דאנק איר פֿאַר באזוכן Nature.com. דער בלעטערער ווערסיע איר נוצן האט לימיטעד שטיצן פֿאַר CSS. פֿאַר דער בעסטער דערפאַרונג, מיר רעקאָמענדירן אַז איר נוצן אַ דערהייַנטיקט בלעטערער (אָדער קער אַוועק קאַמפּאַטאַבילאַטי מאָדע אין Internet Explorer). אין דער דערווייל, צו ענשור פארבליבן שטיצן, מיר וועלן אַרויסווייַזן די פּלאַץ אָן סטיילז און דזשאַוואַסקריפּט.
מענטש קישקע מאָרפאָגענעסיס יסטאַבלישיז קריפּט-ווילוס פֿעיִקייטן פון 3 ד עפּיטעליאַל מיקראָאַרטשיטעקטורע און ספּיישאַל אָרגאַניזאַציע. די יינציק סטרוקטור איז פארלאנגט צו טייַנען קישקע כאָומאָסטאַסיס דורך פּראַטעקטינג די סטעם צעל נישע אין די בייסאַל קריפּט פון עקסאָגענאָוס מייקראָוביאַל אַנטיגענס און זייער מעטאַבאָליטעס. 3D עפּיטעליאַל סטראַקטשערז איז קריטיש פֿאַר די קאַנסטראַקשאַן פון אין וויטראָ קישקע מאָדעלס. נאָוטאַבלי, די אָרגאַניק מימעטיק קישקע-אויף-אַ-שפּאָן קענען אָנמאַכן ספּאַנטייניאַס 3D מאָרפאָגענעסיס פון די ינטעסטאַנאַל עפּיטעליום מיט ימפּרוווד פיזיאַלאַדזשיקאַל פאַנגקשאַנז און ביאָמעטשאַניקס. עמבעדיד כייבריד שפּאָן. מיר באַשרייַבן דיטיילד מעטהאָדס פֿאַר מיטל פאַבריקיישאַן, קולטור פון קאַקאָ-2 אָדער ינטעסטאַנאַל אָרגאַנאָיד עפּיטעליאַל סעלז אין קאַנווענשאַנאַל סעטטינגס און אויף אַ מיקראָפלוידיק פּלאַטפאָרמע, ינדאַקשאַן פון 3 ד מאָרפאָגענעסיס, און כאַראַקטעריזיישאַן פון געגרינדעט 3 ד עפּיטהעליאַ ניצן קייפל ימידזשינג מאָדאַלאַטיז. טראָ מאָרפאָגענעסיס אופֿן ניצט פיזיאַלאַדזשיקלי באַטייַטיק שערן דרוק און מעטשאַניקאַל באַוועגונג און טוט נישט דאַרפן קאָמפּלעקס צעל ינזשעניעריע אָדער מאַניפּיאַליישאַן, וואָס קען אַוטפּערפאָרם אנדערע יגזיסטינג טעקניקס.
יקספּעראַמאַנץ באַווייַזן אַז ינטעסטאַנאַל עפּיטעליאַל קאַקאָ-2 סעלז קאַלטשערד אין קישקע-אויף-אַ-טשיפּ 1,2,3,4,5 אָדער ביילאַיער מיקראָפלוידיק דעוויסעס 6,7 קענען אַנדערגאָו ספּאַנטייניאַס 3 ד מאָרפאָגענעסיס אין וויטראָ אָן אַ קלאָר פארשטאנד פון די אַנדערלייינג מעקאַניזאַם. טעליאַל מאָרפאָגענעסיס אין וויטראָ, וואָס איז דעמאַנסטרייטיד דורך קאַקאָ-2 און פּאַציענט-דערייווד ינטעסטאַנאַל אָרגאַנוידז.אין דעם לערנען, מיר ספּאַסיפיקלי פאָוקיסט אויף די צעל פּראָדוקציע און קאַנסאַנטריישאַן פאַרשפּרייטונג פון אַ שטאַרק Wnt אַנטאַגאַנאַסט, Dickkopf-1 (DKK-1), אין גוט-אויף-אַ-שפּאָן און מאַדאַפייד מיקראָפלוידיק דעוויסעס מיט טראַנסוועלל ינסערץ, גערופֿן "היבריד טשיפּ". זזאַלד-פֿאַרבונדענע פּראָטעין 1, אָדער סאָגי-1) צו די אויף-שפּאָן קישקע ינכיבאַץ מאָרפאָגענעסיס אָדער דיסראַפּץ די פּרעסטרוקטורעד 3 ד עפּיטעליאַל שיכטע, סאַגדזשעסטינג אַז אַנטאַגאַנאַסץ דרוק בעשאַס קולטור איז פאַראַנטוואָרטלעך פֿאַר ינטעסטאַנאַל מאָרפאָגענעסיס אין וויטראָ. מענט דורך אַקטיוו פלאַשינג (למשל, אין קישקע-אויף-אַ-שפּאָן אָדער כייבריד-אויף-אַ-שפּאָן פּלאַטפאָרמס) אָדער דיפיוזשאַן. באַסאָלאַטעראַל מידיאַ (למשל, פֿון טראַנסוועלל ינסערץ אין גרויס באַסאַלאַטעראַל רעזערוווואַרז אין וועלז).
אין דעם פּראָטאָקאָל, מיר צושטעלן אַ דיטיילד מעטאָד פֿאַר מאַנופאַקטורינג קישקע-אויף-אַ-שפּאָן מיקראָדעוויסעס און טראַנסוועלל-ינסערטאַבאַל כייבריד טשיפּס (סטעפּס 1-5) צו קולטור ינטעסטאַנאַל עפּיטעליאַל סעלז אויף פּאָלידימעטהילסילאָקסאַנע (PDMS)-באזירט פּאָרעז מעמבריינז (סטעפּס 6A, 7A, 8, 9) אָדער פּאַליעסטער מעמבריינז פון 7B, 7B און פּאַליעסטער מעמבריינז (7 ב). עד 3 ד מאָרפאָגענעסיס אין וויטראָ (שריט 10). מיר אויך יידענאַפייד סעליאַלער און מאָלעקולאַר פֿעיִקייטן ינדיקאַטיוו פון געוועב-ספּעציפיש היסטאָגענעסיס און ייכעס-אָפענגיק סעליאַלער דיפערענשייישאַן דורך אַפּלייינג קייפל ימידזשינג מאַדזשאַלאַטיז (סטעפּס 11-24). שאַפונג פון 2 ד מאָנאָלייַערס, און ינטעסטאַנאַל בייאָוקעמאַקאַל און רעפּראָדוקציע פון ​​די ביאָמעטשאַניקאַל מיקראָענוויראָנמענט. אין וויטראָ. צו ינדוסירן 3 ד מאָרפאָגענעסיס פון 2 ד עפּיטעליאַל מאָנאָלייַערס, מיר אַוועקגענומען מאָרפאָגען אַנטאַגאַנאַסץ אין ביידע קולטור פארמען דורך פלאָוינג די מיטל אין די באַסאַלאַטעראַל אָפּטייל פון די קולטור. צו מאָדעל מאָרפאָגען-אָפענגיק עפּיטעליאַל גראָוט, לאַנדזשאַטודאַנאַל באַלעבאָס-מייקראָוביאַם קאָו-קאַלטשערז, פּאַטאַדזשאַן ינפעקציע, ינפלאַמאַטאָרי שאָדן, עפּיטעליאַל שלאַבאַן דיספאַנגקשאַן, און פּראָביאָטיק-באזירט טהעראַפּיעס עקסאַמפּלע.ינפלואַנסיז.
