א דאנק פארן באזוכן Nature.com. די בראַוזער ווערסיע וואָס איר ניצט האט באַגרענעצטע CSS שטיצע. פֿאַר די בעסטע דערפאַרונג, מיר רעקאָמענדירן אַז איר ניצט אַן דערהייַנטיקטן בראַוזער (אָדער דיאַקטיווירט קאָמפּאַטיביליטי מאָדע אין אינטערנעט עקספּלאָרער). אין דער דערווייל, צו ענשור ווייטערדיקע שטיצע, וועלן מיר רענדערן דעם וועבזייטל אָן סטילן און דזשאַוואַסקריפּט.
פליסיגע ביאָפּסי (LB) איז אַ קאָנצעפּט וואָס ווערט שנעל פּאָפּולאַר אין דעם ביאָמעדיצינישן פעלד. דער קאָנצעפּט איז באַזירט אויף דער דעטעקציע פון ​​פראַגמענטן פון צירקולירנדיקער עקסטראַסעלולאַרער DNA (ccfDNA), וואָס ווערן באַפרייט ווי קליינע פראַגמענטן נאָך צעל טויט אין פֿאַרשידענע געוועבן. א קליינער טייל פון די פראַגמענטן שטאַמען פון פרעמדע געוועבן אדער אָרגאַניזמען. אין איצטיקער אַרבעט, האָבן מיר געווענדט דעם קאָנצעפּט צו מוסלען, אַ סענטינעל מינים באַקאַנט פֿאַר זייער הויך ים וואַסער פֿילטראַציע קאַפּאַציטעט. מיר נוצן די פיייקייט פון מוסלען צו אַקט ווי נאַטירלעכע פֿילטערס צו כאַפּן סביבה DNA פראַגמענטן פון אַ פאַרשיידנקייט פון קוועלער צו צושטעלן אינפֿאָרמאַציע וועגן דער בייאָודיווערסיטי פון מאַרינע קאָוסטאַל עקאָסיסטעמען. אונדזערע רעזולטאַטן ווייַזן אַז מוסל העמאָלימפע כּולל DNA פראַגמענטן וואָס ווערייִרן זייער אין גרייס, פון 1 צו 5 קב. שאָטגאַן סיקווענסינג האט געוויזן אַז אַ גרויסע צאָל פון DNA פראַגמענטן זענען פון פרעמדן מיקראָביעלן אָפּשטאַם. צווישן זיי, האָבן מיר געפֿונען DNA פראַגמענטן פון באַקטעריע, אַרכעאַ, און ווירוסן, אַרייַנגערעכנט ווירוסן באַקאַנט צו אָנשטעקן אַ פאַרשיידנקייט פון באַלעבאָטים וואָס זענען געוויינטלעך געפֿונען אין קאָוסטאַל מאַרינע עקאָסיסטעמען. אין מסקנא, אונדזער שטודיע ווייזט אז דער קאנצעפט פון LB אנגעווענדט צו מוסלען רעפרעזענטירט א רייכע אבער נאך נישט אויסגעפארשטע מקור פון וויסן וועגן מיקראָביעלער דייווערסיטי אין מאַרינע קאָוסטאַל עקאָסיסטעמען.
דער אימפאקט פון קלימאט ענדערונג (CC) אויף דער ביאָדיווערסיטי פון מאַרינע עקאָסיסטעמען איז אַ שנעל-וואַקסנדיקער פאָרשונגס-געביט. גלאָבאַלע דערהיצונג ניט נאָר פאַראורזאַכט וויכטיקע פיזיאָלאָגישע דרוקן, נאָר אויך שטופּט די עוואָלוציאָנערע גרענעצן פון דער טערמישער פעסטקייט פון מאַרינע אָרגאַניזמען, וואָס אַפעקטירט דעם לעבנס-שטח פון אַ צאָל מינים, און פירט זיי צו זוכן מער גינסטיגע באַדינגונגען [1, 2]. אין דערצו צו ווירקן אויף דער ביאָדיווערסיטי פון מעטאַזאָאַנען, CC דיסראַפּט די דעליקאַטע וואָג פון באַלעבאָס-מיקראָביאַלע ינטעראַקשאַנז. די מיקראָביאַלע דיסבאַקטעריאָזיס שטעלט אַ ערנסטע סאַקאָנע צו מאַרינע עקאָסיסטעמען ווייל עס מאַכט מאַרינע אָרגאַניזמען מער סאַסעפּטאַבאַל צו ינפעקטיאָוס פּאַטאַדזשענס [3, 4]. מען גלויבט אַז SS שפּילן אַ וויכטיקע ראָלע אין מאַסע טויטפעלער, וואָס איז אַ ערנסטע פּראָבלעם פֿאַר דער פאַרוואַלטונג פון גלאָבאַלע מאַרינע עקאָסיסטעמען [5, 6]. דאָס איז אַ וויכטיקע פּראָבלעם געגעבן די עקאָנאָמישע, עקאָלאָגישע און נוטרישאַנאַלע ימפּאַקץ פון פילע מאַרינע