דאנק איר פֿאַר באזוכן Nature.com.איר נוצן אַ בלעטערער ווערסיע מיט לימיטעד CSS שטיצן.פֿאַר דער בעסטער דערפאַרונג, מיר רעקאָמענדירן אַז איר נוצן אַ דערהייַנטיקט בלעטערער (אָדער דיסייבאַל קאַמפּאַטאַבילאַטי מאָדע אין Internet Explorer).אין אַדישאַן, צו ענשור אָנגאָינג שטיצן, מיר ווייַזן דעם פּלאַץ אָן סטיילז און דזשאַוואַסקריפּט.
דיספּלייז אַ קעראַסעל פון דרייַ סליידז אין אַמאָל.ניצן די פריערדיקע און ווייַטער קנעפּלעך צו מאַך דורך דריי סליידז אין אַ צייט, אָדער נוצן די סליידער קנעפּלעך אין די סוף צו מאַך דורך דריי סליידז אין אַ צייט.
די בלוט-מאַרך שלאַבאַן און די בלוט-מאַרך שלאַבאַן פאַרמייַדן ביאָטעראַפּיוטיק אגענטן צו דערגרייכן זייער טאַרגאַץ אין די הויפט נערוועז סיסטעם, דערמיט כינדערינג עפעקטיוו באַהאַנדלונג פון נוראַלאַדזשיקאַל חולאתן.צו אַנטדעקן ראָמאַן מאַרך טראַנספּאָרטערס אין וויוואָו, מיר באַקענענ אַ ט 7 פאַגע פּעפּטייד ביבליאָטעק און סיריאַל קאַלעקטאַד בלוט און סערעבראָספּינאַל פליסיק (CSF) ניצן אַ קאַנאַלייטיד באַוווסטזיניק גרויס בעקן מאָדעל פון ראַץ.ספּעציפיש פאַג קלאָונז זענען העכסט ענריטשט אין CSF נאָך פיר ראָונדס פון סעלעקציע.טעסטינג פון יחיד קאַנדידאַט פּעפּטיידז גילוי מער ווי 1000-פאַרלייגן ענריטשמענט אין CSF.די ביאָאַקטיוויטי פון די פּעפּטייד-מעדיאַטעד עקספּרעס צו דעם מאַרך איז באשטעטיקט דורך אַ 40% רעדוקציע אין די מדרגה פון אַמילאָיד-β אין די סערעבראָספּינאַל פליסיק מיט אַ BACE1 פּעפּטייד ינכיבאַטער לינגקט צו די יידענאַפייד ראָמאַן דורכפאָר פּעפּטייד.די רעזולטאַטן פֿאָרשלאָגן אַז די פּעפּטיידז יידענאַפייד דורך אין וויוואָו פאַדזש סעלעקציע מעטהאָדס קען זיין נוציק וועהיקלעס פֿאַר סיסטעמיק עקספּרעס פון מאַקראָמאָלעקולעס צו דעם מאַרך מיט אַ טעראַפּיוטיק ווירקונג.
פאָרשונג אין די טעראַפּיוטיק טאַרגעטעד פון די הויפט נערוועז סיסטעם (CNS) איז לאַרגעלי פאָוקיסט אויף די ידענטיפיצירן אָפּטימיזעד דרוגס און אגענטן וואָס האָבן CNS-טאַרגעטינג פּראָפּערטיעס, מיט ווייניקער מי צו אַנטדעקן די מעקאַניזאַמז וואָס פירן אַקטיוו מעדיצין עקספּרעס צו דעם מאַרך.דאָס איז סטאַרטינג צו טוישן איצט ווייַל מעדיצין עקספּרעס, ספּעציעל גרויס מאַלאַקיולז, איז אַ ינטאַגראַל טייל פון מאָדערן נעוראָססיענסע מעדיצין אַנטוויקלונג.די סוויווע פון ​​​​די הויפט נערוועז סיסטעם איז געזונט פּראָטעקטעד דורך די סערעבראָוואַסקולאַר שלאַבאַן סיסטעם, קאַנסיסטינג פון די בלוט-מאַרך שלאַבאַן (BBB) ​​און די בלוט-מאַרך שלאַבאַן (BCBB) 1, וואָס מאכט עס טשאַלאַנדזשינג צו באַפרייַען דרוגס צו די מאַרך 1,2.עס איז עסטימאַטעד אַז כּמעט אַלע דרוגס פֿאַר גרויס מאַלאַקיולז און מער ווי 98% פון דרוגס פֿאַר קליין מאַלאַקיולז זענען ילימאַנייטאַד פון די מאַרך3.אַז איז וואָס עס איז זייער וויכטיק צו ידענטיפיצירן נייַ מאַרך אַריבערפירן סיסטעמען וואָס צושטעלן עפעקטיוו און ספּעציפיש עקספּרעס פון טעראַפּיוטיק דרוגס צו די CNS 4,5.אָבער, די BBB און BCSFB אויך פאָרשטעלן אַ ויסגעצייכנט געלעגנהייט פֿאַר מעדיצין עקספּרעס ווי זיי דורכנעמען און אַרייַן אַלע סטראַקטשערז פון דעם מאַרך דורך זיין ברייט וואַסקיאַלער.אזוי, די קראַנט השתדלות צו נוצן ניט-ינווייסיוו מעטהאָדס פון עקספּרעס צו דעם מאַרך זענען לאַרגעלי באזירט אויף די מעקאַניזאַם פון רעסעפּטאָר-מעדיאַטעד אַריבערפירן (PMT) ניצן די ענדאָגענאָוס BBB6 רעסעפּטאָר.טראָץ לעצטע שליסל אַדוואַנסיז ניצן די טראַנספעררין רעסעפּטאָר פּאַטוויי 7,8, ווייַטער אַנטוויקלונג פון נייַע עקספּרעס סיסטעמען מיט ימפּרוווד פּראָפּערטיעס איז פארלאנגט.צו דעם סוף, אונדזער ציל איז געווען צו ידענטיפיצירן פּעפּטיידז וואָס זענען ביכולת צו מידיייטינג CSF אַריבערפירן, ווייַל זיי קענען אין פּרינציפּ ווערן גענוצט צו באַפרייַען מאַקראָמאָלעקולעס צו די CNS אָדער צו עפֿענען נייַע רעסעפּטאָר פּאַטווייז.אין באַזונדער, ספּעציפיש ראַסעפּטערז און טראַנספּאָרטערס פון די סערעבראָוואַסקולאַר סיסטעם (BBB און BSCFB) קענען דינען ווי פּאָטענציעל טאַרגאַץ פֿאַר די אַקטיוו און ספּעציפיש עקספּרעס פון ביאָטעראַפּיוטיק דרוגס.סערעבראָספּינאַל פליסיק (CSF) איז אַ סעקרעטאָרי פּראָדוקט פון די טשאָראָיד פּלעקסוס (CS) און איז אין דירעקט קאָנטאַקט מיט די ינטערסטיטיאַל פליסיק פון דעם מאַרך דורך די סובאַראַטשנאָיד פּלאַץ און ווענטריקולאַר פּלאַץ4.לעצטנס עס איז געוויזן אַז סובאַראַטשנאָיד סערעבראָספּינאַל פליסיק דיפיוזיז יקסעסיוולי אין די ינטערסטיטיאַם פון די מאַרך 9.מיר האָפן צו אַקסעס די פּאַרענטשימאַל פּלאַץ ניצן דעם סובאַראַטשנאָיד ינפלאָו שעטעך אָדער גלייַך דורך די BBB.צו דערגרייכן דעם, מיר ימפּלאַמענאַד אַ שטאַרק אין וויוואָו פאַגע סעלעקציע סטראַטעגיע וואָס יידילי יידענאַפייד פּעפּטיידז טראַנספּאָרטאַד דורך איינער פון די צוויי בוילעט פּאַטווייז.
מיר איצט באַשרייַבן אַ סאַקווענטשאַל אין וויוואָו פאַדזש ווייַז זיפּונג אופֿן מיט CSF מוסטערונג קאַפּאַלד מיט הויך טרופּוט סיקוואַנסינג (HTS) צו מאָניטאָר ערשט סעלעקציע ראָונדס מיט די העכסטן ביבליאָטעק דייווערסיטי.זיפּונג איז דורכגעקאָכט אויף באַוווסטזיניק ראַץ מיט אַ פּערמאַנאַנטלי ימפּלאַנטיד גרויס סיסטערנאַ (קם) קאַננולאַ צו ויסמיידן בלוט קאַנטאַמאַניישאַן.ימפּאָרטאַנטלי, דעם צוגאַנג סאַלעקץ ביידע מאַרך-טאַרגעטינג און פּעפּטיידז מיט אַריבערפירן טעטיקייט אַריבער די סערעבראָוואַסקולאַר שלאַבאַן.מיר געוויינט T7 פאַגעס רעכט צו זייער קליין גרייס (~ 60 נם) 10 און סאַגדזשעסטיד אַז זיי זענען פּאַסיק פֿאַר די אַריבערפירן פון וועסיקלעס וואָס לאָזן טראַנססעללולאַר אַריבער פון די ענדאָושעליאַל און / אָדער עפּיטעליאַל-מעדוללאַ שלאַבאַן.נאָך פיר ראָונדס פון פּאַנינג, פאַגע פּאַפּיאַליישאַנז זענען אפגעזונדערט מיט שטאַרק אין וויוואָו קסף ענריטשמענט און סערעבראַל מיקראָוועסעל פאַרבאַנד.ימפּאָרטאַנטלי, מיר זענען ביכולת צו באַשטעטיקן אונדזער פיינדינגז דורך דעמאַנסטרייטינג אַז די בילכער און קעמאַקלי סינטאַסייזד בעסטער קאַנדידאַט פּעפּטיידז זענען ביכולת צו אַריבערפירן פּראָטעין לאַסט אין די סערעבראָספּינאַל פליסיק.ערשטער, די פאַרמאַקאָדינאַמיק יפעקץ פון די CNS זענען געגרינדעט דורך קאַמביינינג אַ לידינג דורכפאָר פּעפּטייד מיט אַ ינכיבאַטער פון די BACE1 פּעפּטייד.אין אַדישאַן צו דעמאַנסטרירן אַז אין וויוואָו פאַנגקשאַנאַל זיפּונג סטראַטעגיעס קענען ידענטיפיצירן ראָמאַן מאַרך אַריבערפירן פּעפּטיידז ווי עפעקטיוו פּראָטעין לאַסט קאַריערז, מיר דערוואַרטן אַז ענלעך פאַנגקשאַנאַל סעלעקציע אַפּראָוטשיז וועט אויך ווערן וויכטיק אין יידענטאַפייינג ראָמאַן מאַרך אַריבערפירן פּאַטווייז.