אונדזער פּראָטאָקאָל קען זיין נוציק פֿאַר אַ ברייט קייט פון סייאַנטיס אין יקערדיק (למשל, ינטעסטאַנאַל מיוקאָוסאַל ביאָלאָגי, סטעם צעל ביאָלאָגי, און אַנטוויקלונג ביאָלאָגי) און געווענדט פאָרשונג (למשל, פּרעקליניש מעדיצין טעסטינג, קרענק מאָדעלינג, געוועב ינזשעניעריע און גאַסטראָענטעראָלאָגי) ברייט פּראַל. זיין פארשפרייט צו וילעם וואָס לערנען די דינאַמיק פון צעל סיגנאַלינג בעשאַס ינטעסטאַנאַל אַנטוויקלונג, רידזשענעריישאַן אָדער כאָומאָסטאַסיס. אין אַדישאַן, אונדזער פּראָטאָקאָל איז נוציק פֿאַר ינטעראַגייטינג ינפעקציע אונטער פאַרשידן ינפעקטיאָוס אגענטן אַזאַ ווי נאָראָווירוס 8, שטרענג אַקוטע רעספּעראַטאָרי סינדראָום קאָראָנאַווירוס 2 (סאַרס-קאָוו -2), קלאָסטרידיום דיפפישיל, סאַלמאָנעללאַ טשאָלאָריאַ, סאַלמאָנעללאַ 9.וילעם פון קרענק פּאַטאַלאַדזשי און פּאַטאַדזשענעסיס זענען אויך נוציק. די נוצן פון אַן אויף-שפּאָן קישקע מיקראָפיזיאָלאָגי סיסטעם קען לאָזן לאַנדזשאַטודאַנאַל קאָ-קולטור 10 און דערנאָך אַססעססמענט פון באַלעבאָס פאַרטיידיקונג, ימיון רעספּאָנסעס און פּאַטאַדזשאַן-פֿאַרבונדענע שאָדן פאַרריכטן אין די גאַסטראָוינטעסטאַנאַל (גי) שעטעך 11. יראַטאַבאַל באָוועל סינדראָום קענען זיין סימיאַלייטיד ווען 3 ד ינטעסטאַנאַל עפּיטעליאַל לייַערס זענען צוגעגרייט מיט די פּאַציענט 'ס 3 ד ינטעסטאַנאַל עפּיטעליאַל לייַערס, די חולאתן אַרייַננעמען ווילד אַטראָפי, קריפּט פאַרקירצן, מיוקאָוסאַל שעדיקן, אָדער ימפּערד עפּיטעליאַל באַריער. צעל טייפּס, אַזאַ ווי פּאַציענט פּעריפעראַל בלוט מאָנאָנוקלעאַר סעלז (פּבמקס), צו מאָדעלס מיט 3 ד ינטעסטאַנאַל ווילוס-קריפּט מיקראָאַרטשיקעטשערז.געוועב-ספּעציפיש ימיון סעלז, 5.
זינט 3 ד עפּיטעליאַל מיקראָסטרוקטורע קענען זיין פאַרפעסטיקט און וויזשוואַלייזד אָן די סעקשאַן פּראָצעס, וויוערז ארבעטן אויף ספּיישאַל טראַנסקריפּטאָמיקס און הויך-האַכלאָטע אָדער סופּער-האַכלאָטע ימאַגינג קען זיין אינטערעסירט אין אונדזער מאַפּינג פון די ספּאַטיאָטעמאָראַל דינאַמיק פון גענעס און פּראָטעינס אויף עפּיטעליאַל ניטשיז.ינטערעסעד אין טעכנאָלאָגיע. ענטפער צו מייקראָוביאַל אָדער ימיון סטימיאַליי. דערצו, לאַנדזשאַטודאַנאַל באַלעבאָס-מייקראָוביאַם קראָססטאַלק 10, 14 וואָס קאָואָרדאַנאַט קישקע כאָומאָסטאַסיס קענען זיין געגרינדעט אין די 3 ד ינטעסטאַנאַל מיוקאָוסאַל שיכטע דורך קאָ-קאַלטשערינג פאַרשידן מייקראָוביאַל מינים, מייקראָוביאַל קהילות אָדער פיקאַל מייקראָוביאָטאַ, ספּעציעל אין אַ גובאָטשיפּ.דער צוגאַנג איז דער הויפּט אַטראַקטיוו פֿאַר וילעם וואָס שטודירן מיוקאָוסאַל ימיונאַלאַדזשי, גאַסטראָענטעראָלאָגי, מענטש מיקראָביאָמע, קולטור און קליניש מיקראָביאָלאָגי וואָס זוכן צו האָדעווען פריער אַנקאַלטשערד קישקע מיקראָביאָטאַ אין די לאַבאָראַטאָריע. לאַטעראַל קאַמפּאַרטמאַנץ, דער פּראָטאָקאָל קענען אויך זיין פארשפרייט צו די דעוועלאָפּינג פאַרמאַסוטיקאַל, ביאָמעדיקאַל אָדער הויך-טראַפּוט זיפּונג אָדער וואַלאַדיישאַן פּלאַטפאָרמס פֿאַר די עסנוואַרג אינדוסטריע. ווי אַ דערווייַז-פון-פּרינציפּ, מיר לעצטנס דעמאַנסטרייטיד די פיזאַבילאַטי פון אַ מולטיפּלעקס הויך-טרופּוט מאָרפאָגענעסיס סיסטעם סקאַלאַבלע צו אַ 24-געזונט טעלער אָרגאַנס. די וואַלאַדיישאַן פון אונדזער אין וויטראָ מאָרפאָגענעסיס אופֿן קענען זיין אַקסעלערייטיד און פּאַטענטשאַלי אנגענומען דורך פילע פאָרשונג לאַבאָראַטאָריעס, ינדאַסטרי אָדער רעגירונג און רעגולאַטאָרי יידזשאַנסיז צו פֿאַרשטיין סעליאַלער ריפּראָגראַממינג פון אין וויטראָ קישקע מאָרפאָגענעסיס אויף די טראַנסקריפּטאָמיק מדרגה צו פּרובירן דרוגס אָדער ביאָטהעראַפּיוטיקס. סיס פּראָצעס.
א לימיטעד נומער פון מענטשלעך-באַטייַטיק יקספּערמענאַל מאָדעלס זענען געניצט צו לערנען ינטעסטאַנאַל עפּיטעליאַל מאָרפאָגענעסיס, דער הויפּט רעכט צו דער מאַנגל פון ימפּלאַמענאַבאַל פּראָטאָקאָלס צו ינדוסירן 3D מאָרפאָגענעסיס אין וויטראָ. און רובֿ ימפּאָרטאַנטלי, טאָן ניט פּונקט באַשטימען מענטש אַנטוויקלונג פּראַסעסאַז. די מאָדעלס זענען אויך זייער לימיטעד אין זייער פיייקייט צו זיין טעסטעד אין אַ מאַלטי-וועג סקאַלאַבלע שטייגער. דעריבער, אונדזער פּראָטאָקאָל פֿאַר רידזשענערייטינג 3D געוועב סטראַקטשערז אין וויטראָ אַוטפּערפאָרמז אין וויוואָו כייַע מאָדעלס ווי געזונט ווי אנדערע טראדיציאנעלן סטאַטיק 2D צעל קולטור מאָדעלס. די קריפּט-ווילוס אַקס אין ענטפער צו פאַרשידן מיוקאָוסאַל אָדער ימיון סטימיאַליי. 3 ד עפּיטעליאַל לייַערס קענען צושטעלן אַ פּלאַץ צו לערנען ווי מייקראָוביאַל סעלז קאָנקורירן צו פאָרעם ספּיישאַל ניטשיז און עקאַלאַדזשיקאַל עוואָלוציע אין ענטפער צו באַלעבאָס סיבות (למשל, ינער קעגן ויסווייניקסט מיוקאַס לייַערס, ויסשיידונג פון יגאַ און אַנטימיקראָביאַל פּעפּטיידז צו קענען צו פֿאַרשטיין די אַנטימיקראָביאַל פּעפּטידעס, מאָרטעראַל פּעפּטיידז). טאַ סטראַקטשערז זייַן קהילות און סינערגיסטיקלי טראגט מייקראָוביאַל מעטאַבאָליטעס (למשל, קורץ-קייט פאַטי אַסאַדז) אַז פאָרעם סעליאַלער אָרגאַניזאַציע און סטעם צעל ניטשיז אין די בייסאַל קריפּץ. די פֿעיִקייטן קענען נאָר זיין דעמאַנסטרייטיד ווען 3 ד עפּיטעליאַל לייַערס זענען געגרינדעט אין וויטראָ.
