định trong 4% paraformaldehyde trong 48 giờ.Các mô cố định được khử nước trong 10% và 20% sucrose trong 1 giờ, sau đó trong 30% sucrose qua đêm.Sau đó, các phần này được nhúng vào hợp chất có nhiệt độ cắt tối ưu (hợp chất OCT) và đông lạnh dần trong bể isopentane/đá khô.Bảo quản các khối nhúng OCT ở -80 °C cho đến khi tách.Các slide được chuẩn bị dưới dạng các phần có độ dày 8 μm.
Để loại bỏ OCT khỏi các phần tim, làm nóng các phiến kính trên khối gia nhiệt ở 95 ° C trong 5 phút.Thêm 1 ml PBS vào mỗi phiến kính và ủ trong 30 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó thấm vào các phần bằng cách đặt 0,1% Triton-X trong PBS trong 15 phút ở nhiệt độ phòng.Để ngăn các kháng thể không đặc hiệu liên kết với mẫu, thêm 1 ml dung dịch BSA 3% vào các phiến kính và ủ trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng.BSA sau đó đã được gỡ bỏ và các slide được rửa bằng PBS.Đánh dấu từng mẫu bằng bút chì.Kháng thể sơ cấp (pha loãng 1:200 trong 1% BSA) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) và troponin-T (Thermo Science; #MA5-12960) được thêm vào trong 90 phút, sau đó kháng thể thứ cấp (pha loãng 1:200 trong 1% BSA) chống lại chuột Alexa Fluor 488 (Thermo Science; #A 16079), chống lại thỏ Alexa Fluor 594 (Thermo Science; #T6391) trong 90 phút nữa. Rửa 3 lần bằng PBS Để phân biệt vết nhuộm mục tiêu với nền, chúng tôi chỉ sử dụng kháng thể thứ cấp làm đối chứng. Cuối cùng, vết nhân DAPI được thêm vào và các phiến kính được đặt trong vectashield (Phòng thí nghiệm Vector) và niêm phong bằng sơn móng tay. Độ phóng đại -x) và kính hiển vi Keyence với độ phóng đại 40 lần.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Science; #W32464) ở mức 5 μg/ml trong PBS đã được sử dụng để nhuộm WGA và áp dụng cho các phần cố định trong 30 phút ở nhiệt độ phòng.Sau đó, các phiến kính được rửa bằng PBS và Sudan đen được thêm vào mỗi phiến kính và ủ trong 30 phút.Các slide sau đó được rửa bằng PBS và phương tiện nhúng vectashield đã được thêm vào.Các slide được hiển thị trên kính hiển vi Keyence ở độ phóng đại 40 lần.
OCT đã bị xóa khỏi các mẫu như mô tả ở trên.Sau khi loại bỏ OCT, nhúng các phiến kính vào dung dịch Bouin qua đêm.Các phiến kính sau đó được rửa sạch bằng nước cất trong 1 giờ và sau đó được đặt trong dung dịch fuchsin axit lô hội Bibrich trong 10 phút.Sau đó, các phiến kính được rửa bằng nước cất và đặt trong dung dịch 5% phosphomolybdenum / 5% axit phosphotungstic trong 10 phút.Không rửa lại, chuyển trực tiếp các phiến kính vào dung dịch xanh anilin trong 15 phút.Sau đó, các phiến kính được rửa bằng nước cất và đặt trong dung dịch axit axetic 1% trong 2 phút.Các phiến kính được làm khô trong etanol 200 N và chuyển sang xylen.Các slide nhuộm màu được hiển thị bằng kính hiển vi Keyence với vật kính 10 lần.Phần trăm diện tích xơ hóa được định lượng bằng phần mềm Keyence Analyzer.