באַזירט אויף פּלאַק-פאָרמינג וניץ (PFU), נאָך די פאַדזש פּאַקקאַגינג שריט, אַ ביבליאָטעק פון טראַפ 12-מער לינעאַר ט 7 פאַגע פּעפּטיידז מיט אַ דייווערסיטי פון בעערעך 109 איז דיזיינד און באשאפן (זען מאַטעריאַלס און מעטהאָדס).עס איז וויכטיק צו טאָן אַז מיר קערפאַלי אַנאַלייזד דעם ביבליאָטעק איידער פּאַנינג אין וויוואָו.פּקר אַמפּלאַפאַקיישאַן פון פאַגע ביבליאָטעק סאַמפּאַלז ניצן מאַדאַפייד פּרימערז דזשענערייטאַד אַמפּליקאָנס וואָס זענען גלייַך אָנווענדלעך צו הץ (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 1 אַ).רעכט צו אַ) HTS11 סיקוואַנסינג ערראָרס, ב) פּראַל אויף די קוואַליטעט פון אָנפאַנגער (NNK) 1-12, און c) די בייַזייַן פון ווילד-טיפּ (ווט) פאַגע (סקעלעט ינסערץ) אין די סטאַנדביי ביבליאָטעק, אַ סיקוואַנס פילטערינג פּראָצעדור איז ימפּלאַמענאַד צו עקסטראַקט בלויז וועראַפייד סיקוואַנס אינפֿאָרמאַציע (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 1 ב).די פילטער סטעפּס אַפּלייז צו אַלע HTS סיקוואַנסינג לייברעריז.פֿאַר די נאָרמאַל ביבליאָטעק, אַ גאַנץ פון 233,868 לייענען זענען באקומען, פון וואָס 39% דורכגעגאנגען די פילטער קרייטיריאַ און זענען געניצט פֿאַר ביבליאָטעק אַנאַליסיס און סעלעקציע פֿאַר סאַבסאַקוואַנט ראָונדס (סופּפּלעמענטאַרי פיגור 1c-e).די לייענען זענען פּרידאַמאַנאַנטלי מאַלטאַפּאַלז פון 3 באַזע פּערז אין לענג מיט אַ שפּיץ בייַ 36 נוקלעאָטידעס (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 1 ק), קאַנפערמינג די ביבליאָטעק פּלאַן (ננק) 1-12.נאָוטאַבלי, בעערעך 11% פון די ביבליאָטעק מיטגלידער קאַנטיינד אַ 12-דימענשאַנאַל ווילד-טיפּ (wt) באַקבאָון PAGISRELVDKL אַרייַנלייגן, און כּמעט האַלב פון די סיקוואַנסיז (49%) קאַנטיינד ינסערשאַנז אָדער דילישאַנז.די HTS פון דער ביבליאָטעק ביבליאָטעק באשטעטיקט די הויך דייווערסיטי פון פּעפּטיידז אין דער ביבליאָטעק: מער ווי 81% פון פּעפּטייד סיקוואַנסיז זענען געפֿונען בלויז אַמאָל און בלויז 1.5% פארגעקומען אין ≥4 עקזעמפלארן (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 2אַ).די פריקוואַנסיז פון אַמינאָ אַסאַדז (אַאַ) אין אַלע 12 שטעלעס אין די רעפּערטואַר קאָראַלייטאַד געזונט מיט די פריקוואַנסיז דערוואַרט פֿאַר די נומער פון קאָדאָנס דזשענערייטאַד דורך די דידזשענערייטיד NKK רעפּערטואַר (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 2 ב).די באמערקט אָפטקייַט פון אַ אַ רעזאַדוז ענקאָודיד דורך די ינסערץ קעראַלייטיד געזונט מיט די קאַלקיאַלייטיד אָפטקייַט (ר = 0.893) (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 2 ק).דער צוגרייטונג פון פאַגע לייברעריז פֿאַר ינדזשעקשאַן כולל די סטעפּס פון אַמפּלאַפאַקיישאַן און באַזייַטיקונג פון ענדאָטאָקסין.דאָס איז פריער געוויזן צו פּאַטענטשאַלי רעדוצירן די דייווערסיטי פון פאַדזש לייברעריז12,13.דעריבער, מיר סיקוואַנס אַ טעלער-אַמפּלאַפייד פאַגע ביבליאָטעק וואָס האט אַנדערגאָן ענדאָטאָקסין באַזייַטיקונג און קאַמפּערד עס מיט דער אָריגינעל ביבליאָטעק צו אָפּשאַצן די אָפטקייַט פון אַאַ.א שטאַרק קאָראַליישאַן (ר = 0.995) איז באמערקט צווישן די אָריגינעל בעקן און די אַמפּלאַפייד און פּיוראַפייד בעקן (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 2 ד), ינדאַקייטינג אַז פאַרמעסט צווישן קלאָונז אַמפּלאַפייד אויף פּלאַטעס ניצן ט 7 פאַגע האט נישט פאַרשאַפן הויפּט פאָרורטייל.דער פאַרגלייַך איז באזירט אויף די אָפטקייַט פון טריפּעפּטייד מאָוטיפס אין יעדער ביבליאָטעק, ווייַל די דייווערסיטי פון לייברעריז (~ 109) קענען ניט זיין גאָר קאַפּטשערד אפילו מיט HTS.אָפטקייַט אַנאַליסיס פון אַאַ אין יעדער שטעלע אנטפלעקט אַ קליין שטעלע-אָפענגיק פאָרורטייל אין די לעצטע דרייַ שטעלעס פון די אריין רעפּערטוואַר (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 2e).אין מסקנא, מיר געפונען אַז די קוואַליטעט און דייווערסיטי פון דער ביבליאָטעק זענען פּאַסיק און בלויז מינערווערטיק ענדערונגען אין דייווערסיטי זענען באמערקט רעכט צו אַמפּלאַפאַקיישאַן און צוגרייטונג פון פאַדזש לייברעריז צווישן עטלעכע ראָונדס פון סעלעקציע.
סיריאַל סערעבראָספּינאַל פליסיק מוסטערונג קענען זיין דורכגעקאָכט דורך סורגיקאַללי ימפּלאַנטינג אַ קאַננולאַ אין די סענטימעטער פון באַוווסטזיניק ראַץ צו פאַסילאַטייט לעגיטימאַציע פון ​​​​ט7 פאַגע ינדזשעקטיד ינטראַווינאַסלי (יוו) דורך די BBB און / אָדער BCSFB (Fig. 1a-b).מיר געוויינט צוויי פרייַ סעלעקציע געווער (געווער א און ב) אין דער ערשטער דרייַ ראָונדס פון אין וויוואָו סעלעקציע (Fig. 1c).מיר ביסלעכווייַז געוואקסן די סטרינדזשאַנסי פון די סעלעקציע דורך דיקריסינג די גאַנץ סומע פון ​​​​פאַגע באַקענענ אין די ערשטער דריי ראָונדס פון סעלעקציע.פֿאַר די פערט קייַלעכיק פון פּאַנינג, מיר קאַמביינד סאַמפּאַלז פון צווייגן א און ב און דורכגעקאָכט דריי נאָך פרייַ סאַלעקשאַנז.צו לערנען די אין וויוואָו פּראָפּערטיעס פון ט 7 פאַדזש פּאַרטיקאַלז אין דעם מאָדעל, ווילד-טיפּ פאַגע (PAGISRELVDKL בעל אַרייַנלייגן) איז ינדזשעקטיד אין ראַץ דורך די עק אָדער.אָפּזוך פון פאַגעס פון סערעבראָספּינאַל פליסיק און בלוט אין פאַרשידענע צייט ווייזט אַז לעפיערעך קליין ט7 יקאָסאַהעדראַל פאַגעס האט אַ גיך ערשט רעשוס פאַסע פון ​​די בלוט אָפּטייל (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 3).באַזירט אויף די אַדמינאַסטערד טיטערס און די בלוט באַנד פון די ראַץ, מיר קאַלקיאַלייטיד אַז בלויז בעערעך 1% וו.פאַגע פון ​​די אַדמינאַסטערד דאָזע איז דיטעקטאַד אין די בלוט 10 מינוט נאָך ינטראַווינאַס ינדזשעקשאַן.נאָך דעם ערשט גיך אַראָפּגיין, אַ סלאָוער ערשטיק רעשוס איז געמאסטן מיט אַ האַלב-לעבן פון 27.7 מינוט.ימפּאָרטאַנטלי, בלויז זייער ווייניק פאַגעס זענען ריטריווד פון די CSF אָפּטייל, ינדאַקייטינג אַ נידעריק הינטערגרונט פֿאַר ווילד-טיפּ פאַגע מייגריישאַן אין די CSF אָפּטייל (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 3).אין דורכשניטלעך, בלויז וועגן 1 קס 10-3% טיטערס פון ט 7 פאַגע אין די בלוט און 4 קס 10-8% פון טכילעס ינפיוזד פאַגעס זענען דיטעקטאַד אין די סערעבראָספּינאַל פליסיק איבער די גאנצע מוסטערונג צייט (0-250 מינוט).נאָוטאַבלי, די האַלב-לעבן (25.7 מין) פון ווילד-טיפּ פאַגע אין סערעבראָספּינאַל פליסיק איז געווען ענלעך צו די באמערקט אין בלוט.די דאַטן באַווייַזן אַז די שלאַבאַן סעפּערייטינג די CSF אָפּטייל פון די בלוט איז בעשאָלעם אין CM-קאַננואַלייטיד ראַץ, אַלאַוינג אין וויוואָו סעלעקציע פון ​​​​פאַג לייברעריז צו ידענטיפיצירן קלאָונז וואָס זענען גרינג טראַנספּאָרטאַד פון די בלוט אין די CSF אָפּטייל.
(אַ) באַשטעטיקן אַ אופֿן פֿאַר שייַעך-סאַמפּלינג סערעבראָספּינאַל פליסיק (CSF) פון אַ גרויס בעקן.(ב) דיאַגראַמע וואָס ווייַזן די סעליאַלער אָרט פון די הויפט נערוועז סיסטעם (CNS) באַריער און די סעלעקציע סטראַטעגיע געניצט צו ידענטיפיצירן פּעפּטיידז וואָס קרייַז די בלוט-מאַרך שלאַבאַן (BBB) ​​און די בלוט-מאַרך שלאַבאַן.(C) אין וויוואָו פאַדזש ווייַז זיפּונג פלאָוטשאַרט.אין יעדער סעלעקציע קייַלעכיק, פאַגעס (כייַע ידענטיפיערס ין די אַראָוז) זענען ינדזשעקטיד ינטראַווינאַסלי.צוויי פרייַ אָלטערנאַטיוו צווייגן (א, ב) זענען געהאלטן סעפּעראַטלי ביז די 4 קייַלעכיק סעלעקציע.פֿאַר סעלעקציע ראָונדס 3 און 4, יעדער פאַג קלאָון יקסטראַקטיד פון CSF איז מאַניואַלי סיקוואַנס.(ד) קינעטיק פון פאַגע אפגעזונדערט פון בלוט (רויט קרייזן) און סערעבראָספּינאַל פליסיק (גרין טריאַנגלעס) בעשאַס דער ערשטער קייַלעכיק פון סעלעקציע אין צוויי קאַנאַלייטיד ראַץ נאָך ינטראַווינאַס ינדזשעקשאַן פון די ט 7 פּעפּטייד ביבליאָטעק (2 קס 1012 פאַגעס / כייַע).בלוי סקווערז אָנווייַזן די דורכשניטלעך ערשט קאַנסאַנטריישאַן פון פאַגע אין די בלוט, קאַלקיאַלייטיד פון די סומע פון ​​ינדזשעקטיד פאַג, גענומען אין חשבון די גאַנץ בלוט באַנד.די שוואַרץ סקווערז אָנווייַזן די פונט פון ינטערסעקשאַן פון די י שורה עקסטראַפּאַלייטיד פון בלוט פאַדזש קאַנסאַנטריישאַנז.(e,f) פאָרשטעלן די קאָרעוו אָפטקייַט און פאַרשפּרייטונג פון אַלע מעגלעך אָוווערלאַפּינג טריפּעפּטייד מאָוטיפס געפֿונען אין די פּעפּטייד.די נומער פון מאָוטיפס געפֿונען אין 1000 רידינגז איז געוויזן.באטייטיק (פּ <0.001) ענריטשט מאָוטיפס זענען אנגעצייכנט מיט רויט דאַץ.(e) קאָרעלאַטיאָן צעוואָרפן קאַמפּערינג די קאָרעוו אָפטקייַט פון די טריפּעפּטייד מאָטיף פון די ינדזשעקטיד ביבליאָטעק מיט בלוט-דערייווד פאַג פון אַנימאַלס # 1.1 און # 1.2.(f) קאָרעלאַטיאָן צעוואָרפן קאַמפּערינג די קאָרעוו פריקוואַנסיז פון כייַע פאַגע טריפּעפּטידע מאָוטיפס # 1.1 און # 1.2 אפגעזונדערט אין בלוט און סערעבראָספּינאַל פליסיק.(ג, ה) סיקוואַנס שייַן פאַרטרעטונג פון פאַגע ענריטשט אין בלוט (ג) קעגן ינדזשעקטיד לייברעריז און פאַגע ענריטשט אין CSF (ה) קעגן בלוט נאָך אַ קייַלעכיק פון אין וויוואָו סעלעקציע אין ביידע אַנימאַלס.די גרייס פון דעם איין-בריוו קאָד ינדיקייץ ווי אָפט אַז אַמינאָ זויער אַקערז אין דער שטעלע.גרין = פּאָליאַר, לילאַ = נייטראַל, בלוי = יקערדיק, רויט = אַסידיק און שוואַרץ = הידראָפאָביק אַמינאָ אַסאַדז.פיגורע 1אַ, ב איז דיזיינד און געשאפן דורך Eduard Urich.