אין אַדישאַן צו אונדזער אופֿן פון קריייטינג 3 ד ינטעסטאַנאַל עפּיטעליאַל סטראַקטשערז, עס זענען עטלעכע אין וויטראָ מעטהאָדס. ינטעסטאַנאַל אָרגאַנאָיד קולטור איז אַ מאָדערן געוועב ינזשעניעריע טעכניק באזירט אויף די קאַלטיוויישאַן פון ינטעסטאַנאַל סטעם סעלז אונטער ספּעציפיש מאָרפאָגען טנאָים23,24,25. סעד אין די אָרגאַנאָיד און, דעריבער, די הקדמה פון לומינאַל קאַמפּאָונאַנץ אַזאַ ווי מייקראָוביאַל סעלז אָדער עקסאָגענאָוס אַנטיגענס איז לימיטעד.אַקסעס צו אָרגאַנאָיד לומאַנז קענען זיין ימפּרוווד ניצן אַ מיקראָינדזשעקטאָר, 26,27, אָבער דעם אופֿן איז ינווייסיוו און אַרבעט-אינטענסיווע און ריקווייערז ספּעשאַלייזד וויסן צו דורכפירן.
אנדערע אַפּראָוטשיז באנוצט דורך עטלעכע פאָרשונג גרופּעס נוצן פּרעסטרוקטורעד 3 ד הידראָגעל סקאַפאַלדז צו נאָכקרימען די קישקע עפּיטעליאַל סטרוקטור דורך קאַלטשערינג אפגעזונדערט מענטש ינטעסטאַנאַל סעלז אויף די געל ייבערפלאַך. גרינדן אַ הויך אַספּעקט פאַרהעלטעניש עפּיטעליאַל סטרוקטור און סטראָמאַ-עפּיטעליאַל קראָסטאַלק דורך אַרייַנגערעכנט סטראָמאַל סעלז אין די סקאַפאַלד. אָבער, די נאַטור פון פּרעסטרוקטורעד סקאַפאַלדז קען פאַרמייַדן די אַרויסווייַזן פון די ספּאַנטייניאַס מאָרפאָגענעטיק פּראָצעס זיך. סקאַפאַלדז אין אַ מיקראָפלוידיק פּלאַטפאָרמע און מוסטערד ינטעסטאַנאַל עפּיטעליאַל סטראַקטשערז ניצן לאַזער-עטטשינג טעקניקס. מויז ינטעסטאַנאַל אָרגאַנוידז נאָכגיין עטשט פּאַטערנז צו פאָרעם ינטעסטאַנאַל טובולאַר סטראַקטשערז, און ינטראַלומינאַל פליסיק לויפן קענען זיין ריקאַפּיטאַלייטיד ניצן אַ מיקראָפלוידיקס מאָדולע. מיניאַטורע קישקע רער מיט ספּאַנטייניאַס מאָרפאָגענעטיק פּראַסעסאַז. טראָץ די קאָמפּלעקס פּראָדוקציע פון ​​פאַרשידענע קישקע סעגמאַנץ אין די רער, דעם מאָדעל אויך פעלן לומינאַל פליסיק לויפן און מעטשאַניקאַל דיפאָרמיישאַן. דערצו, מאָדעל אָפּעראַביליטי קען זיין לימיטעד, ספּעציעל נאָך די ביאָפּרינטינג פּראָצעס איז גאַנץ, פּערטורבינג יקספּערמענאַל טנאָים אָדער צעל-צו-צעל ינטעראַקשאַנז. נאָכקרימען קישקע מאָוטיליטי, אַקסעסאַביליטי פון פרייַ אַפּיקאַל און באַסאַלאַטעראַל קאַמפּאַרטמאַנץ, און שייַעך-שאַפונג פון קאָמפּלעקס בייאַלאַדזשיקאַל מיקראָענוויראָנמענץ פון מאַדזשאַלעראַטי. דערפֿאַר, אונדזער אין וויטראָ 3 ד מאָרפאָגענעסיס פּראָטאָקאָל קען צושטעלן אַ קאַמפּלאַמענטשי צוגאַנג צו באַקומען די טשאַלאַנדזשיז פון יגזיסטינג מעטהאָדס.
אונדזער פּראָטאָקאָל איז גאָר פאָוקיסט אויף 3 ד עפּיטעליאַל מאָרפאָגענעסיס, מיט בלויז עפּיטעליאַל סעלז אין קולטור און קיין אנדערע טייפּס פון אַרומיק סעלז אַזאַ ווי מעסענטשימאַל סעלז, ענדאָטהעליאַל סעלז, און ימיון סעלז. ט-אויף-אַ-שפּאָן און כייבריד-אויף-אַ-שפּאָן אַלאַוז אונדז צו ריקריייט די אַנדזשאַלייטינג 3 ד עפּיטעליאַל שיכטע, נאָך בייאַלאַדזשיקאַל קאַמפּלעקסיטיז אַזאַ ווי עפּיטעליאַל-מעסענטשימאַל ינטעראַקטיאָנס33,34, עקסטראַסעללולאַר מאַטריץ (ECM) דעפּאַזישאַן 35 און, אין אונדזער מאָדעל, קריפּט-ווילוס פֿעיִקייטן וואָס קאַנוויי די סטעם צעל ניטשיז אין די בייסאַל צעל ניטשיז. סענטשים שפּילן אַ שליסל ראָלע אין דער פּראָדוקציע פון ​​עקם פּראָטעינס און רעגולירן פון ינטעסטאַנאַל מאָרפאָגענעסיס אין וויוואָו35,37,38. די אַדישאַן פון מעסענטשימאַל סעלז צו אונדזער מאָדעל ימפּרוווד די מאָרפאָגענעטיק פּראָצעס און צעל אַטאַטשמאַנט עפעקטיווקייַט. קולטור קאַמפּאָונאַנץ וואָס קענען זיין קאָננעקטעד צווישן געוועב מאָדעלס זענען אַ פּרירעקוואַזאַט ווען געוועב מאָדעלס זענען דיזיינד צו באַווייַזן מולטי-אָרגאַן ינטעראַקשאַנז.
די נוצן פון כייבריד טשיפּס איז מער גלייך ווי קישקע-אויף-אַ-שפּאָן ווייַל די מיטל סעטאַפּ איז סימפּלער און די נוצן פון טראַנסוועלל ינסערץ אַלאַוז אַ סקאַלאַבלע קולטור פון קישקע עפּיטהעליום. די אַפּיקאַל זייַט. קלאר, די סטאַטיק פּראָפּערטיעס אין די אַפּיקאַל אָפּטייל ראַרעלי געבן לאַנג-טערמין באַקטיריאַל קאָ-קולטור אין כייבריד טשיפּס. בשעת מיר קענען שטאַרק ינדוסירן 3 ד מאָרפאָגענעסיס אין טראַנסוועלל ינסערץ ווען ניצן כייבריד טשיפּס, די דוחק פון פיזיאַלאַדזשיקלי באַטייַטיק ביאָמעטשאַניקס און אַפּיקאַל פליסיק לויפן קען באַגרענעצן די פיזאַבילאַטי פון פּאָטענציעל היבריד אַפּלאַקיישאַן שפּאָן.