Xét nghiệm khả năng tồn tại của tế bào CyQUANT™ MTT (Invitrogen, Carlsbad, CA), số danh mục V13154, theo giao thức của nhà sản xuất với một số sửa đổi.Cụ thể, một cú đấm phẫu thuật có đường kính 6 mm đã được sử dụng để đảm bảo kích thước mô đồng nhất trong quá trình phân tích MTT.Các mô được mạ riêng vào các giếng của một đĩa 12 giếng chứa chất nền MTT theo giao thức của nhà sản xuất.Các phần này được ủ ở 37° C. trong 3 giờ và mô sống sẽ chuyển hóa chất nền MTT để tạo thành hợp chất formazan màu tím.Thay dung dịch MTT bằng 1 ml DMSO và ủ ở 37°C trong 15 phút để chiết formazan tím từ các lát cắt tim.Các mẫu được pha loãng theo tỷ lệ 1:10 trong DMSO trong các đĩa đáy trong suốt 96 giếng và cường độ màu tím được đo ở bước sóng 570nm bằng đầu đọc đĩa Cytation (BioTek).Các bài đọc đã được chuẩn hóa thành trọng lượng của mỗi lát trái tim.
Môi trường lát cắt trái tim được thay thế bằng môi trường chứa 1 μCi/ml [5-3H]-glucose (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) cho xét nghiệm sử dụng glucose như đã mô tả trước đây.Sau 4 giờ ủ, cho 100 µl môi trường vào ống siêu ly tâm mở có chứa 100 µl HCl 0,2 N.Sau đó, ống này được đặt trong một ống nhấp nháy chứa 500 μl dH2O để làm bay hơi [3H]2O trong 72 giờ ở 37°C.Sau đó lấy ống vi ly tâm ra khỏi ống nhấp nháy và thêm 10 ml chất lỏng nhấp nháy.Số lượng nhấp nháy được thực hiện bằng máy phân tích nhấp nháy chất lỏng Tri-Carb 2900TR (Công ty Khoa học sinh học Packard, Meriden, CT, Hoa Kỳ).Việc sử dụng glucose sau đó được tính toán có tính đến hoạt tính riêng của [5-3H]-glucose, trạng thái cân bằng và nền không đầy đủ, độ pha loãng của [5-3H]-thành glucose không đánh dấu và hiệu quả của bộ đếm nhấp nháy.Dữ liệu được chuẩn hóa thành khối lượng của các phần của trái tim.
Sau khi đồng nhất hóa mô trong Trizol, RNA được phân lập từ các phần tim bằng Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 theo giao thức của nhà sản xuất.Việc chuẩn bị thư viện RNAsec, giải trình tự và phân tích dữ liệu đã được thực hiện như sau:
1 μg RNA trên mỗi mẫu được sử dụng làm nguyên liệu ban đầu để chuẩn bị thư viện RNA.Các thư viện giải trình tự được tạo bằng Bộ công cụ chuẩn bị thư viện NEBNext UltraTM RNA cho Illumina (NEB, Hoa Kỳ) theo khuyến nghị của nhà sản xuất và mã chỉ mục đã được thêm vào trình tự thuộc tính cho từng mẫu.Tóm lại, mRNA đã được tinh chế từ RNA tổng số bằng cách sử dụng các hạt từ tính được gắn với các oligonucleotide poly-T.Quá trình phân mảnh được thực hiện bằng cách sử dụng các cation hóa trị hai ở nhiệt độ cao trong Bộ đệm phản ứng tổng hợp sợi thứ nhất NEBNext (5X).Chuỗi cDNA đầu tiên được tổng hợp bằng cách sử dụng các đoạn mồi hexamer ngẫu nhiên và phiên mã ngược M-MuLV (RNase H-).Chuỗi cDNA thứ hai sau đó được tổng hợp bằng cách sử dụng DNA polymerase I và RNase H. Phần nhô ra còn lại được chuyển thành đầu cùn nhờ hoạt động của exonuclease/polymerase.Sau khi adeny hóa đầu 3′ của đoạn DNA, một Bộ điều hợp NEBNext có cấu trúc vòng kẹp tóc được gắn vào nó để chuẩn bị cho quá trình lai tạo.