מיר ינדזשעקטיד אַ פאַגע פּעפּטייד ביבליאָטעק אין צוויי סענטימעטער קיילע ראַץ (קלאַדעס א און ב) און אפגעזונדערט פאַגע פון ​​סערעבראָספּינאַל פליסיק און בלוט (פיגורע 1 ד).דער ערשט גיך רעשוס פון דער ביבליאָטעק איז געווען ווייניקער פּראַנאַונסט קאַמפּערד מיט די ווילד-טיפּ פאַגע.די דורכשניטלעך האַלב-לעבן פון די ינדזשעקטיד ביבליאָטעק אין ביידע אַנימאַלס איז געווען 24.8 מינוט אין בלוט, ענלעך צו ווילד-טיפּ פאַגע, און 38.5 מינוט אין CSF.סאַמפּאַלז פון בלוט און סערעבראָספּינאַל פליסיק פאַדזש פון יעדער כייַע זענען אונטערטעניק צו HTS און אַלע יידענאַפייד פּעפּטיידז זענען אַנאַלייזד פֿאַר דעם בייַזייַן פון אַ קורץ טריפּעפּטייד מאָטיף.טריפּעפּטידע מאָוטיפס זענען אויסדערוויילט ווייַל זיי צושטעלן אַ מינימאַל יקער פֿאַר סטרוקטור פאָרמירונג און פּעפּטייד-פּראָטעין ינטעראַקשאַנז14,15.מיר געפֿונען אַ גוט קאָראַליישאַן אין די פאַרשפּרייטונג פון מאָוטיפס צווישן די ינדזשעקטיד פאַגע ביבליאָטעק און קלאָונז יקסטראַקטיד פון די בלוט פון ביידע אַנימאַלס (Fig. 1e).די דאַטן אָנווייַזן אַז דער זאַץ פון דער ביבליאָטעק איז בלויז מאַרדזשאַנאַלי ענריטשט אין די בלוט אָפּטייל.אַמינאָ זויער פריקוואַנסיז און קאָנסענסוס סיקוואַנסיז זענען ווייַטער אַנאַלייזד אין יעדער שטעלע ניצן אַ אַדאַפּטיישאַן פון די וועבלאָגאָ 16 ווייכווארג.ינטערעסטינגלי, מיר געפונען אַ שטאַרק ענריטשמענט אין בלוט גלייסין רעזאַדוז (Fig. 1ג).ווען בלוט איז געווען קאַמפּערד מיט קלאָונז אויסגעקליבן פון CSF, שטאַרק סעלעקציע און עטלעכע דיסעלעקטיאָן פון מאָוטיפס זענען באמערקט (Fig. 1f), און זיכער אַמינאָ אַסאַדז זענען פּרעפערענטשאַלי פאָרשטעלן אין פּרידיטערמינד שטעלעס אין די 12-מיטגליד (Fig. 1 ה).נאָוטאַבלי, יחיד אַנימאַלס דיפערד באטייטיק אין סערעבראָספּינאַל פליסיק, כוועראַז בלוט גלייסין ענריטשמענט איז באמערקט אין ביידע אַנימאַלס (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 4 אַ-דזש).נאָך סטרינדזשאַנט פֿילטרירונג פון סיקוואַנס דאַטן אין די סערעבראָספּינאַל פליסיק פון אַנימאַלס # 1.1 און # 1.2, אַ גאַנץ פון 964 און 420 יינציק 12-מער פּעפּטיידז זענען באקומען (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 1 ד-ע).די אפגעזונדערט פאַגע קלאָונז זענען אַמפּלאַפייד און אונטערטעניק צו אַ צווייט קייַלעכיק פון אין וויוואָו סעלעקציע.פאַגע יקסטראַקטיד פון די רגע קייַלעכיק פון סעלעקציע זענען אונטערטעניק צו HTS אין יעדער כייַע און אַלע יידענאַפייד פּעפּטיידז זענען געניצט ווי אַרייַנשרייַב צו אַ מאָטיף דערקענונג פּראָגראַם צו פונאַנדערקלייַבן די פּאַסירונג פון טריפּעפּטידע מאָוטיפס (Fig. 2a, b, ef).קאַמפּערד מיט דער ערשטער ציקל פון די פאַגע ריקאַווערד פון CSF, מיר באמערקט ווייַטער סעלעקציע און דיסאַלעקשאַן פון פילע מאָוטיפס אין CSF אין צווייגן א און ב (Fig. 2).א נעץ לעגיטימאַציע אַלגערידאַם איז געווען געווענדט צו באַשליסן אויב זיי רעפּריזענטיד פאַרשידענע פּאַטערנז פון קאָנסיסטענט סיקוואַנס.א קלאָר ענלעכקייט איז באמערקט צווישן די 12-דימענשאַנאַל סיקוואַנסיז ריקאַווערד דורך CSF אין אָלטערנאַטיוו קלאַדע א (Fig. 2c, d) און קלאַדע ב (Fig. 2g, ה).די פּאָאָלעד אַנאַליסיס אין יעדער צווייַג אנטפלעקט פאַרשידענע סעלעקציע פּראָופיילז פֿאַר 12-מער פּעפּטיידז (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 5 ק, ד) און אַ פאַרגרעסערן אין די CSF / בלוט טיטער פאַרהעלטעניש איבער צייַט פֿאַר פּאָאָלעד קלאָונז נאָך די רגע קייַלעכיק פון סעלעקציע קאַמפּערד צו די ערשטער קייַלעכיק פון סעלעקציע (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 5 ע).).
ענריטשמענט פון מאָוטיפס און פּעפּטיידז אין סערעבראָספּינאַל פליסיק דורך צוויי סאַקסעסיוו ראָונדס פון אין וויוואָו פאַנגקשאַנאַל פאַדזש אַרויסווייַזן סעלעקציע.
אַלע סערעבראָספּינאַל פליסיק פאַגעס ריקאַווערד פון דער ערשטער קייַלעכיק פון יעדער כייַע (אַנימאַלס #1.1 און #1.2) זענען פּאָאָלעד, אַמפּלאַפייד, הט-סיקוואַנד און ריינדזשעקטאַד צוזאַמען (2 רענטגענ 1010 פאַגעס / כייַע) 2 סם קאַנאַלייטיד ראַץ (#1.1 → #).2.1 און 2.2, 1.2 → 2.3 און 2.4).(אַ, ב, ע, ו) קאָראַליישאַן צעוואָרפן קאַמפּערינג די קאָרעוו אָפטקייַט פון טריפּעפּטייד מאָוטיפס פון אַלע CSF-דערייווד פאַגעס אין דער ערשטער און רגע סעלעקציע ראָונדס.קאָרעוו אָפטקייַט און פאַרשפּרייטונג פון מאָוטיפס רעפּריזענטינג אַלע מעגלעך אָוווערלאַפּינג טריפּעפּטיידז געפֿונען אין פּעפּטיידז אין ביידע אָריענטיישאַנז.די נומער פון מאָוטיפס געפֿונען אין 1000 רידינגז איז געוויזן.מאָוטיפס וואָס זענען באטייטיק (פּ <0.001) אויסגעקליבן אָדער יקסקלודיד אין איינער פון די קאַמפּערד לייברעריז זענען כיילייטיד מיט רויט דאַץ.(C, d, g, h) סיקוואַנס לאָגאָ פאַרטרעטונג פון אַלע CSF-רייַך 12 אַמינאָ זויער לאַנג סיקוואַנסיז באזירט אויף ראָונדס 2 און 1 פון אין וויוואָו סעלעקציע.די גרייס פון דעם איין-בריוו קאָד ינדיקייץ ווי אָפט אַז אַמינאָ זויער אַקערז אין דער שטעלע.צו פאָרשטעלן דעם לאָגאָ, די אָפטקייַט פון CSF סיקוואַנסיז יקסטראַקטיד פון יחיד אַנימאַלס צווישן צוויי סעלעקציע ראָונדס איז קאַמפּערד און די ענריטשט סיקוואַנסיז אין די רגע קייַלעכיק זענען געוויזן: (c) #1.1–#2.1 (ד) #1.1–#2.2 (ג) #1.2–#2.3 און (ה) #1.2–#2.4.די מערסט ענריטשט אַמינאָ אַסאַדז אין אַ געגעבן שטעלע אין (C, ד) אַנימאַלס ניט.2.1 און ניט.2.2 אָדער (ג, ה) אין אַנימאַלס ניט.2.3 און ניט.2.4 זענען געוויזן אין קאָלירן.גרין = פּאָליאַר, לילאַ = נייטראַל, בלוי = יקערדיק, רויט = אַסידיק און שוואַרץ = הידראָפאָביק אַמינאָ אַסאַדז.
נאָך די דריט קייַלעכיק פון סעלעקציע, מיר יידענאַפייד 124 יינציק פּעפּטייד סיקוואַנסיז (#3.1 און #3.2) פון 332 CSF-ריקאַנסטאַטוטאַד פאַג קלאָונז אפגעזונדערט פון צוויי אַנימאַלס (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 6אַ).די סיקוואַנס LGSVS (18.7%) האט די העכסטן קאָרעוו פּראָפּאָרציע, נאכגעגאנגען דורך די ווילד-טיפּ ינסערץ PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), און SARGSWREIVSLS (2.2%).אין די לעצט פערט קייַלעכיק, מיר פּאָאָלעד צוויי ינדיפּענדאַנטלי אויסגעקליבן צווייגן פון דרייַ באַזונדער אַנימאַלס (Fig. 1c).פון די 925 סיקוואַנסעד פאַג קלאָונז ריקאַווערד פון CSF, אין דער פערט קייַלעכיק מיר געפֿונען 64 יינציק פּעפּטייד סיקוואַנסיז (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 6 ב), צווישן וואָס די קאָרעוו פּראָפּאָרציע פון ​​ווילד-טיפּ פאַג דראַפּט צו 0.8%.די מערסט פּראָסט CSF קלאָונז אין דער פערט קייַלעכיק זענען LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) און RLSSVDSDLSGC (3,2%).%)).די לענג קייט פון די אויסגעקליבן פּעפּטיידז איז רעכט צו נוקלעאָטידע ינסערשאַנז / דילישאַנז אָדער צו פרי האַלטן קאָדאָנס אין די ביבליאָטעק פּרימערז ווען ניצן דידזשענערייטיד קאָדאַנז פֿאַר NNK ביבליאָטעק פּלאַן.פּרימאַטיק האַלטן קאָדאָנס דזשענערייט קירצער פּעפּטיידז און זענען אויסגעקליבן ווייַל זיי אַנטהאַלטן די גינציק אַאַ מאָטיף.מער פּעפּטיידז קען זיין געפֿירט דורך ינסערשאַנז / דילישאַנז אין די פּרימערז פון סינטעטיש לייברעריז.דעם פּאַזישאַנד די דיזיינד האַלטן קאָדאָן אַרויס די ראַם און לייענט עס ביז אַ נייַ האַלטן קאָדאָן איז דאַונסטרים.אין אַלגעמיין, מיר קאַלקיאַלייטיד ענריטשמענט סיבות פֿאַר אַלע פיר סעלעקציע ראָונדס דורך קאַמפּערינג די אַרייַנשרייַב דאַטן מיט די מוסטער רעזולטאַט דאַטן.פֿאַר דער ערשטער קייַלעכיק זיפּונג, מיר געוויינט ווילד-טיפּ פאַגע טיטערס ווי אַ ניט-ספּעציפיש הינטערגרונט רעפֿערענץ.ינטערעסטינגלי, נעגאַטיוו פאַגע סעלעקציע איז געווען זייער שטאַרק אין דער ערשטער CSF ציקל, אָבער נישט אין בלוט (Fig. 3a), וואָס קען זיין רעכט צו דער נידעריק מאַשמאָעס פון פּאַסיוו דיפיוזשאַן פון רובֿ מיטגלידער פון די פּעפּטייד ביבליאָטעק אין די CSF אָפּטייל אָדער קאָרעוו פאַגעס טענד צו זיין מער יפישאַנטלי ריטיינד אָדער אַוועקגענומען פון די בלאַדסטרים ווי באַקטעריאָפאַגעס.אָבער, אין די רגע קייַלעכיק פון פּאַנינג, שטאַרק סעלעקציע פון ​​​​פאַגעס אין CSF איז באמערקט אין ביידע קליידז, סאַגדזשעסטינג אַז די פריערדיקע קייַלעכיק איז ענריטשט אין פאַגעס ווייַזנדיק פּעפּטיידז וואָס העכערן CSF אַפּטייק (Fig. 3 אַ).ווידער, אָן באַטייטיק בלוט באַרייַכערונג.אויך אין די דריט און פערט ראָונדס, די פאַג קלאָונז זענען באטייטיק ענריטשט אין CSF.קאַמפּערינג די קאָרעוו אָפטקייַט פון יעדער יינציק פּעפּטייד סיקוואַנס צווישן די לעצטע צוויי ראָונדס פון סעלעקציע, מיר געפונען אַז די סיקוואַנסיז זענען אפילו מער ענריטשט אין דער פערט קייַלעכיק פון סעלעקציע (Fig. 3b).א גאַנץ פון 931 טריפּעפּטייד מאָוטיפס זענען יקסטראַקטיד פון אַלע 64 יינציק פּעפּטייד סיקוואַנסיז ניצן ביידע פּעפּטייד אָריענטיישאַנז.די מערסט ענריטשט מאָוטיפס אין דער פערט קייַלעכיק זענען מער ענג יגזאַמאַנד פֿאַר זייער ענריטשמענט פּראָופיילז אַריבער אַלע ראָונדס קאַמפּערד צו די ינדזשעקטיד ביבליאָטעק (שנייַדן-אַוועק: 10% ענריטשמענט) (סאַפּלאַמענערי פייג. 6 ק).אלגעמיינע מוסטערן פון אויסוואל האט געוויזן, אז רוב פון די געלערנטע מאטיוון זענען בארייכערט געווארן אין אלע פריערדיגע רונדע פון ​​ביידע סעלעקציע צווייגן.אָבער, עטלעכע מאָוטיפס (למשל SGL, VSG, LGS GSV) זענען פּרידאַמאַנאַנטלי פֿון אָלטערנאַטיוו קלאַדע א, בשעת אנדערע (למשל FGW, RTN, WGF, NTR) זענען ענריטשט אין אָלטערנאַטיוו קלאַדע ב.
וואַלאַדיישאַן פון CSF אַריבערפירן פון CSF-ענריטשט פאַגע-ווייַז פּעפּטיידז און ביאָטינילאַטעד פירער פּעפּטיידז קאָנדזשוגאַטעד צו סטרעפּטאַווידין פּיילאָודז.