פול-וואָג ריקאַנסטראַקשאַן פון די מענטשלעך קריפּט-ווילוס אַקס אין קישקע-אויף-אַ-שפּאָן און כייבריד-אויף-אַ-שפּאָן קאַלטשערז זענען נישט גאָר געגרינדעט. זינט מאָרפאָגענעסיס הייבט זיך פון אַן עפּיטעליאַל מאָנאָלייַער, 3 ד מיקראָאַרטשיטעקטשערז טאָן ניט דאַווקע צושטעלן מאָרפאַלאַדזשיקאַל ענלעכקייט צו קריפּץ אין וויוואָו. כאָטש העכער אויבערשטן טשאַנאַלז אויף די שפּאָן פירן צו אַ געוואקסן הייך פון די מיקראָענגינעערעד עפּיטהעליום, די מאַקסימום הייך איז נאָך לימיטעד צו ~ 300-400 μm. ~600 μמ41.
פֿון אַן ימאַגינג שטאַנדפּונקט, אין סיטו סופּער-האַכלאָטע ימאַגינג פון 3D מיקראָאַרטשיטעקטשערז קען זיין לימיטעד צו די קישקע אויף אַ שפּאָן, ווייַל די פארלאנגט אַרבעט ווייַטקייט פון די אָביעקטיוו אָביעקטיוו צו די עפּיטעליאַל שיכטע איז אין די סדר פון עטלעכע מילאַמיטערז. צו באַקומען דעם פּראָבלעם, אַ ווייַט אָביעקטיוו קען זיין פארלאנגט. ביי-שיכטע מיקראָפאַבריקאַטיאָן פון די קישקע אויף אַ שפּאָן ינוואַלווז שטענדיק אַדכיזשאַן צווישן יעדער שיכטע, עס איז גאָר טשאַלאַנדזשינג צו עפֿענען אָדער אַראָפּנעמען די אויבערשטער שיכטע צו ונטערזוכן די ייבערפלאַך סטרוקטור פון די עפּיטעליאַל שיכטע.
די הידראָפאָביקאַטי פון פּדמס איז געווען אַ לימיטעד פאַקטאָר אין מיקראָפלויד-באזירט שטודיום וואָס האַנדלען מיט כיידראָפאָביק קליין מאַלאַקיולז, זינט פּדמס קענען ניט ספּאַסיפיקלי אַבזאָרבז אַזאַ כיידראָפאָביק מאַלאַקיולז. אַלטערנאַטיוועס צו פּדמס קענען זיין באַטראַכט מיט אנדערע פּאָלימעריק מאַטעריאַלס. סאָרפּטיאָן פון הידראָפאָביק מאַלאַקיולז.
צום סוף, אונדזער אופֿן איז נישט געזונט קעראַקטערייזד אין טערמינען פון פּראַוויידינג אַ הויך-טראַפּוט זיפּונג אָדער "איינער-גרייס-פיץ-אַלע" באַניצער-פרייַנדלעך יקספּערמענאַל פּלאַטפאָרמע. דער קראַנט פּראָטאָקאָל ריקווייערז אַ שפּריץ פּאָמפּע פּער מיקראָדעוויסע, וואָס נעמט פּלאַץ אין אַ CO2 ינגקיאַבייטער און פּריווענץ גרויס-וואָג יקספּעראַמאַנץ. ינסערץ וואָס לאָזן קעסיידערדיק ריפּלענישמאַנט און באַזייַטיקונג פון בייסאַלאַטעראַל מידיאַ).
צו ינדוסירן 3 ד מאָרפאָגענעסיס פון מענטש ינטעסטאַנאַל עפּיטהעליום אין וויטראָ, מיר געוויינט אַ מיקראָפלוידיק שפּאָן ינטעסטאַנאַל מיטל מיט צוויי פּאַראַלעל מיקראָטשאַננעלס און אַ גומע פּאָרעז מעמבראַנע אין צווישן צו שאַפֿן אַ לומען-קאַפּיללאַרי צובינד. ביידע פּלאַטפאָרמס, מאָרפאָגענעסיס פון פאַרשידן מענטש ינטעסטאַנאַל עפּיטעליאַל סעלז קענען זיין דעמאַנסטרייטיד דורך אַפּלייינג דירעקטעד מאַניפּיאַליישאַן פון לויפן צו באַזייַטיקן מאָרפאָגען אַנטאַגאַנאַסץ פון די באַסאַלאַטעראַל אָפּטייל. קאַקאָ-2 סעלז) אָדער מענטש ינטעסטאַנאַל אָרגאַנוידז;באָקסעס 2-5), (iii) קולטור פון ינטעסטאַנאַל עפּיטעליאַל סעלז אויף ינטעסטאַנאַל טשיפּס אָדער כייבריד טשיפּס (סטעפּס 6-9), (יוו) ינדאַקשאַן פון 3D מאָרפאָגענעסיס אין וויטראָ (שריט 10) און (v)) צו קעראַקטערייז די 3D עפּיטעליאַל מיקראָסטרוקטור (סטעפּס 11-24). דורך קאַמפּערינג עפּיטעליאַל מאָרפאָגענעסיס צו ספּיישאַל, טעמפּעראַל, קאַנדישאַנאַל אָדער פּראַסידזשעראַל קאָנטראָלס.
מיר האָבן גענוצט צוויי פאַרשידענע קולטור פּלאַטפאָרמס: קישקע-אויף-אַ-שפּאָן מיט גלייך טשאַנאַלז אָדער ניט-לינעאַר קאַנוואַלוטאַד טשאַנאַלז, אָדער כייבריד טשיפּס מיט טראַנסוועלל (TW) ינסערץ אין אַ מיקראָפלוידיק מיטל, פאַבריקייטיד ווי דיסקרייבד אין באָקס 1, און שריט 1 -5. ינטעסטאַנאַל אָרגאַנאָידס) און קולטור פּראָוסידזשערז געניצט אין דעם פּראָטאָקאָל. "אין וויטראָ מאָרפאָגענעסיס" ווייַזן די קוילעלדיק סטעפּס אין וואָס קאַקאָ-2 אָדער אָרגאַנאָיד-דערייווד עפּיטעליאַל סעלז זענען קאַלטשערד אויף אַ ינטעסטאַנאַל שפּאָן אָדער אויף טראַנסוועלל ינסערץ פון אַ כייבריד שפּאָן, נאכגעגאנגען דורך ינדאַקשאַן פון 3 ד מאָרפאָגענעסיס און די פאָרמירונג פון אַ קעראַקטערייזד עפּיטעליאַל נומער פון די עפּידעליאַל נומער איז געוויזן אונטן. סטינאַל עפּיטעליאַל לייַערס קענען ווערן גענוצט, פֿאַר בייַשפּיל, אין צעל דיפערענשייישאַן קעראַקטעריסטיקס, קישקע פיזיאַלאַדזשי שטודיום, פאַרלייגן פון באַלעבאָס-מייקראָוביאַם יקאָוסיסטאַמז, און קרענק מאָדעלינג. פלורעסאַנט בילדער אין גוט פיסיאָלאָגי ווייַזן מיוקאַס געשאפן דורך סטיינינג פֿאַר סיאַליק זויער און N-אַסעטילגלוקאָסאַמינע רעזאַדוז ניצן פלורעסאַנט ווייץ גערמע אַגגלוטינין. פלורעסאַנט פּראָטעין (גפפּ) מיט מיקראָ-ענדזשאַנירד 3 ד קאַקאָ-2 עפּיטעליאַל סעלז. די רעכט טאַפליע ווייזט די לאָוקאַלאַזיישאַן פון GFP E. קאָלי קאָו-קאַלטשערד מיט 3 ד קאַקאָ-2 עפּיטעליאַל סעלז, נאכגעגאנגען דורך ימיונאָפלואָרעססענסע סטיינינג מיט F-אַקטין (רויט) און נוקליי (בלוי גולעאַס) יללוסטראַטיאָן אין געזונט-באַקטיריאַל טשיפּס מיט אַנטיבאַקטיריאַל טשיפּס. גענס (למשל, ליפּאָפּאָליסאַקשאַרידע, לפּס) און ימיון סעלז (למשל, פּבמק;גרין). קאַקאָ-2 סעלז זענען קאַלטשערד צו פאַרלייגן אַ 3 ד עפּיטעליאַל שיכטע. סקאַלע באַר, 50 μמ. בילדער אין דנאָ רודערן: "דיפפערענטשייישאַן פון סעלז" צוגעפאסט מיט דערלויבעניש פון רעפֿערענץ.2.אָקספֿאָרד אוניווערסיטעט פרעסע;רעפּראָדוצירט מיט דערלויבעניש פון רעפ.5.NAS;"האָסט-מיקראָבע קאָ-קולטור" צוגעפאסט מיט דערלויבעניש פון רעפ.3.NAS;"דיסעאַסע מאָדעלינג" צוגעפאסט מיט דערלויבעניש פון רעפֿערענץ.5.NAS.