Để lựa chọn các đoạn cDNA có độ dài ưu tiên 150-200 bp.các đoạn thư viện đã được tinh lọc bằng hệ thống AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, USA).Sau đó, 3 μl USER Enzyme (NEB, Hoa Kỳ) với cDNA được chọn kích thước được nối với bộ chuyển đổi được sử dụng trong 15 phút ở 37°C và sau đó trong 5 phút ở 95°C trước khi PCR.PCR sau đó được thực hiện bằng cách sử dụng Phusion High-Fidelity DNA polymerase, đoạn mồi PCR phổ quát và đoạn mồi Index (X).Cuối cùng, sản phẩm PCR được tinh sạch (hệ thống AMPure XP) và chất lượng thư viện được đánh giá trên hệ thống Agilent Bioanalyzer 2100.Thư viện cDNA sau đó được giải trình tự bằng trình sắp xếp Novaseq.Các tệp hình ảnh thô từ Illumina đã được chuyển đổi thành các lần đọc thô bằng cách sử dụng Gọi cơ sở CASAVA.Dữ liệu thô được lưu trữ trong các tệp định dạng FASTQ(fq) có chứa trình tự đọc và chất lượng cơ sở tương ứng.Chọn HISAT2 để khớp các lần đọc trình tự đã lọc với bộ gen tham chiếu Sscrofa11.1.Nói chung, HISAT2 hỗ trợ các bộ gen có kích thước bất kỳ, bao gồm các bộ gen lớn hơn 4 tỷ cơ sở và các giá trị mặc định được đặt cho hầu hết các tham số.Các lần đọc nối từ dữ liệu RNA Seq có thể được căn chỉnh hiệu quả bằng HISAT2, hệ thống nhanh nhất hiện có, với độ chính xác tương đương hoặc tốt hơn bất kỳ phương pháp nào khác.
Sự phong phú của các bản phiên mã phản ánh trực tiếp mức độ biểu hiện gen.Mức độ biểu hiện gen được đánh giá bằng sự phong phú của các bản phiên mã (số lượng trình tự) liên quan đến bộ gen hoặc exon.Số lần đọc tỷ lệ thuận với mức độ biểu hiện gen, chiều dài gen và độ sâu trình tự.FPKM (các đoạn trên một nghìn cặp cơ sở của bản phiên mã được giải trình tự trên một triệu cặp cơ sở) đã được tính toán và giá trị P của biểu thức vi phân được xác định bằng cách sử dụng gói DESeq2.Sau đó, chúng tôi đã tính tỷ lệ phát hiện sai (FDR) cho từng giá trị P bằng phương pháp Stewamini-Hochberg9 dựa trên hàm R tích hợp sẵn “p.adjust”.
ARN được phân lập từ các phần tim được chuyển đổi thành cDNA ở nồng độ 200 ng/μl bằng cách sử dụng hỗn hợp SuperScript IV Vilo Master của Thermo (Thermo, cat. no. 11756050).RT-PCR định lượng được thực hiện bằng cách sử dụng tấm phản ứng trong suốt 384 giếng của Applied Biosystems Endura Plate Microamp (Thermo, cat. no. 4483319) và chất kết dính quang học microamp (Thermo, cat. no. 4311971).Hỗn hợp phản ứng bao gồm 5 µl Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, cat # 4444557), 0,5 µl Taqman Primer và 3,5 µl H2O được trộn trên mỗi giếng.Các chu kỳ qPCR tiêu chuẩn đã được chạy và các giá trị CT được đo bằng thiết bị PCR thời gian thực Application Biosystems Quantstudio 5 (mô-đun 384 giếng; sản phẩm # A28135).Các đoạn mồi Taqman được mua từ Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1 ), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) Các giá trị CT của tất cả các mẫu đã được chuẩn hóa thành GAPDH gen giữ nhà.