(אַ) ענריטשמענט ריישיאָוז קאַלקיאַלייטיד אין אַלע פיר ראָונדס (ר 1-ר 4) באזירט אויף ינדזשעקטיד (ינפּוט = איך) פאַגע (פּפו) טיטערס און באשלאסן CSF פאַגע טיטערס (רעזולטאַט = אָ).ענריטשמענט סיבות פֿאַר די לעצטע דריי ראָונדס (ר 2-ר 4) זענען קאַלקיאַלייטיד דורך פאַרגלייַך מיט די פריערדיקע קייַלעכיק און דער ערשטער קייַלעכיק (ר 1) מיט וואָג דאַטן.עפענען באַרס זענען סערעבראָספּינאַל פליסיק, שיידיד באַרס זענען פּלאַזמע.(*** פּ <0.001, באזירט אויף תּלמיד ס ה-פּרובירן).(ב) רשימה פון די מערסט שעפעדיק פאַגע פּעפּטיידז, ראַנגקט לויט זייער קאָרעוו פּראָפּאָרציע צו אַלע פאַגעס געזאמלט אין CSF נאָך קייַלעכיק 4 פון סעלעקציע.די זעקס מערסט פּראָסט פאַג קלאָונז זענען כיילייטיד אין קאָלירן, געציילט און זייער ענריטשמענט סיבות צווישן ראָונדס 3 און 4 פון סעלעקציע (ינסעץ).(c,d) די זעקס מערסט ענריטשט פאַג קלאָונז, ליידיק פאַג און פּאַרענטאַל פאַג פּעפּטייד לייברעריז פון קייַלעכיק 4 זענען אַנאַלייזד ינדיווידזשואַלי אין אַ CSF מוסטערונג מאָדעל.CSF און בלוט סאַמפּאַלז זענען געזאמלט אין די אנגעוויזן צייט.(C) גלייַך אַמאַונץ פון 6 קאַנדידאַט פאַדזש קלאָונז (2 רענטגענ 1010 פאַגעס / אַנימאַלס), ליידיק פאַגעס (# 1779) (2 רענטגענ 1010 פאַגעס / אַנימאַלס) און לאַגער פאַדזש פּעפּטייד ביבליאָטעק (2 רענטגענ 1012 פאַגעס / אַנימאַלס) אַרייַנשפּריצן בייַ מינדסטער 3 סענטימעטער איז אַדמינאַסטערד דורך אַ באַזונדער כייַע.די CSF פאַרמאַקאָקינעטיקס פון יעדער ינדזשעקטיד פאַג קלאָון און פאַג פּעפּטייד ביבליאָטעק איבער צייַט איז געוויזן.(ד) ווייזט די דורכשניטלעך CSF / בלוט פאַרהעלטעניש פֿאַר אַלע ריקאַווערד פאַגעס / מל איבער די מוסטערונג צייט.(e) פיר סינטעטיש פירער פּעפּטיידז און איין סקראַמבאַלד קאָנטראָל זענען לינגקט מיט ביאָטין צו סטרעפּטאַווידין דורך זייער N-טערמינוס (טעטראַמער אַרויסווייַזן) נאכגעגאנגען דורך ינדזשעקשאַן (עק אָדער יוו, 10 מג סטרעפּטאַווידין / קג).אין מינדסטער דרייַ ינטובייטיד ראַץ (N = 3).).CSF סאַמפּאַלז זענען געזאמלט אין די אנגעוויזן צייט פונקטן און סטרעפּטאַווידין קאַנסאַנטריישאַנז זענען געמאסטן דורך CSF אַנטי-סטרעפּטאַווידין עליסאַ (נד = ניט דיטעקטאַד).(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, באזירט אויף ANOVA טעסט).(f) פאַרגלייַך פון די אַמינאָ זויער סיקוואַנס פון די מערסט ענריטשט פאַג פּעפּטייד קלאָון #2002 (לילאַ) מיט אנדערע סעלעקטעד פאַג פּעפּטייד קלאָונז פון די 4th קייַלעכיק פון סעלעקציע.יידעניקאַל און ענלעך אַמינאָ זויער פראַגמאַנץ זענען קאָליר-קאָדעד.
פון אַלע ענריטשט פאַגעס אין דער פערט קייַלעכיק (Fig. 3b), זעקס קאַנדידאַט קלאָונז זענען אויסגעקליבן פֿאַר ווייַטער יחיד אַנאַליסיס אין די CSF מוסטערונג מאָדעל.גלייך אַמאַונץ פון זעקס קאַנדידאַט פאַגע, ליידיק פאַג (קיין אַרייַנלייגן) און פּראַפאַג פּעפּטייד לייברעריז זענען ינדזשעקטיד אין דרייַ קאַנאַלייטיד סענטימעטער אַנימאַלס, און פאַרמאַקאָקינעטיקס זענען באשלאסן אין CSF (Fig. 3c) און בלוט (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 7) אַסייז.אַלע טעסטעד פאַג קלאָונז טאַרגעטעד די CSF אָפּטייל אין אַ מדרגה 10-1000 מאל העכער ווי אַז פון די ליידיק קאָנטראָל פאַדזש (#1779).פֿאַר בייַשפּיל, קלאָונז #2020 און #2077 האָבן וועגן 1000 מאל העכער CSF טיטערס ווי קאָנטראָל פאַגע.די פאַרמאַקאָקינעטיק פּראָפיל פון יעדער אויסגעקליבן פּעפּטייד איז אַנדערש, אָבער אַלע פון ​​זיי האָבן אַ הויך CSF כאָומינג פיייקייט.מיר האָבן באמערקט אַ קעסיידערדיק פאַרקלענערן איבער צייט פֿאַר קלאָונז #1903 און #2011, בשעת פֿאַר קלאָונז #2077, #2002 און #2009 אַ פאַרגרעסערן אין די ערשטער 10 מינוט קען אָנווייַזן אַקטיוו אַריבערפירן אָבער דאַרף זיין וועראַפייד.קלאָונז #2020, #2002 און #2077 האָבן זיך סטייבאַלייזד אין הויך לעוועלס, בשעת די CSF קאַנסאַנטריישאַן פון קלאָון #2009 סלאָולי דיקריסט נאָך דער ערשט פאַרגרעסערן.מיר דעמאָלט קאַמפּערד די קאָרעוו אָפטקייַט פון יעדער קסף קאַנדידאַט מיט זייַן בלוט קאַנסאַנטריישאַן (Fig. 3 ד).די קאָראַליישאַן פון די דורכשניטלעך טיטער פון יעדער CSF קאַנדידאַט מיט זיין בלוט טיטער אין אַלע מוסטערונג צייט געוויזן אַז דריי פון די זעקס קאַנדאַדייץ זענען באטייטיק ענריטשט אין בלוט CSF.ינטערעסטינגלי, קלאָון #2077 געוויזן העכער בלוט פעסטקייַט (סופּפּלעמענטאַרי פיגור 7).צו באַשטעטיקן אַז די פּעפּטיידז זיך זענען ביכולת צו אַקטיוולי טראַנספּאָרטירן לאַסט אנדערע ווי פאַדזש פּאַרטיקאַלז אין די CSF אָפּטייל, מיר סינטאַסייזד פיר פירער פּעפּטיידז דעריוואַטייזד מיט ביאָטין אין די N-טערמינוס ווו די פּעפּטיידז צוטשעפּען צו די פאַגע פּאַרטאַקאַל.ביאָטינילאַטעד פּעפּטיידז (נאָס. 2002, 2009, 2020 און 2077) זענען קאָנדזשוגאַטעד מיט סטרעפּטאַווידין (SA) צו קריגן מולטימעריק פארמען אַ ביסל מימיקינג פאַגע דזשיאַמאַטרי.דעם פֿאָרמאַט אויך ערלויבט אונדז צו מעסטן סאַ ויסשטעלן אין בלוט און סערעבראָספּינאַל פליסיק ווי לאַסט-טראַנספּאָרטינג פּראָטעין פּעפּטיידז.ימפּאָרטאַנטלי, פאַגע דאַטן קען אָפט זיין ריפּראַדוסט ווען סינטעטיש פּעפּטיידז זענען אַדמינאַסטערד אין דעם סאַ-קאָנדזשוגאַטעד פֿאָרמאַט (Fig. 3e).די סקראַמבאַלד פּעפּטיידז האָבן ווייניקער ערשט ויסשטעלן און פאַסטער CSF רעשוס מיט אַנדיטעקטאַבאַל לעוועלס אין 48 שעה.צו באַקומען ינסייט אין די עקספּרעס פּאַטווייז פון די פּעפּטייד פאַגע קלאָונז אין די CSF פּלאַץ, מיר אַנאַלייזד די לאָוקאַלאַזיישאַן פון יחיד פאַגע פּעפּטייד היץ מיט ימיונהיסטאָקעמיסטרי (IHC) צו גלייך דעטעקט פאַג פּאַרטיקאַלז 1 שעה נאָך ינטראַווינאַס ינדזשעקשאַן אין וויוואָו.נאָוטאַבלי, קלאָונז #2002, #2077 און #2009 קען זיין דיטעקטאַד דורך שטאַרק סטיינינג אין מאַרך קאַפּאַלעריז, בשעת קאָנטראָל פאַגע (#1779) און קלאָון #2020 זענען נישט דיטעקטאַד (סופּפּלעמענטאַרי פיגור 8).דאָס סאַגדזשעסץ אַז די פּעפּטיידז ביישטייערן צו די ווירקונג אויף דעם מאַרך דווקא דורך אַריבער די BBB.ווייַטער דיטיילד אַנאַליסיס איז פארלאנגט צו פּרובירן דעם כייפּאַטאַסאַס, ווייַל די BSCFB מאַרשרוט קען אויך זיין ינוואַלווד.ווען קאַמפּערינג די אַמינאָ זויער סיקוואַנס פון די מערסט ענריטשט קלאָון (#2002) מיט אנדערע אויסגעקליבן פּעפּטיידז, עס איז געווען באמערקט אַז עטלעכע פון ​​זיי האָבן ענלעך אַמינאָ זויער יקסטענשאַנז, וואָס קען אָנווייַזן אַ ענלעך אַריבערפירן מעקאַניזאַם (Fig. 3f).
רעכט צו זיין יינציק פּלאַזמע פּראָפיל און אַ באַטייטיק פאַרגרעסערן אין CSF איבער צייַט, פאַג אַרויסווייַזן קלאָון # 2077 איז געווען ווייַטער יקספּלאָרד איבער אַ מער 48-שעה צייט און איז ביכולת צו רעפּראָדוצירן די גיך פאַרגרעסערן אין CSF באמערקט אין פאַרבאַנד מיט סוסטאַינעד סאַ לעוועלס (Fig. 4 אַ).וועגן אנדערע יידענאַפייד פאַג קלאָונז, #2077 שטארק סטיינד פֿאַר מאַרך קאַפּאַלעריז און געוויזן באַטייטיק קאָלאָקאַליזאַטיאָן מיט קאַפּאַלערי מאַרקער לעקטין ווען וויוד אין העכער האַכלאָטע און עפשער עטלעכע סטיינינג אין די פּאַרענטשימאַל פּלאַץ (פיגורע 4ב).צו פאָרשן צי פּעפּטייד-מעדיאַטעד פאַרמאַקאַלאַדזשיקאַל יפעקץ קען זיין באקומען אין די CNS, מיר דורכגעקאָכט אַן עקספּערימענט אין וואָס ביאָטינילאַטעד ווערסיעס פון איך) די #2077 דורכפאָר פּעפּטייד און וו) די BACE1 ינכיבאַטער פּעפּטייד זענען געמישט מיט סאַ אין צוויי פאַרשידענע ריישיאָוז.פֿאַר איין קאָמבינאַציע מיר געוויינט בלויז די BACE1 פּעפּטייד ינכיבאַטער און פֿאַר די אנדערע מיר געוויינט אַ 1:3 פאַרהעלטעניש פון BACE1 פּעפּטייד ינכיבאַטער צו #2077 פּעפּטייד.ביידע סאַמפּאַלז זענען אַדמינאַסטערד ינטראַווינאַסלי און בלוט און סערעבראָספּינאַל פליסיק לעוועלס פון ביתא-אַמילאָיד פּעפּטייד 40 (אַבעטאַ40) זענען געמאסטן איבער צייַט.Abeta40 איז געמאסטן אין CSF ווייַל עס ריפלעקס BACE1 ינאַבישאַן אין די מאַרך פּאַרענטשימאַ.ווי דערוואַרט, ביידע קאַמפּלעקסאַז באטייטיק רידוסט בלוט לעוועלס פון אַבעטאַ40 (פיגורע 4 ק, ד).אָבער, בלויז סאַמפּאַלז מיט אַ געמיש פון פּעפּטייד נומ.2077 און אַ ינכיבאַטער פון די BACE1 פּעפּטייד קאָנדזשוגאַטעד צו סאַ געפֿירט אַ באַטייטיק פאַרקלענערן אין Abeta40 אין די סערעבראָספּינאַל פליסיק (Fig. 4c).די דאַטן ווייַזן אַז פּעפּטייד נומ.2077 איז ביכולת צו אַריבערפירן די 60 kDa SA פּראָטעין אין די CNS און אויך ינדוסיז פאַרמאַקאַלאַדזשיקאַל יפעקץ מיט SA-קאָנדזשוגאַטעד ינכיבאַטערז פון די BACE1 פּעפּטייד.