ביידע קישקע-אויף-שפּאָן און כייבריד טשיפּס זענען פאַבריקייטיד מיט PDMS רעפּלאַקאַז וואָס זענען דעמאָולדיד פון סיליציום מאָולדז דורך ווייך ליטהאָגראַפי 1,44 און מוסטערד מיט SU-8. גלייַך מיקראָטשאַננעלס, האט יוואַלווד אין אַ קאָמפּלעקס קישקע-אויף-אַ-שפּאָן (עקסטענדעד דאַטאַ פייג. 1ב) וואָס כולל אַ פּאָר פון קערווד מיקראָטשאַנאַלז צו ינדוסירן ינקרעאַסעד פליסיק וווינאָרט צייט, ניט-לינעאַר לויפן פּאַטערנז, און מולטיאַקסיאַל דיפאָרמיישאַן פון געבילדעטער סעלז (Fig. 2a-f) גו 12. מיר האָבן דעמאַנסטרייטיד אַז די קאַנוואַלוטאַד גוט-טשיפּ אויך שטארק ינדוסיז 3 ד מאָרפאָגענעסיס אין אַ ענלעך צייט ראַם מיט אַ ענלעך גראַד פון עפּיטעליאַל וווּקס קאַמפּערד צו די אָריגינעל גוט-טשיפּ, ראַגאַרדלאַס פון די געבילדעטער צעל טיפּ. נאָך דעמאָולדינג (Fig.צו פּראָדוצירן די קישקע אויף אַ שפּאָן, די צוגעגרייט אויבערשטער פּדמס שיכטע איז סאַקווענטשאַלי געבונדן צו אַ פּאָרעז פּדמס פילם און דאַן אַליינד מיט די נידעריקער פּדמס שיכטע דורך יריווערסאַבאַל באַנדינג ניצן אַ קאָראָנאַ טרעאַטער (Fig. 2b-f). 2ה און עקסטענדעד דאַטאַ פיג. 2). די באַנדינג פּראָצעס איז דורכגעקאָכט דורך טרעאַטינג די סערפאַסיז פון די פּדמס רעפּליקע און גלאז מיט זויערשטאָף פּלאַזמע אָדער קאָראָנאַ באַהאַנדלונג. נאָך סטעראַליזיישאַן פון די מיקראָפאַבריקייטיד מיטל אַטאַטשט צו די סיליקאָנע רער, די מיטל סעטאַפּ איז גרייט צו דורכפירן 3 ד מאָרפאָגענעסיס פון די ינטעסטאַנאַל עפּיטהעליום (פיגורע 2).
אַ, סכעמאַטיש אילוסטראציע פון ​​דער צוגרייטונג פון פּדמס פּאַרץ פון SU-8 מוסטערד סיליציום מאָולדז. די אַנקיערד פּדמס לייזונג איז אויסגעגאסן אויף אַ סיליציום פורעם (לינקס), געהיילט ביי 60 °C (מיטן) און דעמאָולדיד (רעכט). פורעם געניצט צו פּראָדוצירן די PDMS פּאָרעז מעמבראַנע.ד, א סעריע פון ​​פאָוטאַגראַפס פון די אויבערשטער און נידעריקער PDMS קאַמפּאָונאַנץ און די אַסעמבאַל אויף-שפּאָן ינטעסטאַנאַל מיטל.e, סכעמאַטיש פון די אַליינמאַנט פון די אויבערשטער, מעמבראַנע, און נידעריקער PDMS קאַמפּאָונאַנץ.יעדער שיכטע איז ירעווערסאַבלי געבונדן דורך פּלאַזמע אָדער קאָראָנאַ באַהאַנדלונג. אום chambers.g, סעטאַפּ פון קישקע-אויף-אַ-שפּאָן פֿאַר מיקראָפלוידיק צעל קולטור. די פאַבריקייטיד קישקע אויף אַ שפּאָן פארזאמלט מיט אַ סיליקאָנע רער און שפּריץ איז געשטעלט אויף אַ קאָווערסליפּ. די שפּאָן מיטל איז געשטעלט אויף די דעקל פון אַ 150 מם פּעטרי שיסל פֿאַר פּראַסעסינג. ערץ צוגעגרייט ינדיפּענדאַנטלי צו קולטור 2 ד מאָנאָלייַערס פון ינטעסטאַנאַל עפּיטעליאַל סעלז זענען ינסערטאַד אין די כייבריד שפּאָן צו ינדוסירן ינטעסטאַנאַל 3 ד מאָרפאָגענעסיס. די מיטל איז פּערפיוזד דורך מיקראָטשאַננעלס אונטער די צעל שיכטע געגרינדעט אויף די טראַנסוועלל ינסערט.סקאַלע באַר, 1 סענטימעטער.ה ריפּרינטעד מיט דערלויבעניש פון דערמאָנען.4.Elsevier.
אין דעם פּראָטאָקאָל, די קאַקאָ-2 צעל ליניע און ינטעסטאַנאַל אָרגאַנוידז זענען געניצט ווי עפּיטעליאַל קוואלן (פיגורע 3 אַ). ען פּאַסידזשיז 10 און 50) אין ט-פלאַסקס זענען כאַרוואַסטיד צו צוגרייטן דיססאָסיאַטעד צעל סאַספּענשאַנז דורך טריפּסיניזאַטיאָן פליסיק (קעסטל 2). סיבות צוגעגרייט ווי דיסקרייבד אין באָקס 3 איז געווען סאַפּלאַמענטאַד יעדער אנדערער טאָג ביז די אָרגאַנאָידס געוואקסן צו ~ 500 μם אין דיאַמעטער. גאָר דערוואַקסן אָרגאַנוידז זענען כאַרוואַסטיד און דיססאָסיאַטעד אין איין סעלז פֿאַר סעדינג אַנטו קישקע אָדער טראַנסוועלל ינסערץ אויף אַ שפּאָן (באָקס 5). ), ליזשאַן פּלאַץ (למשל, ליזשאַן קעגן ניט-לעסיאָנעד געגנט) און גאַסטראָוינטעסטאַנאַל אָרט אין די שעטעך (למשל, דואַדענום, דזשעדזשונום, יללום, סעקום, צווייפּינטל, אָדער רעקטום).