Việc phát hành NT-ProBNP trên phương tiện truyền thông được đánh giá bằng cách sử dụng bộ NT-ProBNP (lợn) (Cat. No. MBS2086979, MyBioSource) theo giao thức của nhà sản xuất.Tóm lại, 250 µl của mỗi mẫu và chất chuẩn được thêm vào mỗi giếng lần lượt.Ngay sau khi thêm mẫu, thêm 50 µl Thuốc thử A vào mỗi giếng.Lắc nhẹ tấm và dán kín bằng keo.Sau đó, các viên nén được ủ ở 37°C trong 1 giờ.Sau đó hút dung dịch và rửa giếng 4 lần với 350 µl dung dịch rửa 1X, ủ dung dịch rửa 1-2 phút mỗi lần.Sau đó thêm 100 µl Thuốc thử xét nghiệm B vào mỗi giếng và bịt kín bằng chất trám khe.Viên nén được lắc nhẹ và ủ ở 37°C trong 30 phút.Hút dung dịch và rửa giếng 5 lần với 350 µl dung dịch rửa 1X.Thêm 90 µl dung dịch cơ chất vào mỗi giếng và đậy kín bản.Ủ đĩa ở 37°C trong 10-20 phút.Thêm 50 µl Stop Solution vào mỗi giếng.Tấm được đo ngay lập tức bằng đầu đọc tấm Cytation (BioTek) được đặt ở bước sóng 450nm.
Phân tích công suất được thực hiện để chọn kích thước nhóm sẽ cung cấp >80% công suất để phát hiện thay đổi tuyệt đối 10% trong thông số với tỷ lệ lỗi Loại I 5%. Phân tích công suất được thực hiện để chọn kích thước nhóm sẽ cung cấp >80% công suất để phát hiện thay đổi tuyệt đối 10% trong thông số với tỷ lệ lỗi Loại I 5%. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности д ля обнаружения 10% абсолютного изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. Phân tích công suất đã được thực hiện để chọn các kích thước nhóm sẽ cung cấp >80% công suất để phát hiện 10% thay đổi tham số tuyệt đối với tỷ lệ lỗi Loại I là 5%.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощно сти для обнаружения 10% абсолютного изменения параметров và 5% частоты ошибок типа I. Phân tích công suất đã được thực hiện để chọn quy mô nhóm sẽ cung cấp >80% công suất để phát hiện 10% thay đổi tham số tuyệt đối và 5% tỷ lệ lỗi loại I.Các phần mô được chọn ngẫu nhiên trước thí nghiệm.Tất cả các phân tích đều bị mù và các mẫu chỉ được giải mã sau khi tất cả dữ liệu đã được phân tích.Phần mềm GraphPad Prism (San Diego, CA) đã được sử dụng để thực hiện tất cả các phân tích thống kê. Đối với tất cả các số liệu thống kê, giá trị p được coi là có ý nghĩa ở các giá trị <0,05. Đối với tất cả các số liệu thống kê, giá trị p được coi là có ý nghĩa ở các giá trị <0,05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Đối với tất cả các số liệu thống kê, giá trị p được coi là có ý nghĩa ở các giá trị <0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Đối với tất cả các số liệu thống kê, giá trị p được coi là có ý nghĩa ở các giá trị <0,05.Bài kiểm tra t của Học sinh hai đuôi được thực hiện trên dữ liệu chỉ với 2 lần so sánh.ANOVA một chiều hoặc hai chiều được sử dụng để xác định tầm quan trọng giữa nhiều nhóm.Khi thực hiện các bài kiểm tra sau đại học, hiệu chỉnh của Tukey đã được áp dụng để giải thích cho nhiều so sánh.Dữ liệu RNAsec có các cân nhắc thống kê đặc biệt khi tính toán FDR và ​​p.adjust như được mô tả trong phần Phương pháp.
Để biết thêm thông tin về thiết kế nghiên cứu, hãy xem bản tóm tắt Báo cáo nghiên cứu tự nhiên được liên kết với bài viết này.