(אַ) קלאָנאַל ינדזשעקשאַן (2 × 10 פאַגעס / כייַע) פון ט 7 פאַדזש וואָס ווייַזן לאַנג-טערמין פאַרמאַקאָקינעטיק פּראָופיילז פון CSF פּעפּטייד # 2077 (RLSSVDSDLSGC) און אַנינדזשעקטיד קאָנטראָל פאַדזש (# 1779) אין לפּחות דריי סענטימעטער-ינטאַבייטיד ראַץ.(ב) קאָנפאָקאַל מיקראָסקאָפּיק בילד פון רעפּריזענאַטיוו קאָרטאַקאַל מיקראָוועססעלס אין פאַגע-ינדזשעקטיד ראַץ (2 × 10 10 פאַגעס / כייַע) ווייזונג קאַונטערסטיינינג פון פּעפּטייד #2077 און כלים (לעקטין).די פאַג קלאָונז זענען אַדמינאַסטערד צו 3 ראַץ און ערלויבט צו סערקיאַלייט פֿאַר 1 שעה איידער פּערפוסיאָן.סייכל זענען סעקשאַנז און סטיינד מיט פּאָליקלאָנאַל FITC-לייבאַלד אַנטיבאָדיעס קעגן די ט 7 פאַגע קאַפּסיד.צען מינוט איידער פּערפוסיאָן און סאַבסאַקוואַנט פיקסיישאַן, DyLight594-לייבאַלד לעקטין איז אַדמינאַסטערד ינטראַווינאַסלי.פלורעסאַנט בילדער וואָס ווייַזן לעקטין סטיינינג (רויט) פון די לומינאַל זייַט פון מיקראָוועססעלס און פאַגעס (גרין) אין די לומען פון קאַפּאַלעריז און פּעריוואַסקיאַלער מאַרך געוועב.די וואָג באַר קאָראַספּאַנדז צו 10 μם.(C, ד) ביאָטינילאַטעד BACE1 ינכיבאַטערי פּעפּטייד אַליין אָדער אין קאָמבינאַציע מיט ביאָטינילאַטעד דורכפאָר פּעפּטייד #2077 איז קאַפּאַלד צו סטרעפּטאַווידין נאכגעגאנגען דורך ינטראַווינאַס ינדזשעקשאַן פון בייַ מינדסטער דריי קאַנאַלייטיד סענטימעטער ראַץ (10 מג סטרעפּטאַווידין / קג).BACE1 פּעפּטייד ינכיבאַטער-מעדיאַטעד רעדוקציע אין Aβ40 איז געמאסטן דורך Aβ1-40 ELISA אין בלוט (רויט) און סערעבראָספּינאַל פליסיק (מאַראַנץ) אין די אנגעוויזן צייט פונקטן.פֿאַר בעסער קלעריטי, אַ דאַטיד שורה איז ציען אויף די גראַפיק אין אַ וואָג פון 100%.(C) פּראָצענט רעדוקציע אין Aβ40 אין בלוט (רויט טרייאַנגגאַלז) און סערעבראָספּינאַל פליסיק (מאַראַנץ טריאַנגלעס) אין ראַץ באהאנדלט מיט סטרעפּטאַווידין קאָנדזשוגאַטעד צו דורכפאָר פּעפּטייד #2077 און BACE1 ינכיבאַטאָרי פּעפּטייד אין אַ 3: 1 פאַרהעלטעניש.(ד) פּראָצענט רעדוקציע אין בלוט Aβ40 (רויט קרייזן) און סערעבראָספּינאַל פליסיק (מאַראַנץ קרייזן) פון ראַץ באהאנדלט מיט סטרעפּטאַווידין קאַפּאַלד מיט אַ BACE1 ינכיבאַטערי פּעפּטייד בלויז.די Aβ קאַנסאַנטריישאַן אין די קאָנטראָל איז געווען 420 פּג / מל (נאָרמאַל דיווייישאַן = 101 פּג / מל).
פאַגע אַרויסווייַזן איז הצלחה געווענדט אין עטלעכע געביטן פון ביאָמעדיקאַל פאָרשונג17.דער אופֿן איז געניצט פֿאַר וואַסקיאַלער דייווערסיטי שטודיום אין וויוואָו 18,19 און שטודיום טאַרגאַטינג סערעבראַל כלים 20,21,22,23,24,25,26.אין דעם לערנען, מיר עקסטענדעד די אַפּלאַקיישאַן פון דעם סעלעקציע אופֿן ניט בלויז צו די דירעקט לעגיטימאַציע פון ​​פּעפּטיידז טאַרגאַטינג סערעבראַל כלים, אָבער אויך צו די ופדעקונג פון קאַנדאַדייץ מיט אַקטיוו אַריבערפירן פּראָפּערטיעס צו קרייַז די בלוט-מאַרך שלאַבאַן.מיר איצט באַשרייַבן די אַנטוויקלונג פון אַן אין וויוואָו סעלעקציע פּראָצעדור אין CM ינטובאַטעד ראַץ און באַווייַזן זייַן פּאָטענציעל צו ידענטיפיצירן פּעפּטיידז מיט CSF כאָומינג פּראָפּערטיעס.מיט די ט 7 פאַגע מיט אַ ביבליאָטעק פון 12-מער טראַפ פּעפּטיידז, מיר זענען ביכולת צו באַווייַזן אַז די ט 7 פאַגע איז קליין גענוג (בעערעך 60 נם אין דיאַמעטער) 10 צו זיין צוגעפאסט צו די בלוט-מאַרך שלאַבאַן, און דערמיט גלייך אַריבער די בלוט-מאַרך שלאַבאַן אָדער טשאָראָיד פּלעקסוס.מיר באמערקט אַז CSF כאַרוואַסטינג פון קאַנאַלייטיד CM ראַץ איז געווען אַ געזונט קאַנטראָולד אין וויוואָו פאַנגקשאַנאַל זיפּונג אופֿן, און אַז די יקסטראַקטיד פאַגע איז ניט בלויז געבונדן צו די וואַסקיאַלער, אָבער אויך פאַנגקשאַנד ווי אַ טראַנספּאָרטער אַריבער די בלוט-מאַרך שלאַבאַן.דערצו, דורך סיימאַלטייניאַסלי קאַלעקטינג בלוט און אַפּלייינג HTS צו CSF און בלוט-דערייווד פאַגעס, מיר באשטעטיקט אַז אונדזער ברירה פון CSF איז נישט ינפלואַנסט דורך בלוט ענריטשמענט אָדער טויגיקייט פֿאַר יקספּאַנשאַן צווישן ראָונדס פון סעלעקציע.אָבער, די בלוט אָפּטייל איז טייל פון די סעלעקציע פּראָצעדור, ווייַל פאַגעס וואָס קענען דערגרייכן די CSF אָפּטייל מוזן בלייַבנ לעבן און סערקיאַלייט אין די בלאַדסטרים לאַנג גענוג צו באַרייַכערן זיך אין דעם מאַרך.אין סדר צו עקסטראַקט פאַרלאָזלעך סיקוואַנס אינפֿאָרמאַציע פון ​​רוי HTS דאַטן, מיר ימפּלאַמענאַד פילטערס צוגעפאסט צו פּלאַטפאָרמע-ספּעציפיש סיקוואַנסינג ערראָרס אין די אַנאַליסיס וואָרקפלאָוו.דורך ינקאָרפּערייטינג קינעטיק פּאַראַמעטערס אין די זיפּונג אופֿן, מיר באשטעטיקט די גיך פאַרמאַקאָקינעטיקס פון ווילד-טיפּ ט 7 פאַגעס (ט½ ~ 28 מין) אין בלוט 24, 27, 28 און אויך באשלאסן זייער האַלב-לעבן אין סערעבראָספּינאַל פליסיק (ט½ ~ 26 מין) פּער מינוט).טראָץ ענלעך פאַרמאַקאָקינעטיק פּראָופיילז אין בלוט און CSF, בלויז 0.001% פון די בלוט קאַנסאַנטריישאַן פון פאַדזש קען זיין דיטעקטאַד אין CSF, וואָס ינדיקייץ נידעריק הינטערגרונט מאָביליטי פון ווילד-טיפּ ט 7 פאַגע אַריבער די בלוט-מאַרך שלאַבאַן.די אַרבעט כיילייץ די וויכטיקייט פון דער ערשטער קייַלעכיק סעלעקציע ווען ניצן אין וויוואָו פּאַנינג סטראַטעגיעס, ספּעציעל פֿאַר פאַגע סיסטעמען וואָס זענען ראַפּאַדלי קלירד פון די סערקיאַליישאַן, ווייַל ווייניק קלאָונז זענען ביכולת צו דערגרייכן די CNS אָפּטייל.אזוי, אין דער ערשטער קייַלעכיק, די רעדוקציע אין ביבליאָטעק דייווערסיטי איז געווען זייער גרויס, ווייַל בלויז אַ לימיטעד נומער פון קלאָונז זענען יווענטשאַוואַלי געזאמלט אין דעם זייער שטרענג CSF מאָדעל.דעם אין וויוואָו פּאַנינג סטראַטעגיע ינקלודעד עטלעכע סעלעקציע סטעפּס אַזאַ ווי אַקטיוו אַקיומיאַליישאַן אין די CSF אָפּטייל, קלאָון ניצל אין די בלוט אָפּטייל, און גיך באַזייַטיקונג פון ט 7 פאַגע קלאָונז פון די בלוט אין דער ערשטער 10 מינוט (Fig. 1 ד און סאַפּלאַמענערי פייג. 4 ם).).אזוי, נאָך דער ערשטער קייַלעכיק, פאַרשידענע פאַג קלאָונז זענען יידענאַפייד אין CSF, כאָטש דער זעלביקער ערשט בעקן איז געניצט פֿאַר יחיד אַנימאַלס.דאָס סאַגדזשעסץ אַז קייפל שטרענג סעלעקציע סטעפּס פֿאַר מקור לייברעריז מיט אַ גרויס נומער פון ביבליאָטעק מיטגלידער רעזולטאַט אין אַ באַטייטיק רעדוקציע אין דייווערסיטי.דעריבער, טראַפ - געשעענישן וועט ווערן אַ ינטאַגראַל טייל פון דער ערשט סעלעקציע פּראָצעס, זייער ינפלואַנסינג דער רעזולטאַט.עס איז מסתּמא אַז פילע פון ​​די קלאָונז אין דער אָריגינעל ביבליאָטעק האָבן אַ זייער ענלעך פּראַפּענסיטי פון CSF ענריטשמענט.אָבער, אפילו אונטער די זעלבע יקספּערמענאַל טנאָים, סעלעקציע רעזולטאַטן קען זיין אַנדערש רעכט צו דער קליין נומער פון יעדער באַזונדער קלאָון אין די ערשט בעקן.
די מאָוטיפס ענריטשט אין CSF זענען אַנדערש פון די אין די בלוט.ינטערעסטינגלי, מיר באמערקט די ערשטער יבעררוק צו גלייסין-רייַך פּעפּטיידז אין די בלוט פון יחיד אַנימאַלס.(פיג. קסנומקסג, סאַפּלאַמענטערי פיגס. קסנומקסע, קסנומקסף).פאַגע מיט גלייסין פּעפּטיידז קען זיין מער סטאַביל און ווייניקער מסתּמא צו זיין גענומען אויס פון סערקיאַליישאַן.אָבער, די גלייסין-רייַך פּעפּטיידז זענען נישט דיטעקטאַד אין די סערעבראָספּינאַל פליסיק סאַמפּאַלז, סאַגדזשעסטינג אַז די קוראַטעד לייברעריז דורכגעגאנגען צוויי פאַרשידענע סעלעקציע סטעפּס: איינער אין די בלוט און אנדערן ערלויבט צו אַקיומיאַלייט אין די סערעבראָספּינאַל פליסיק.CSF-ענריטשט קלאָונז ריזאַלטינג פון דער פערט קייַלעכיק פון סעלעקציע האָבן שוין יקסטענסיוולי טעסטעד.קימאַט אַלע פון ​​די ינדיווידזשואַלי טעסטעד קלאָונז זענען באשטעטיקט צו זיין ענריטשט אין CSF קאַמפּערד מיט ליידיק קאָנטראָל פאַגע.איין פּעפּטייד שלאָגן (#2077) איז געווען יגזאַמאַנד אין מער דעטאַל.עס האט געוויזן אַ מער פּלאַזמע האַלב-לעבן קאַמפּערד מיט אנדערע היץ (פיגורע 3 ד און סאַפּלאַמענערי פיגור 7), און ינטערעסטינגלי, דעם פּעפּטייד קאַנטיינד אַ סיסטינע רעזאַדו אין די C-טערמינוס.עס איז לעצטנס געוויזן אַז די אַדישאַן פון סיסטינע צו פּעפּטיידז קענען פֿאַרבעסערן זייער פאַרמאַקאָקינעטיק פּראָפּערטיעס דורך ביינדינג צו אַלבומין 29 .דאָס איז דערווייַל אומבאַקאַנט פֿאַר פּעפּטייד #2077 און ריקווייערז ווייַטער לערנען.עטלעכע פּעפּטיידז געוויזן אַ וואַלאַנס-אָפענגיקייַט אין CSF ענריטשמענט (דאַטן ניט געוויזן), וואָס קען זיין שייַכות צו די געוויזן ייבערפלאַך דזשיאַמאַטרי פון די T7 קאַפּסיד.די ט 7 סיסטעם מיר געוויינט געוויזן 5-15 קאפיעס פון יעדער פּעפּטייד פּער פאַדזש פּאַרטאַקאַל.יהק איז געווען דורכגעקאָכט אויף קאַנדידאַט פירן פאַג קלאָונז ינדזשעקטיד ינטראַווינאַסלי אין די סערעבראַל קאָרטעקס פון ראַץ (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 8).די דאַטן געוויזן אַז בייַ מינדסטער דריי קלאָונז (נום 2002, נומ 2009 און נומ 2077) ינטעראַקטיד מיט די BBB.עס בלייבט צו באַשליסן צי די BBB ינטעראַקשאַן רעזולטאטן אין די אַקיומיאַליישאַן פון CSF אָדער די באַוועגונג פון די קלאָונז גלייַך צו די BCSFB.ימפּאָרטאַנטלי, מיר ווייַזן אַז די אויסגעקליבן פּעפּטיידז ריטיין זייער CSF אַריבערפירן קאַפּאַציטעט ווען סינטאַסייזד און געבונדן צו די פּראָטעין לאַסט.בינדינג פון N-וואָקזאַל ביאָטינילאַטעד פּעפּטיידז צו סאַ יסענשאַלי ריפּיץ די רעזולטאַטן באקומען מיט זייער ריספּעקטיוו פאַג קלאָונז אין בלוט און סערעבראָספּינאַל פליסיק (Fig. 3e).צום סוף, מיר ווייַזן אַז פירן פּעפּטייד #2077 איז ביכולת צו העכערן די מאַרך קאַמף פון אַ ביאָטינילאַטעד פּעפּטייד ינכיבאַטער פון BACE1 קאָנדזשוגאַטעד צו SA, קאָזינג פּראַנאַונסט פאַרמאַקאָדינאַמיק יפעקץ אין די CNS דורך באטייטיק רידוסינג Abeta40 לעוועלס אין CSF (Fig. 4).מיר זענען נישט ביכולת צו ידענטיפיצירן קיין האָמאָלאָגועס אין די דאַטאַבייס דורך דורכפירן אַ פּעפּטייד סיקוואַנס האָמאָלאָגי זוכן פון אַלע היץ.עס איז וויכטיק צו טאָן אַז די גרייס פון די T7 ביבליאָטעק איז בעערעך 109, בשעת די טעאָרעטיש ביבליאָטעק גרייס פֿאַר 12-מערס איז 4 X 1015. דעריבער, מיר האָבן בלויז אויסגעקליבן אַ קליין בראָכצאָל פון די דייווערסיטי פּלאַץ פון די 12-מער פּעפּטייד ביבליאָטעק, וואָס קען מיינען אַז מער אָפּטימיזעד פּעפּטיידז קענען זיין יידענאַפייד דורך די יידענאַפייד פּלאַץ פון די אַדדזשאַסענט סיקוואַנסיז.כייפּאַטעטיקלי, איינער פון די סיבות וואָס מיר האָבן נישט געפֿונען קיין נאַטירלעך האָמאָלאָגועס פון די פּעפּטיידז קען זיין דיסאַלעקשאַן בעשאַס עוואָלוציע צו פאַרמייַדן די אַנקאַנטראָולד פּאָזיציע פון ​​זיכער פּעפּטייד מאָוטיפס אין דעם מאַרך.