אַ, וואָרקפלאָוו פֿאַר די ינדאַקשאַן פון קישקע מאָרפאָגענעסיס אין די קישקע שפּאָן. קאַקאָ-2 מענטש ינטעסטאַנאַל עפּיטהעליום און ינטעסטאַנאַל אָרגאַנוידז זענען געניצט אין דעם פּראָטאָקאָל צו באַווייַזן 3 ד מאָרפאָגענעסיס. 0 (ד0), אַפּיקאַל (אַפּ) לויפן איז ינישיייטיד און מיינטיינד פֿאַר די ערשטער 2 טעג (לויפן, אַפּ, ד0-ד2). באַסאָלאַטעראַל (בל) לויפן איז אויך ינישיייטיד צוזאמען מיט סייקליק סטרעטשינג מאָושאַנז (אויסשטרעקן, לויפן, אַפּ און בל) ווען אַ גאַנץ 2 ד מאָנאָלייַער איז געשאפן. קאַנטראַסט בילדער ווייַזן רעפּריזענאַטיוו מאָרפאָלאָגי פון קאַקאָ-2 סעלז אין יעדער יקספּערמענאַל שריט אָדער צייט פונט (באַר גראַפיקס, 100 μm). דאַשט קעסטל) ווייזט די רידזשענערייטיד מיקראָוויללי אויף די 3 ד קאַקאָ-2 שיכטע (רעכט). c, האָריזאָנטאַל פראָנטאַל מיינונג פון געגרינדעט קאַקאָ-2 3 ד, קלאַודין (זאָ-1, רויט) און קעסיידערדיק באַרשט גרענעץ מעמבריינז מיטן נאָמען F-אַקטין (גרין) און נוקליי (בלוי) יממונאָפלורעסענסע קאַנפאָקאַל טשיפּס אויף די מיטל פונט פון די ינטעסטאַנאַל טשיפּס אין די מיטל פונט פון די עפּיסטשעמאַ צו ווייַזן. פאָקאַל פלאַך פֿאַר יעדער קאָנפאָקאַל וויו.ד, צייט לויף פון מאָרפאַלאַדזשיקאַל ענדערונגען אין אָרגאַנאָידס קאַלטשערד אויף אַ שפּאָן באקומען דורך פאַסע קאַנטראַסט מיקראָסקאָפּי אויף טעג 3, 7, 9, 11 און 13. די ינסעט (אויבן רעכט) ווייזט די הויך מאַגנאַפאַקיישאַן פון די צוגעשטעלט בילד. סטעם סעלז (LGR5;מאַגענטאַ), בעגל סעלז (MUC2; גרין), F-אַקטין (גרוי) און נוקליי (סיאַן) דערוואַקסן אויף קישקע טשיפּס פֿאַר 3 טעג, ריספּעקטיוולי (לינקס) און 13-טאָג (מיטן) אָרגאַנוידז אויף די עפּיטעליאַל שיכטע. אָרגאַנאָיד עפּיטהעליום געגרינדעט אין די קישקע אויף אַ שפּאָן דורך סטיינינג די פּלאַזמע מעמבראַנע מיט סעללמאַסק פאַרב (רעכט) אויף טאָג 13 פון קולטור. די וואָג באַר איז 50 μם סייַדן אַנדערש סטייטיד. ב ריפּרינטעד מיט דערלויבעניש פון דערמאָנען.2.אָקספֿאָרד אוניווערסיטעט פרעסע;c אַדאַפּטיד מיט דערלויבעניש פון רעפערענסע.2.אָקספֿאָרד אוניווערסיטעט פרעסע;E און F צוגעפאסט מיט דערלויבעניש דורך דערמאָנען.12 אונטער Creative Commons License CC BY 4.0.
אין די קישקע אויף אַ שפּאָן, עס איז נייטיק צו מאָדיפיצירן די הידראָפאָביק ייבערפלאַך פון די PDMS פּאָרעז מעמבראַנע פֿאַר מצליח ECM קאָוטינג. אין דעם פּראָטאָקאָל, מיר צולייגן צוויי פאַרשידענע מעטהאָדס צו מאָדיפיצירן די כיידראָופאָוביקייט פון PDMS מעמבריינז. אָבער, מיקראָפלוידיק קולטור פון אָרגאַנאָיד עפּיטהעליום ריקווייערז כעמישער-באזירט ייבערפלאַך פאַנגקשאַנאַליזיישאַן צו דערגרייכן עפעקטיוו דעפּאַזישאַן פון עקם פּראָטעינס דורך סאַקווענטשאַלי אַפּלייינג פּאָליעטהילענעימינע (פּיי) און גלוטאַראַלדעהידע צו פּדמס מיקראָטשאַננעלס. ידיק צעל קולטור סטאַרץ דורך פּערפיוזינג בלויז די מיטל אין דער אויבערשטער מיקראָטשאַננעל ביז די סעלז פאָרעם אַ גאַנץ מאָנאָלייַער, בשעת דער נידעריקער מיקראָטשאַננעל מיינטיינז סטאַטיק טנאָים. דעם אָפּטימיזעד אופֿן פֿאַר ייבערפלאַך אַקטאַוויישאַן און ECM קאָוטינג ינייבאַלז די אַטאַטשמאַנט פון אָרגאַנאָיד עפּיטהעליום צו ינדוסירן 3 ד מאָרפאָגענעסיס אויף די פּדמס ייבערפלאַך.
טראַנסוועלל קאַלטשערז אויך דאַרפן ECM קאָוטינג איידער צעל סעדינג;אָבער, טראַנסוועל קאַלטשערז טאָן ניט דאַרפן קאָמפּלעקס פּרעטרעאַטמענט סטעפּס צו אַקטאַווייט די ייבערפלאַך פון פּאָרעז ינסערץ. פֿאַר גראָוינג קאַקאָ-2 סעלז אויף טראַנסוועלל ינסערץ, ECM קאָוטינג אויף פּאָרעז ינסערץ אַקסעלערייץ די אַטאַטשמאַנט פון דיססאָסיאַטעד קאַקאָ-2 סעלז (<1 שעה) און ענג קנופּ שלאַבאַן פאָרמירונג (<1-2 טעג אויף טראַנסטאָוועלל סעאָלעד אָרגאַנאָידס, קולטורעד אָרגאַנאָידס און טראַנסטאָוועלל סעיסאָלעד אָרגאַנאָידס). קאָוטאַד ינסערץ, אַטאַטשט צו די מעמבראַנע ייבערפלאַך (<3 ה) און מיינטיינד ביז די אָרגאַנאָידס פאָרעם אַ גאַנץ מאָנאָלייַער מיט שלאַבאַן אָרנטלעכקייַט. טראַנסוועל קאַלטשערז זענען געטאן אין 24-געזונט פּלאַטעס אָן די נוצן פון כייבריד טשיפּס.
אין וויטראָ 3 ד מאָרפאָגענעסיס קענען זיין ינישיייטיד דורך אַפּלייינג פליסיק לויפן צו די באַסאַלאַטעראַל אַספּעקט פון אַ געגרינדעט עפּיטעליאַל שיכטע. אין די קישקע אויף אַ שפּאָן, עפּיטעליאַל מאָרפאָגענעסיס אנגעהויבן ווען די מיטל איז געווען פּערפיוזד אין די אויבערשטער און נידעריקער מיקראָטשאַננעלס (פיגורע 3 אַ). צו צושטעלן גענוג נוטריאַנץ און סערום צו סעלז געבונדן אויף פּאָרעז מעמבריינז און דזשענערייט לומינאַל שערן דרוק, מיר טיפּיקלי אָנווענדן צווייענדיק לויפן אין די קישקע אויף אַ שפּאָן. אין כייבריד טשיפּס, טראַנסוועלל ינסערץ מיט עפּיטעליאַל מאָנאָלייַערס זענען ינסערטאַד אין די כייבריד טשיפּס. דערנאָך, די מיטל איז געווען געווענדט אונטער די באַסאַלאַטעראַל זייַט פון די פּאָרעז טראַנסוועלל איניציאטיוו. באַסאַלאַטעראַל לויפן אין ביידע קולטור פּלאַטפאָרמס.