צוזאַמען, אונדזער רעזולטאַטן צושטעלן אַ יקער פֿאַר צוקונפֿט אַרבעט צו ידענטיפיצירן און קעראַקטערייז די אַריבערפירן סיסטעמען פון די סערעבראָוואַסקולאַר שלאַבאַן אין וויוואָו אין מער דעטאַל.די יקערדיק סעטאַפּ פון דעם אופֿן איז באזירט אויף אַ פאַנגקשאַנאַל סעלעקציע סטראַטעגיע אַז ניט בלויז יידענאַפייד קלאָונז מיט סערעבראַל וואַסקיאַלער ביינדינג פּראָפּערטיעס, אָבער אויך כולל אַ קריטיש שריט אין וואָס מצליח קלאָונז האָבן ינטרינסיק טעטיקייט צו קרייַז בייאַלאַדזשיקאַל באַריערז אין וויוואָו אין די CNS אָפּטייל.איז צו דערקלערן די מעקאַניזאַם פון אַריבערפירן פון די פּעפּטיידז און זייער ייבערהאַנט פֿאַר ביינדינג צו די מיקראָוואַסקולאַטורע ספּעציפיש צו די מאַרך געגנט.דאָס קען פירן צו דער ופדעקונג פון נייַע פּאַטווייז פֿאַר די אַריבערפירן פון די BBB און ראַסעפּטערז.מיר דערוואַרטן אַז די יידענאַפייד פּעפּטיידז קענען גלייך בינדן צו סערעבראָוואַסקולאַר ראַסעפּטערז אָדער צו סערקיאַלייטינג ליגאַנדז טראַנספּאָרטאַד דורך די BBB אָדער BCSFB.די פּעפּטייד וועקטאָרס מיט CSF אַריבערפירן טעטיקייט דיסקאַווערד אין דעם אַרבעט וועט זיין ווייַטער ינוועסטאַגייטאַד.מיר זענען דערווייַל ינוועסטאַגייטינג די מאַרך ספּעסיפיסיטי פון די פּעפּטיידז פֿאַר זייער פיייקייט צו קרייַז די BBB און / אָדער BCSFB.די נייַע פּעפּטיידז וועט זיין גאָר ווערטפול מכשירים פֿאַר די פּאָטענציעל ופדעקונג פון נייַע ראַסעפּטערז אָדער פּאַטווייז און פֿאַר דער אַנטוויקלונג פון נייַע העכסט עפעקטיוו פּלאַטפאָרמס פֿאַר די עקספּרעס פון מאַקראָמאָלעקולעס, אַזאַ ווי ביאָלאָגיקס, צו דעם מאַרך.
קאַננולירן די גרויס סיסטערנאַ (קם) מיט אַ מאַדאַפאַקיישאַן פון די פריער דיסקרייבד אופֿן.אַנעסטעטיזעד וויסטאַר ראַץ (200-350 ג) זענען מאָונטעד אויף אַ סטערעאָטאַקסיק אַפּאַראַט און אַ מידיאַן ינסיזשאַן איז געמאכט איבער די שייווד און אַסעפּטיקלי צוגעגרייט סקאַלפּ צו ויסשטעלן די שאַרבן.בויער צוויי האָלעס אין דער געגנט פון דער אויבערשטער שער און פאַסטן די פיקסיר סקרוז אין די האָלעס.אַן נאָך לאָך איז דרילד אין די לאַטעראַל אַקסיפּיטאַל קאַם פֿאַר סטערעאָטאַקטיק גיידאַנס פון אַ ומבאַפלעקט שטאָל קאַננולאַ אין די סענטימעטער.צולייגן דענטאַל צעמענט אַרום די קאַנולאַ און באַוואָרענען מיט סקרוז.נאָך פאָטאָ-קיורינג און צעמענט כאַרדאַנינג, די הויט ווונד איז געווען פארמאכט מיט 4/0 סופּראַמיד סוטשער.געהעריק פּלייסמאַנט פון די קאַננולאַ איז באשטעטיקט דורך ספּאַנטייניאַס ליקאַדזש פון סערעבראָספּינאַל פליסיק (CSF).אַראָפּנעמען די שטשור פון די סטערעאָטאַקסיק אַפּאַראַט, באַקומען צונעמען פּאָסטאָפּעראַטיווע זאָרגן און ווייטיק פאַרוואַלטונג, און לאָזן עס צו צוריקקריגן פֿאַר בייַ מינדסטער איין וואָך ביז וואונדער פון בלוט זענען באמערקט אין די סערעבראָספּינאַל פליסיק.וויסטאַר ראַץ (Crl: WI/Han) זענען באקומען פון טשאַרלעס טייך (פֿראַנקרייַך).אַלע ראַץ זענען געהאלטן אונטער ספּעציפיש פּאַטאַדזשאַן-פֿרייַ טנאָים.אַלע כייַע יקספּעראַמאַנץ זענען באוויליקט דורך די וועטערינאַרי אָפפיסע פון ​​די שטאָט פון באַסעל, שווייץ, און זענען דורכגעקאָכט אין לויט מיט אַנימאַל ליסענסע נומ 2474 (אַסעסמאַנט פון אַקטיוו מאַרך טראַנספּאָרט דורך מעסטן לעוועלס פון טעראַפּיוטיק קאַנדאַדייץ אין די סערעבראָספּינאַל פלויד און מאַרך פון שטשור).
דזשענטלי האַלטן די שטשור באַוווסטזיניק מיט די CM קאַננולאַ אין האַנט.אַראָפּנעמען דאַטוראַ פון די קאַננולאַ און קלייַבן 10 μל פון ספּאַנטייניאַסלי פלאָוינג סערעבראָספּינאַל פליסיק.זינט די פּאַטענסי פון די קאַננולאַ איז לעסאָף קאַמפּראַמייזד, בלויז קלאָר סערעבראָספּינאַל פליסיק סאַמפּאַלז מיט קיין זאָגן פון בלוט קאַנטאַמאַניישאַן אָדער דיסקאַלעריישאַן זענען אַרייַנגערעכנט אין דעם לערנען.אין פּאַראַלעל, בעערעך 10-20 μל בלוט איז גענומען פון אַ קליין ינסיזשאַן אין די שפּיץ פון די עק אין טובז מיט העפּאַרין (סיגמאַ-אַלדריך).CSF און בלוט זענען געזאמלט אין פאַרשידן צייט פונקטן נאָך ינטראַווינאַס ינדזשעקשאַן פון ט 7 פאַגע.בעערעך 5-10 μל פליסיק איז אַוועקגענומען איידער יעדער CSF מוסטער איז געזאמלט, וואָס קאָראַספּאַנדז צו די טויט באַנד פון די קאַטאַטער.
ליבראַריעס זענען דזשענערייטאַד מיט די T7Select 10-3b וועקטאָר ווי דיסקרייבד אין די T7Select סיסטעם מאַנואַל (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996).בעקיצער, אַ ראַנדאָם 12-מער דנאַ אַרייַנלייגן איז געווען סינטאַסייזד אין די פאלגענדע פֿאָרמאַט:
די NNK קאָדאָן איז געניצט צו ויסמיידן טאָפּל סטאָפּ קאָדאָנס און אָוווערעקספּרעססיאָן פון אַמינאָ זויער אין די אַרייַנלייגן.N איז אַ מאַניואַלי געמישט עקווימאָלאַר פאַרהעלטעניש פון יעדער נוקלעאָטידע, און K איז אַ מאַניואַלי געמישט עקווימאָלאַר פאַרהעלטעניש פון אַדענינע און סיטאָסין נוקלעאָטידעס.איין סטראַנדיד מקומות זענען קאָנווערטעד צו טאָפּל סטראַנדיד דנאַ דורך ווייַטער ינגקיוביישאַן מיט דנטפּ (נאָוואַגען) און קלענאָוו ענזיים (ניו ענגלאַנד ביאָלאַבס) אין קלענאָוו באַפער (ניו ענגלאַנד ביאָלאַבס) פֿאַר 3 שעה בייַ 37 ° סי.נאָך דער אָפּרוף, טאָפּל-סטראַנדיד דנאַ איז ריקאַווערד דורך עטאָה אָפּזאַץ.די ריזאַלטינג דנאַ איז געווען דיידזשעסטיד מיט ריסטריקשאַן ענזימעס EcoRI און HindIII (ביידע פֿון Roche).די קלעאַוועד און פּיוראַפייד (QIAquick, Qiagen) אַרייַנלייגן (T4 ליגאַסע, ניו ענגלאַנד ביאָלאַבס) איז דאַן ליגייטיד אין-ראַם אין אַ פאַר-קלעאַוועד ט 7 וועקטאָר נאָך אַמינאָ זויער 348 פון די 10 ב קאַפּסיד דזשין.ליגאַטיאָן ריאַקשאַנז זענען ינגקיובייטיד בייַ 16 ° סי פֿאַר 18 שעה איידער אין וויטראָ פּאַקקאַגינג.פאַגע פּאַקקאַגינג אין וויטראָ איז דורכגעקאָכט לויט די ינסטראַקשאַנז צוגעשטעלט מיט די T7Select 10-3b קלאָונינג קיט (נאָוואַגען) און די פּאַקקאַגינג לייזונג איז אַמפּלאַפייד אַמאָל צו ליסיס ניצן Escherichia coli (BLT5615, Novagen).די ליסאַטעס זענען סענטריפוגעד, טיטרייטיד און פאַרפרוירן בייַ -80 ° סי ווי אַ לאַגער לייזונג פון גליסעראָל.
דירעקט פּקר אַמפּלאַפאַקיישאַן פון פאַג וועריאַבאַל מקומות אַמפּלאַפייד אין יויך אָדער טעלער ניצן פּראַפּרייאַטערי 454 / ראָטשע-אַמפּליקאָן פוסיאָן פּרימערז.די פאָרויס פוסיאָן אָנפאַנגער כּולל סיקוואַנסיז פלאַנגקינג די בייַטעוודיק געגנט (NNK) 12 (טעמפּל ספּעציפֿיש), GS FLX טיטאַניום אַדאַפּטער א, און אַ פיר-באַזע ביבליאָטעק שליסל סיקוואַנס (TCAG) (סופּפּלעמענטאַרי פיגור 1אַ):
דער פאַרקערט פוסיאָן אָנפאַנגער אויך כּולל ביאָטין אַטאַטשט צו כאַפּן קרעלן און די GS FLX טיטאַניום אַדאַפּטער ב פארלאנגט פֿאַר קלאָונאַל אַמפּלאַפאַקיישאַן בעשאַס ימאַלשאַן פּקר:
די אַמפּליקאָנס זענען דערנאָך אונטערטעניק צו 454 / ראָטשע פּיראָסעקווענסינג לויט די 454 GS-FLX טיטאַניום פּראָטאָקאָל.פֿאַר מאַנואַל סאַנגער סיקוואַנסינג (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), T7 פאַגע דנאַ איז אַמפּלאַפייד דורך פּקר און סיקוואַנסעד מיט די פאלגענדע אָנפאַנגער פּערז:
ינסערץ פון יחיד פּלאַקס זענען אונטערטעניק צו פּקר אַמפּלאַפאַקיישאַן מיט די Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (לויט די ינסטראַקשאַנז פון דער פאַבריקאַנט).דורכפירן אַ הייס אָנהייב (10 מינוט ביי 95 °C) און 35 בוסט סייקאַלז (50 ס ביי 95 °C, 1 מינוט ביי 50 °C, און 1 מינוט ביי 72 °C).