די מאָרפאָלאָגיקאַל פֿעיִקייטן פון מיקראָ-ענדזשאַנירד 3 ד עפּיטעליאַל לייַערס קענען זיין אַנאַלייזד דורך אַפּלייינג פאַרשידן ימאַגינג מאַדזשאַלאַטיז, אַרייַנגערעכנט פאַסע קאַנטראַסט מיקראָסקאָפּי, דיפערענטשאַל ינטערפיראַנס קאַנטראַסט (DIC) מיקראָסקאָפּי, SEM, אָדער יממונאָפלורעסענסע קאַנפאָקאַל מיקראָסקאָפּי (פיגורעס 3 און 4). אָפּטיש דורכזעיקייַט פון PDMS און פּאַליעסטער פילמס, ביידע די קישקע-אויף-אַ-שפּאָן און כייבריד שפּאָן פּלאַטפאָרמס קענען צושטעלן פאַקטיש-צייט אין סיטו ימאַגינג אָן די נויט פֿאַר סעקשאַן אָדער דיסאַססעמבלי פון די מיטל. % (wt/vol) ) באָווין סערום אַלבומין (BSA), אין סדר. דעפּענדינג אויף די צעל טיפּ, פאַרשידענע פיקסאַטיווז, פּערמעאַביליזערז, און בלאַקינג אגענטן קענען זיין געוויינט. ערשטיק אַנטיבאָדיעס טאַרגאַטינג ייכעס-אָפענגיק צעל אָדער געגנט מאַרקערס זענען געניצט צו הויכפּונקט סעלז ימאָובאַלייזד אין סיטו אויף די שפּאָן, נאכגעגאנגען דורך צווייטיק אַנטיבאָדיעס צוזאמען מיט אַ, ′ טאָמבאַנק דיעוס (ע.ג. 2-פענילענע) ינדאָלע, דאַפּי) אָדער F-אַקטין (למשל, פלורעסאַנטלי מיטן נאָמען פאַללאָידין). פלואָרעססענסע-באזירט לעבן ימאַגינג קענען אויך זיין געטאן אין סיטו צו דעטעקט מיוקאַס פּראָדוקציע (Fig.1, "צעל דיפערענשייישאַן" און "גוט פיזיאַלאַדזשי"), טראַפ - קאַלאַניזיישאַן פון מייקראָוביאַל סעלז (Fig. 1, "האָסט-מיקראָב קאָ-קולטור"), די ראַקרוטמאַנט פון ימיון סעלז (Fig. 1, 'דיסעאַסע מאָדעלינג') אָדער די קאַנטורז פון 3 ד עפּיטעליאַל מאָרפאָלאָגי (Fig. דער אויבערשטער שיכטע פון ​​דער נידעריקער מיקראָטשאַננעל שיכטע, ווי דיסקרייבד אין פיג. טשיפּס אָדער כייבריד טשיפּס זענען כאַרוואַסטיד דורך טריפּסיניזאַטיאָן און דערנאָך געניצט פֿאַר מאָלעקולאַר אָדער גענעטיק אַנאַליסיס.
אַ, וואָרקפלאָוו פֿאַר די ינדאַקשאַן פון ינטעסטאַנאַל מאָרפאָגענעסיס אין אַ כייבריד שפּאָן. קאַקאָ-2 און ינטעסטאַנאַל אָרגאַנוידז זענען געניצט אין דעם פּראָטאָקאָל צו באַווייַזן 3 ד מאָרפאָגענעסיס אין אַ כייבריד שפּאָן פּלאַטפאָרמע. אונטער סטאַטיק טנאָים (טוו קולטור). נאָך 7 טעג, אַ איין טראַנסוועלל אַרייַנלייגן מיט אַ 2 ד מאָנאָלייַער פון עפּיטעליאַל סעלז איז ינאַגרייטיד אין אַ כייבריד שפּאָן צו באַקענען אַ באַסאַלאַטעראַל לויפן (פלאָוו, בל), וואָס לעסאָף געפֿירט צו די דור פון אַ 3 ד עפּיטעליאַל שיכטע (מאָרפאָגענעסיס). אויף אין יעדער יקספּערמענאַל שריט אָדער צייַט פונט. די סטשעמאַטיקס אין דער אויבערשטער לייַערס אילוסטרירן די יקספּערמענאַל קאַנפיגיעריישאַן פֿאַר יעדער סטעפּ.ב, היבריד טשיפּס (לינקס סכעמאַטיש) קענען פירן צו 3 ד מאָרפאָגענעסיס פון אָרגאַנויד עפּיטעליאַל סעלז מיט שפּיץ-אַראָפּ קאָנפאָקאַל מיקראָסקאָפּי קוקן גענומען אין פאַרשידענע ז שטעלעס (אויבערשטער, מיטל און נידעריקער;זען רעכט סכעמאַטיש און קאָראַספּאַנדינג דאַטיד שורות).געוויזן קלאָר ווי דער טאָג מאָרפאַלאַדזשיקאַל קעראַקטעריסטיקס.F-אַקטין (ציאַן), קערן (גרוי). C, פלואָרעססענסע קאָנפאָקאַל מיקראָגראַפס (3 ד אַנגגאַלד מיינונג) פון אָרגאַנויד-דערייווד עפּיטעליאַל סעלז געבילדעטער אין סטאַטיק טראַנסוועלל (טוו; ינסעט ין ווייַס דאַשט קעסטל) קעגן כייבריד שפּאָן (גרעסטן פול שאָס) קאַמפּערד מיט 32 ד ווערטיקאַל קוקן מיט 32 ד מאָרפאָלאָגי. (ינסעט אין דער אויבערשטער רעכט ווינקל; "קסז") אויך ווייַזן 2 ד און 3 ד פֿעיִקייטן. וואָג באַר, 100 μm.c ריפּרינטעד מיט דערלויבעניש פון רעפֿערענץ.4.Elsevier.
קאָנטראָלס קענען זיין צוגעגרייט דורך קאַלטשערינג די זעלבע סעלז (קאַקאָ-2 אָדער ינטעסטאַנאַל אָרגאַנאָיד עפּיטעליאַל סעלז) אין צוויי-דימענשאַנאַל מאָנאָלייַערס אונטער קאַנווענשאַנאַל סטאַטיק קולטור טנאָים. נאָוטאַבלי, נוטריאַנט דיפּלישאַן קען רעזולטאַט רעכט צו דער לימיטעד באַנד קאַפּאַציטעט פון די מיקראָטשאַנאַלז (ד"ה ~ 4 μ ל אין די שפּיץ קאַנאַל אויף דער אָריגינעל קישקע שפּאָן אַפּלאַקיישאַן, איידער די עפּילאַטעראַל עפּילאַטעראַל אַפּלאַקיישאַן קענען זיין קאַמפּערד). .
די ווייך ליטהאָגראַפי פּראָצעס זאָל זיין דורכגעקאָכט אין אַ ריין צימער. פֿאַר יעדער שיכטע אויף די שפּאָן (אויבערשטער און נידעריקער לייַערס און מעמבריינז) און כייבריד טשיפּס, פאַרשידענע פאָטאָמאַסקס זענען געניצט און פאַבריקייטיד אויף באַזונדער סיליציום ווייפערז ווייַל די כייץ פון די מיקראָטשאַנאַלז זענען אַנדערש. איז 200 μm.
שטעלן אַ 3-אינטש סיליציום ווייפער אין אַ שיסל מיט אַסאַטאָון. דזשענטלי סווערל די טעלער פֿאַר 30 סעקונדעס, דעמאָלט לופט טרוקן די ווייפער. אַריבערפירן די ווייפער צו אַ טעלער מיט יפּאַ, דעמאָלט ומדריי די טעלער פֿאַר 30 ס צו ריין.
א פּיראַנהאַ לייזונג (געמיש פון הידראָגען פּעראַקסייד און קאַנסאַנטרייטאַד סאַלפיוריק זויער, 1: 3 (וואָל / וואָל)) קענען אָפּטיאָנאַללי ווערן געניצט צו מאַקסאַמייז די באַזייַטיקונג פון אָרגאַניק רעזאַדוז פון די סיליציום ווייפער ייבערפלאַך.
פּיראַנהאַ לייזונג איז גאָר קעראָוסיוו און דזשענערייץ היץ. נאָך זיכערקייַט פּריקאָשאַנז זענען נייטיק. פֿאַר וויסט באַזייַטיקונג, לאָזן די לייזונג צו קילן און אַריבערפירן צו אַ ריין, טרוקן וויסט קאַנטיינער. ניצן צווייטיק קאַנטיינערז און רעכט פירמע וויסט קאַנטיינערז. ביטע נאָכגיין די זיכערקייַט גיידליינז פֿאַר מער דיטיילד פּראָוסידזשערז
דעהידראַטע די ווייפערז דורך פּלייסינג זיי אויף אַ 200 °C הייס טעלער פֿאַר 10 מין.נאָך דיכיידריישאַן, די ווייפער איז געווען שאַקינג פינף מאל אין לופט צו קילן.
גיסן ~10 ג פון פאָטאָרעסיסט SU-8 2100 אַנטו די צענטער פון די קלינד סיליציום ווייפער. ניצן פּינצעט צו פאַרשפּרייטן די פאָטאָרעסיסט יוואַנלי אויף די ווייפער. טייל מאָל שטעלן די ווייפער אויף אַ 65 ° C הייס טעלער צו מאַכן די פאָטאָרעסיסט ווייניקער קלעפּיק און גרינגער צו פאַרשפּרייטן. דו זאלסט נישט שטעלן די ווייפער גלייַך אויף די הייס טעלער.
SU-8 איז יוואַנלי פונאנדערגעטיילט אויף די ווייפער דורך פליסנדיק ומדריי קאָוטינג. פּראָגראַם אַן ינקאַמינג ראָוטיישאַן פון די SU-8 פֿאַר 5-10 s צו פאַרמערן ביי 500 רפּם ביי אַ אַקסעלעריישאַן פון 100 רפּם / s. דער אויבערשטער שיכטע פון ​​די קישקע אויף די שפּאָן; זען "קריטיש סטעפּס" אונטן) שטעלן אַ אַקסעלעריישאַן פון 300 רפּם / s 30 סעקונדעס ביי 1,200 רפּם.
די הויפּט ספּין גיכקייַט קענען זיין אַדזשאַסטיד לויט די ציל גרעב פון די SU-8 מוסטער אויף די סיליציום ווייפער.
צו פּראָדוצירן SU-8 פּאַטערנז פון 500 μm הייך פֿאַר די אויבערשטער שיכטע פון ​​די קישקע אויף די שפּאָן, די ספּין קאָוטינג און ווייך באַקן סטעפּס פון דעם באָקס (סטעפּס 7 און 8) זענען סאַקווענטשאַלי ריפּיטיד (זען שריט 9) צו פּראָדוצירן צוויי לייַערס פון 250 μm. עם הויך.
ווייך באַקן די SU-8 קאָוטאַד ווייפערז דורך קערפאַלי פּלייסינג די ווייפערז אויף אַ הייס טעלער בייַ 65 ° C פֿאַר 5 מינוט, דעמאָלט באַשטימען די באַשטעטיקן צו 95 ° C און ינקובייט פֿאַר נאָך 40 מינוט.
צו דערגרייכן אַ 500 μm הייך פון די SU-8 מוסטער אין דער אויבערשטער מיקראָטשאַננעל, איבערחזרן סטעפּס 7 און 8 צו דזשענערייט צוויי 250 μm דיק SU-8 לייַערס.
ניצן די UV Mask Aligner, דורכפירן אַ לאָמפּ פּרובירן לויט צו דער פאַבריקאַנט ס ינסטראַקשאַנז צו רעכענען די ויסשטעלן צייט פון די ווייפער.
נאָך דיטערמאַנינג די ויסשטעלן צייט, שטעלן די פאָטאָמאַסק אויף די מאַסקע האָלדער פון די UV מאַסקע אַלינער און שטעלן די פאָטאָמאַסק אויף די SU-8 קאָוטאַד ווייפער.
שטעלן די געדרוקט ייבערפלאַך פון די פאָטאָמאַסק גלייך אויף די SU-8 קאָוטאַד זייַט פון די סיליציום ווייפער צו מינאַמייז UV דיספּערסיאָן.
ויסשטעלן די SU-8 קאָוטאַד ווייפער און פאָטאָמאַסק ווערטיקלי צו 260 mJ/cm2 פון UV ליכט פֿאַר די פּרידיטערמינד ויסשטעלן צייט (זען שריט 10 פון דעם קעסטל).
נאָך UV ויסשטעלן, SU-8-קאָוטאַד סיליציום ווייפערז זענען בייקט ביי 65 ° C פֿאַר 5 מינוט און 95 ° C פֿאַר 15 מינוט אויף יעדער הייס טעלער צו פּראָדוצירן פּאַטערנז מיט אַ הייך פון 200 μם.
די דעוועלאָפּער איז אויסגעגאסן אין אַ גלאז שיסל, און די בייקט ווייפער איז געשטעלט אין די שיסל. דער באַנד פון SU-8 דעוועלאָפּער קען בייַטן דיפּענדינג אויף די גרייס פון די גלאז טעלער. מאַכט זיכער צו נוצן גענוג SU-8 דעוועלאָפּער צו גאָר באַזייַטיקן אַניקספּאָוזד SU-8. ראָוטיישאַן.
שווענקען די דעוועלאָפּעד פורעם מיט ~ 10 מל פון פריש דעוועלאָפּער נאכגעגאנגען דורך יפּאַ דורך ספּרייינג די לייזונג מיט אַ פּייפּעט.
שטעלן די ווייפער אין אַ פּלאַזמע קלינער און ויסשטעלן צו זויערשטאָף פּלאַזמע (אַטמאַספעריק גאַז, ציל דרוק 1 × 10-5 טאָר, מאַכט 125 וו) פֿאַר 1.5 מין.
שטעלן די ווייפער אין אַ וואַקוום דעסיקקאַטאָר מיט אַ גלאז רוק ין.ווייפערס און סליידז קענען זיין געשטעלט זייַט ביי זייַט. אויב די וואַקוום דעסיקקאַטאָר איז צעטיילט אין עטלעכע לייַערס דורך אַ טעלער, שטעלן די סליידז אין דער נידעריקער קאַמער און די ווייפערז אין דער אויבערשטער קאַמער. וואַקוום פֿאַר סילאַניסיישאַן.
טאָ אַ וויאַל פון פאַרפרוירן קאַקאָ-2 סעלז אין אַ 37 ° C וואַסער וואַנע, און אַריבערפירן די טאָד סעלז צו אַ ט75 קאָלבע מיט 15 מל פון 37 ° C פּרעוואָרמד קאַקאָ-2 מיטל.
צו פאָרן קאַקאָ-2 סעלז ביי ~ 90% קאַנפלואַנס, ערשטער וואַרעם קאַקאָ-2 מיטל, פּבס, און 0.25% טריפּסין / 1 מם עדטאַ אין אַ 37 ° C וואַסער וואַנע.
אַספּירירן די מיטל דורך וואַקוום אַספּיראַטיאָן. וואַש סעלז צוויי מאָל מיט 5 מל פון וואַרעם פּבס דורך ריפּיטינג וואַקוום אַספּיראַטיאָן און אַדינג פריש פּבס.