פאַגע פון ​​לייברעריז, ווילד-טיפּ פאַג, פאַג רעסקיוד פון CSF און בלוט, אָדער יחיד קלאָונז זענען אַמפּלאַפייד אין Escherichia coli BL5615 אין טב יויך (Sigma Aldrich) אָדער אין 500 סענטימעטער 2 קיילים (Thermo Scientific) פֿאַר 4 שעה ביי 37 ° C.פאַגע זענען יקסטראַקטיד פון די פּלאַטעס דורך רינסינג די פּלאַטעס מיט Tris-EDTA באַפער (Fluka Analytical) אָדער דורך קאַלעקטינג די פּלאַקס מיט סטערילע פּיפּעטטע עצות.פאַגע איז אפגעזונדערט פון קולטור סופּערנאַנטאַנט אָדער יקסטראַקשאַן באַפער מיט איין קייַלעכיק פון פּאַליעטאַלין גלייקאָל (PEG 8000) אָפּזאַץ (פּראָמעגאַ) און ריסאַספּאַנדיד אין טריס-עדטאַ באַפער.
די אַמפּלאַפייד פאַגע איז געווען אונטערטעניק צו 2-3 ראָונדס פון ענדאָטאָקסין באַזייַטיקונג ניצן ענדאָטאָקסין באַזייַטיקונג קרעלן (Miltenyi Biotec) איידער ינטראַווינאַס (יוו) ינדזשעקשאַן (500 μל / כייַע).אין דער ערשטער קייַלעכיק, 2 × 1012 פאַגעס זענען באַקענענ;אין די רגע, 2 × 1010 פאַגעס;אין די דריט און פערט סעלעקציע ראָונדס, 2 × 109 פאַגעס פּער כייַע.פאַגע אינהאַלט אין CSF און בלוט סאַמפּאַלז געזאמלט אין די געוויזן צייט איז באשלאסן דורך פּלאַק קאַונטינג לויט די פאַבריקאַנט ס ינסטראַקשאַנז (T7Select סיסטעם מאַנואַל).פאַגע סעלעקציע איז דורכגעקאָכט דורך ינטראַווינאַס ינדזשעקשאַן פון פּיוראַפייד לייברעריז אין די עק אָדער דורך שייַעך-ינדזשעקשאַן פון פאַגע יקסטראַקטיד פון CSF פון די פריערדיקע סעלעקציע קייַלעכיק, און סאַבסאַקוואַנט כאַרוואַסס זענען דורכגעקאָכט ביי 10 מינוט, 30 מינוט, 60 מינוט, 90 מינוט, 120 מינוט, 180 מינוט און 240 מינוט סאַמפּאַלז.א גאַנץ פון פיר ראָונדס פון אין וויוואָו פּאַנינג זענען געפירט אין וואָס די צוויי אויסגעקליבן צווייגן זענען סעפּעראַטלי סטאָרד און אַנאַלייזד בעשאַס די ערשטער דריי ראָונדס פון סעלעקציע.אַלע פאַגע ינסערץ יקסטראַקטיד פון CSF פון די ערשטער צוויי ראָונדס פון סעלעקציע זענען אונטערטעניק צו 454 / ראָטשע פּיראָסעקווענסינג, בשעת אַלע קלאָונז יקסטראַקטיד פון CSF פון די לעצטע צוויי ראָונדס פון סעלעקציע זענען מאַניואַלי סיקוואַנס.אַלע בלוט פאַגעס פון דער ערשטער קייַלעכיק פון סעלעקציע זענען אויך אונטערטעניק צו 454/ראָטשע פּיראָסעקווענסינג.פֿאַר ינדזשעקשאַן פון פאַגע קלאָונז, אויסגעקליבן פאַגעס זענען אַמפּלאַפייד אין E. קאָלי (BL5615) אויף 500 סענטימעטער 2 פּלאַטעס ביי 37 ° C פֿאַר 4 שעה.ינדיווידזשואַלי סעלעקטעד און מאַניואַלי סיקוואַנסעד קלאָונז זענען פּראַפּאַגייטיד אין טב מיטל.נאָך פאַדזש יקסטראַקשאַן, רייניקונג און באַזייַטיקונג פון ענדאָטאָקסין (ווי דיסקרייבד אויבן), 2 × 1010 פאַגעס / כייַע אין 300 μל זענען ינדזשעקטיד ינטראַווינאַסלי אין איין עק אָדער.
פּרעפּראָסעססינג און קוואַליטאַטיווע פֿילטרירונג פון סיקוואַנס דאַטן.רוי 454 / ראָטשע דאַטן איז קאָנווערטעד פון אַ ביינערי נאָרמאַל סטרים מאַפּע פֿאָרמאַט (sff) צו אַ פּעאַרסאָן מענטש ליינעוודיק פֿאָרמאַט (פאַסטאַ) ניצן פאַרקויפער ווייכווארג.ווייַטער פּראַסעסינג פון די נוקלעאָטידע סיקוואַנס איז דורכגעקאָכט מיט פּראַפּרייאַטערי C מגילה און סקריפּס (אַנריליסט ווייכווארג פּעקל) ווי דיסקרייבד אונטן.די אַנאַליסיס פון ערשטיק דאַטן כולל שטרענג מאַלטי-בינע פֿילטרירונג פּראָוסידזשערז.צו פילטער אויס לייענען וואָס האט נישט אַנטהאַלטן אַ גילטיק 12מער אַרייַנלייגן דנאַ סיקוואַנס, די לייענען זענען סאַקווענטשאַלי אַליינד צו אָנהייב פירמע (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), האַלטן פירמע (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) און הינטערגרונט אַרייַנלייגן (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) ניצן די גלאבאלע טעסט נעעדלעמאַן-.אַליינמאַנט אַלאַוינג אַרויף צו 2 ינגקאַנסיסטענסיז פּער אַליינמאַנט31.דעריבער, לייענט אָן אָנהייב און האַלטן טאַגס און לייענען מיט הינטערגרונט ינסערץ, ד"ה, אַליינמאַנץ וואָס יקסיד די ערלויבט נומער פון מיסמאַטשעס, זענען אַוועקגענומען פון דער ביבליאָטעק.ווי פֿאַר די רוען לייענען, די N-mer DNA סיקוואַנס יקסטענדינג פון די אָנהייב צייכן און סאָף איידער די האַלטן צייכן איז יקסידיד פון דער אָריגינעל לייענען סיקוואַנס און ווייַטער פּראַסעסט (דערנאָך ריפערד צו ווי "אַרייַנלייגן").נאָך איבערזעצונג פון די אַרייַנלייגן, דער חלק נאָך דער ערשטער האַלטן קאָדאָן אין די 5′ סוף פון די אָנפאַנגער איז אַוועקגענומען פון די אַרייַנלייגן.אין אַדישאַן, נוקלעאָטידעס וואָס פירן צו דערענדיקט קאָדאָנס אין די 3′ סוף פון די אָנפאַנגער זענען אויך אַוועקגענומען.צו ויסשליסן ינסערץ מיט בלויז הינטערגרונט סיקוואַנסיז, איבערגעזעצט ינסערץ אָנהייב מיט די אַמינאָ זויער מוסטער "PAG" זענען אויך אַוועקגענומען.פּעפּטיידז מיט אַ פּאָסט-טראַנסליישאַנאַל לענג פון ווייניקער ווי 3 אַמינאָ אַסאַדז זענען אַוועקגענומען פון דער ביבליאָטעק.צום סוף, אַראָפּנעמען יבעריקייַט אין די אַרייַנלייגן בעקן און באַשטימען די אָפטקייַט פון יעדער יינציק אַרייַנלייגן.די רעזולטאַטן פון דעם אַנאַליסיס אַרייַנגערעכנט אַ רשימה פון נוקלעאָטידע סיקוואַנסיז (ינסערץ) און זייער (לייענען) פריקוואַנסיז (סופּפּלעמענטאַרי פיגיערז 1c און 2).
גרופע N-mer DNA ינסערץ דורך סיקוואַנס ענלעכקייט: צו עלימינירן 454/Roche-ספּעציפיש סיקוואַנסינג ערראָרס (אַזאַ ווי פּראָבלעמס מיט סיקוואַנסינג האָמאָפּאָלימער יקסטענשאַנז) און באַזייַטיקן ווייניקער וויכטיק רידאַנדאַנסיז, פריער געפילטערט N-mer DNA סיקוואַנס ינסערץ (ינסערץ) זענען אויסגעשטעלט לויט ענלעכקייט.ינסערשאַנז (אַרויף צו 2 ניט-וואָס ריכטן באַסעס ערלויבט) ניצן אַן יטעראַטיוו אַלגערידאַם דיפיינד ווי גייט: ינסערשאַנז זענען אויסגעשטעלט ערשטער דורך זייער אָפטקייַט (העכסטן צו לאָואַסט), און אויב זיי זענען די זעלבע, דורך זייער צווייטיק סאָרט דורך לענג (לאָנגעסט צו שאָרטיסט)).אזוי, די מערסט אָפט און לאָנגעסט ינסערשאַנז דעפינירן דער ערשטער "גרופּע".די גרופּע אָפטקייַט איז באַשטימט צו די שליסל אָפטקייַט.דערנאָך, יעדער ינסערשאַן וואָס איז רוען אין די סאָרטירט רשימה איז געפרואווט צו זיין מוסיף צו די גרופּע דורך אַ פּאָר וויסע נעעדלעמאַן-וונטש אַליינמאַנט.אויב די נומער פון מיסמאַטשאַז, ינסערשאַנז אָדער דילישאַנז אין אַ אַליינמאַנט טוט נישט יקסיד אַ שוועל פון 2, אַ ינסערשאַן איז מוסיף צו די גרופּע, און די קוילעלדיק גרופּע אָפטקייַט איז געוואקסן דורך ווי אָפט די ינסערשאַן איז צוגעגעבן.ינסערץ צוגעגעבן צו אַ גרופּע זענען אנגעצייכנט ווי געוויינט און יקסקלודיד פון ווייַטער פּראַסעסינג.אויב די אַרייַנלייגן סיקוואַנס קענען ניט זיין מוסיף צו אַ שוין יגזיסטינג גרופּע, די אַרייַנלייגן סיקוואַנס איז געניצט צו שאַפֿן אַ נייַע גרופּע מיט די צונעמען אַרייַנלייגן אָפטקייַט און אנגעצייכנט ווי געוויינט.די יטעראַטיאָן ענדס ווען יעדער ינסערשאַן סיקוואַנס איז געניצט צו פאָרעם אַ נייַע גרופּע אָדער קענען זיין אַרייַנגערעכנט אין אַן שוין יגזיסטינג גרופּע.נאָך אַלע, גרופּט ינסערץ קאַנסיסטינג פון נוקלעאָטידעס זענען יווענטשאַוואַלי איבערגעזעצט אין פּעפּטייד סיקוואַנסיז (פּעפּטייד לייברעריז).דער רעזולטאַט פון דעם אַנאַליסיס איז אַ סכום פון ינסערשאַנז און זייער קאָראַספּאַנדינג פריקוואַנסיז וואָס מאַכן די נומער פון קאָנסעקוטיווע לייענען (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 2).
מאָטיף דור: באזירט אויף אַ רשימה פון יינציק פּעפּטיידז, אַ ביבליאָטעק איז באשאפן מיט אַלע מעגלעך אַמינאָ זויער פּאַטערנז (אַאַ) ווי געוויזן אונטן.יעדער מעגלעך מוסטער פון לענג 3 איז יקסטראַקטיד פון די פּעפּטייד און זיין פאַרקערט מוסטער איז צוגעגעבן צוזאמען מיט אַ פּראָסט מאָטיף ביבליאָטעק מיט אַלע פּאַטערנז (טריפּעפּטיידז).ליבראַריעס פון העכסט ריפּעטיטיוו מאָוטיפס זענען סיקוואַנסעד און יבעריקייַט אַוועקגענומען.דערנאָך, פֿאַר יעדער טריפּעפּטייד אין דער מאָטיף ביבליאָטעק, מיר אָפּגעשטעלט פֿאַר זיין בייַזייַן אין דער ביבליאָטעק מיט קאַמפּיוטיישאַנאַל מכשירים.אין דעם פאַל, די אָפטקייַט פון די פּעפּטייד מיט די געפֿונען מאָטיף טריפּעפּטייד איז צוגעגעבן און אַסיינד צו די מאָטיף אין די מאָטיף ביבליאָטעק ("נומער פון מאָוטיפס").דער רעזולטאַט פון מאָטיף דור איז אַ צוויי-דימענשאַנאַל מענגע מיט אַלע פאַנגקשאַנז פון טריפּעפּטיידז (מאָטיפס) און זייער ריספּעקטיוו וואַלועס, וואָס זענען די נומער פון סיקוואַנסינג לייענען וואָס רעזולטאַט אין די קאָראַספּאַנדינג מאָטיף ווען די לייענען זענען געפילטערט, גרופּט און איבערגעזעצט.מעטריקס ווי דיסקרייבד אין דעטאַל אויבן.
נאָרמאַליזיישאַן פון די נומער פון מאָוטיפס און קאָראַספּאַנדינג סקאַטערפּלאָץ: די נומער פון מאָוטיפס פֿאַר יעדער מוסטער איז נאָרמאַלייזד מיט
ווו ni איז די נומער פון לייענען מיט טעמע i.אזוי, ווי רעפּראַזענץ די פּראָצענט אָפטקייַט פון לייענען (אָדער פּעפּטיידז) מיט מאָטיוו איך אין דער מוסטער.P-וואַלועס פֿאַר די ניט-נאָרמאַלייזד נומער פון מאָוטיפס זענען קאַלקיאַלייטיד מיט Fisher ס פּינטלעך פּראָבע.וועגן קאָררעלאָגראַמס פון די נומער פון מאטיוון, ספּעאַרמאַן ס קאָראַליישאַנז זענען קאַלקיאַלייטיד ניצן די נאָרמאַלייזד נומער פון מאטיוון מיט ר.
צו וויזשוואַלייז די אינהאַלט פון אַמינאָ אַסאַדז אין יעדער שטעלע אין די פּעפּטייד ביבליאָטעק, וועב לאָגאָגראַמס 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) זענען באשאפן.ערשטער, די אינהאַלט פון אַמינאָ אַסאַדז אין יעדער שטעלע פון ​​​​די 12-מער פּעפּטייד איז סטאָרד אין אַ 20 × 12 מאַטריץ.דערנאָך, אַ סכום פון 1000 פּעפּטיידז מיט דער זעלביקער קאָרעוו אַמינאָ זויער אינהאַלט אין יעדער שטעלע איז דזשענערייטאַד אין פאַסטאַ-סיקוואַנס פֿאָרמאַט און צוגעשטעלט ווי אַרייַנשרייַב צו וועב-לאָגאָ 3, וואָס דזשענערייץ אַ גראַפיקאַל פאַרטרעטונג פון די קאָרעוו אַמינאָ זויער אינהאַלט אין יעדער שטעלע.פֿאַר אַ געגעבן פּעפּטייד ביבליאָטעק.צו וויזשוואַלייז מולטידימענסיאָנאַל דאַטאַסעץ, היץ מאַפּס זענען באשאפן מיט אַן ינעווייניק דעוועלאָפּעד געצייַג אין ר (ביאָסהעאַטמאַפּ, אַ נאָך-צו-זיין-באפרייט ר פּעקל).די דענדראַגראַמז דערלאנגט אין די היץ מאַפּס זענען קאַלקיאַלייטיד ניצן Ward ס כייעראַרקאַקאַל קלאַסטערינג אופֿן מיט די Euclidian דיסטאַנסע מעטריק.פֿאַר סטאַטיסטיש אַנאַליסיס פון מאָטיוו סקאָרינג דאַטן, P וואַלועס פֿאַר אַננאָרמאַלייזד סקאָרינג זענען קאַלקיאַלייטיד מיט Fisher ס פּינטלעך פּראָבע.P-וואַלועס פֿאַר אנדערע דאַטאַסעץ זענען קאַלקיאַלייטיד אין R מיט Student's t-test אָדער ANOVA.
סעלעקטעד פאַג קלאָונז און פאַגעס אָן ינסערץ זענען ינדזשעקטיד ינטראַווינאַסלי דורך די עק אָדער (2 × 1010 פאַגעס / כייַע אין 300 μל פּבס).צען מינוט איידער פּערפוסיאָן און סאַבסאַקוואַנט פיקסיישאַן, די זעלבע אַנימאַלס זענען ינטראַווינאַסלי ינדזשעקטיד מיט 100 μל פון DyLight594-לייבאַלד לעקטין (Vector Laboratories Inc., DL-1177).60 מינוט נאָך פאַדזש ינדזשעקשאַן, ראַץ זענען פּערפיוזד דורך די האַרץ מיט 50 מל פּבס נאכגעגאנגען דורך 50 מל 4% פּפאַ / פּבס.מאַרך סאַמפּאַלז זענען אַדישנאַלי פאַרפעסטיקט יבערנאַכטיק אין 4% PFA / PBS און סאָוקט אין 30% סוקראָוס יבערנאַכטיק ביי 4 ° C.סאַמפּאַלז זענען בליץ פאַרפרוירן אין די אָקט געמיש.יממונאָהיסטאָטשעמיקאַל אַנאַליסיס פון פאַרפרוירן סאַמפּאַלז איז דורכגעקאָכט אין צימער טעמפּעראַטור אויף 30 μם קריאָסעקטיאָנס אפגעשטעלט מיט 1% BSA און ינקובייטיד מיט פּאָליקלאָנאַל FITC-לייבאַלד אַנטיבאָדיעס קעגן ט 7 פאַגע (נאָוווס נב 600-376 אַ) ביי 4 ° סי.ינגקיובייט יבערנאַכטיק.צום סוף, די סעקשאַנז זענען געוואשן 3 מאל מיט פּבס און יגזאַמאַנד מיט אַ קאַנפאָקאַל לאַזער מיקראָסקאָפּ (Leica TCS SP5).
אַלע פּעפּטיידז מיט אַ מינימום ריינקייַט פון 98% זענען סינטאַסייזד דורך GenScript USA, ביאָטינילאַטעד און ליאָפילייזד.ביאָטין איז געבונדן דורך אַן נאָך דרייַיק גלייסין ספּייסער אין די N-טערמינוס.קאָנטראָלירן אַלע פּעפּטיידז ניצן מאַסע ספּעקטראָמעטרי.
סטרעפּטאַווידין (סיגמאַ ס0677) איז געווען געמישט מיט אַ 5-פאַרלייגן עקווימאָלאַר וידעפדיק פון ביאָטינילאַטעד פּעפּטייד, ביאָטינילאַטעד BACE1 ינכיבאַטערי פּעפּטייד, אָדער אַ קאָמבינאַציע (3: 1 פאַרהעלטעניש) פון ביאָטינילאַטעד BACE1 ינכיבאַטאָרי פּעפּטייד און BACE1 ינכיבאַטאָרי פּעפּטייד אין 5-10% פּסאָבס / 10% פּעפּטייד.1 שעה אין צימער טעמפּעראַטור איידער ינדזשעקשאַן.סטרעפּטאַווידין-קאָנדזשוגאַטעד פּעפּטיידז זענען ינדזשעקטיד ינטראַווינאַסלי אין אַ דאָזע פון ​​10 מג / קג אין איינער פון די עק וועינס פון ראַץ מיט אַ סערעבראַל קאַוואַטי.
די קאַנסאַנטריישאַן פון סטרעפּטאַווידין-פּעפּטייד קאַמפּלעקסאַז איז אַססעססעד דורך עליסאַ.Nunc Maxisorp מיקראָטיטער פּלאַטעס (סיגמאַ) זענען קאָוטאַד יבערנאַכטיק ביי 4 ° C מיט 1.5 μג / מל מויז אַנטי-סטרעפּטאַווידין אַנטיבאָדי (טהערמאָ, MA1-20011).נאָך בלאַקינג (בלאַקינג באַפער: 140 nM NaCL, 5 מם עדטאַ, 0.05% נפּ40, 0.25% דזשעלאַטאַן, 1% בסאַ) אין צימער טעמפּעראַטור פֿאַר 2 שעה, וואַשן די טעלער מיט 0.05% טוועען-20 / פּבס (וואַש) פֿאַר 3 סעקונדע, CSF און פּלאַזמע דילוט 0, 0 מאַ בופפערינג סאַמפּאַלז זענען מוסיף צו 0.05% טוועען-20 / PBS. סף 1:115).דער טעלער איז דעמאָלט ינגקיובייטיד יבערנאַכטיק ביי 4 ° C מיט דיטעקשאַן אַנטיבאָדי (1 μג / מל, אַנטי-סטרעפּטאַווידין-הרפּ, נאָוווס נב120-7239).נאָך דריי וואַשינג סטעפּס, סטרעפּטאַווידין איז דיטעקטאַד דורך ינגקיוביישאַן אין טמב סאַבסטרייט לייזונג (ראָטשע) פֿאַר אַרויף צו 20 מינוט.נאָך סטאָפּפּינג קאָליר אַנטוויקלונג מיט 1M H2SO4, מעסטן די אַבזאָרבאַנס ביי 450 נם.
די פונקציע פון ​​​​סטרעפּטאַווידין-פּעפּטייד-BACE1 ינכיבאַטער קאָמפּלעקס איז אַססעססעד דורך Aβ (1-40) עליסאַ לויט דער פּראָטאָקאָל פון דער פאַבריקאַנט (Wako, 294-64701).בעקיצער, CSF סאַמפּאַלז זענען דיילוטאַד אין נאָרמאַל דיילואַנט (1:23) און ינקובייטיד יבערנאַכטיק ביי 4 ° C אין 96-געזונט פּלאַטעס קאָוטאַד מיט BNT77 כאַפּן אַנטיבאָדי.נאָך פינף וואַשינג סטעפּס, HRP-קאָנדזשוגאַטעד באַ 27 אַנטיבאָדי איז צוגעגעבן און ינקובייטיד פֿאַר 2 שעה ביי 4 ° סי, נאכגעגאנגען דורך פינף וואַשינג סטעפּס.אַβ (1-40) איז געווען דיטעקטאַד דורך ינגקיוביישאַן אין טמב לייזונג פֿאַר 30 מינוט אין צימער טעמפּעראַטור.נאָך די אַנטוויקלונג פון קאָליר איז סטאַפּט מיט סטאָפּ לייזונג, מעסטן די אַבזאָרבאַנס ביי 450 נם.פּלאַזמע סאַמפּאַלז זענען אונטערטעניק צו האַרט פאַסע יקסטראַקשאַן איידער Aβ (1-40) עליסאַ.פּלאַזמע איז מוסיף צו 0.2% דעאַ (סיגמאַ) אין 96-געזונט פּלאַטעס און ינקובייטיד אין צימער טעמפּעראַטור פֿאַר 30 מינוט.נאָך סאַקסעסיוו וואַשינג די SPE פּלאַטעס (אָאַזיס, 186000679) מיט וואַסער און 100% מעטאַנאָל, פּלאַזמע סאַמפּאַלז זענען מוסיף צו די SPE פּלאַטעס און אַלע פליסיק איז אַוועקגענומען.סאַמפּאַלז זענען געוואשן (ערשטער מיט 5% מעטאַנאַל און 30% מעטאַנאָל) און ילוטאַד מיט 2% נה4אָה / 90% מעטאַנאַל.נאָך דריינג די עלואַט ביי 55 ° C פֿאַר 99 מינוט ביי קעסיידערדיק נ 2 קראַנט, די סאַמפּאַלז זענען רידוסט אין נאָרמאַל דילואַנץ און אַ β (1-40) איז געמאסטן ווי דיסקרייבד אויבן.
ווי צו ציטירן דעם אַרטיקל: Urich, E. et al.לאַסט עקספּרעס צו די מאַרך ניצן דורכפאָר פּעפּטיידז יידענאַפייד אין וויוואָו.די וויסנשאַפֿט.5, 14104;דאָי: 10.1038/סרעפּ14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB און Moos T. עקספּרעס פון מאַקראָמאָלעקולאַר דרוגס צו דעם מאַרך ניצן טאַרגעטעד טעראַפּיע.זשורנאַל פון נעוראָטשעמיסטרי 113, 1-13, 10.1111/דזש.1471-4159.2009.06544.קס (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., און Martinez-Martinez, P. עקספּרעס פון פּעפּטייד און פּראָטעין דרוגס אַריבער די בלוט-מאַרך שלאַבאַן.פּראָג נעוראָביאָל 87, 212-251, 10.1016/דזש.פּנעוראָביאָ.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM די בלוט-מאַרך שלאַבאַן: אַ באַטאַלנעק אין מאַרך מעדיצין אַנטוויקלונג.נעוראָרקס 2, 3-14, 10.1602 / נעוראָרקס.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, און Byrd, A. פּראָספּעקץ פֿאַר ימפּרוווד מעדיצין עקספּרעס און טאַרגאַטינג צו דעם מאַרך דורך די טשאָראָיד פּלעקסוס-CSF פּאַטוויי.פאַרמאַסוטיקאַל פאָרשונג 22, 1011-1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM מאָדערניזירונג פון ביאָפאַרמאַסעוטיקאַלס מיט מאָלעקולאַר טראָדזשאַן פערד פֿאַר מאַרך עקספּרעס.Bioconjug Chem 19, 1327-1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM רעסעפּטאָר-מעדיאַטעד פּעפּטייד אַריבערפירן אַריבער די בלוט-מאַרך שלאַבאַן.ענדאָקר רעוו. 7, 314-330 (1986).
Niewoehner, J. עט על.פאַרגרעסערן מאַרך דורכדרונג און עפיקאַסי פון טעראַפּיוטיק אַנטיבאָדיעס ניצן מאָנאָוואַלענט מאָלעקולאַר שאַטאַלז.נעוראָן 81, 49-60, 10.1016/דזש.נעוראָן.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. עט על.טראַנספעררין רעסעפּטאָר (TfR) אַריבערפירן דיטערמאַנז מאַרך אַפּטייק פון קירבות וועריאַנץ פון TfR אַנטיבאָדיעס.דזש עקספּ מעד 211, 233-244, 10.1084 / דזשעמ.20131660 (2014).