מינים. דאָס איז ספּעציעל אמת פֿאַר בייוואַלוועס וואָס לעבן אין די פּאָלאַרע געגנטן, וווּ די ווירקונגען פון CK זענען מער באַלדיק און שטרענג [6, 7]. אין פאַקט, בייוואַלוועס ווי Mytilus spp. ווערן וויידלי געניצט צו מאָניטאָרירן די ווירקונגען פון CC אויף מאַרינע עקאָסיסטעמען. נישט קיין וואונדער, א רעלאטיוו גרויסע צאל ביאָמאַרקערס זענען דעוועלאָפּט געוואָרן צו מאָניטאָרירן זייער געזונט, אָפט ניצנדיק אַ צוויי-שיכטיקן צוגאַנג וואָס אַרייַננעמט פונקציאָנעלע ביאָמאַרקערס באַזירט אויף ענזימאַטישער טעטיקייט אָדער צעלולאַרע פונקציעס ווי צעל ווייאַביליטי און פאַגאָסיטיק טעטיקייט [8]. די מעטאָדן אַרייַננעמען אויך די מעסטונג פון די קאָנצענטראַציע פון ​​ספּעציפֿישע דרוק אינדיקאַטאָרן וואָס אָנקלייַבן זיך אין ווייכע געוועבן נאָך דער אַבזאָרפּציע פון ​​גרויסע סומעס ים וואַסער. אָבער, די הויך פילטראַציע קאַפּאַציטעט און האַלב-אָפענע סערקיאַלאַטאָרישע סיסטעם פון בייוואַלוועס צושטעלן אַ געלעגנהייט צו אַנטוויקלען נייַע העמאָלימף ביאָמאַרקערס ניצנדיק דעם באַגריף פון פליסיק ביאָפּסי (LB), אַ פּשוט און מינימאַל ינווייסיוו צוגאַנג צו פּאַציענט פאַרוואַלטונג. בלוט סאַמפּאַלז [9, 10]. כאָטש עטלעכע טייפּס פון סערקיאַלייטינג מאַלעקולעס קענען זיין געפֿונען אין מענטשלעך LB, דעם באַגריף איז בפֿרט באַזירט אויף DNA סיקוואַנסינג אַנאַליסיס פון סערקיאַלייטינג עקסטראַסעלולאַר DNA (ccfDNA) פראַגמענץ אין פּלאַזמע. אין פאַקט, די בייַזייַן פון סערקיאַלייטינג DNA אין מענטשלעך פּלאַזמע איז באַקאַנט זינט די מיטן 20סטן יאָרהונדערט [11], אָבער עס איז בלויז אין די לעצטע יאָרן אַז די אַדווענט פון הויך-דורכפֿלוס סיקוואַנסינג מעטהאָדס האט געפֿירט צו קליניש דיאַגנאָסיס באַזירט אויף ccfDNA. די אנוועזנהייט פון די צירקולירנדע דנ״א פראגמענטן איז טיילווייז צוליב דער פאסיווער באפרייאונג פון גענאמישער דנ״א (נוקלעארער און מיטאכאנדריעלער) נאך צעל טויט. ביי געזונטע מענטשן איז די קאנצענטראציע פון ​​ccfDNA נארמאל נידעריג (<10 ng/mL) אבער קען זיין געוואקסן מיט 5-10 מאל ביי פאציענטן וואס ליידן פון פארשידענע פאטאלאגיעס אדער זענען אונטערטעניק צו סטרעס, וואס רעזולטירט אין געוועב שאדן. ביי געזונטע מענטשן איז די קאנצענטראציע פון ​​ccfDNA נארמאל נידעריג (<10 ng/mL) אבער קען זיין געוואקסן מיט 5-10 מאל ביי פאציענטן וואס ליידן פון פארשידענע פאטאלאגיעס אדער זענען אונטערטעניק צו סטרעס, וואס רעזולטירט אין געוועב שאדן. אין די לעצטע צייט פון די לעצטע צייט אין די צייט פון 5-10 טעג (<10 נג / מל) патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. ביי געזונטע מענטשן איז די קאנצענטראציע פון ​​cccDNA נארמאל נידעריג (<10 ng/mL), אבער עס קען זיך פארגרעסערן מיט 5-10 מאל ביי פאציענטן מיט פארשידענע פאטאלאגיעס אדער אונטער סטרעס וואס פירט צו געוועב שאדן.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL,在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 ((<10 ng/ml) 但 在 各 种 病理 刏中 可 增加 5-10 倍 , 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤损伤קאַנסאַנטרייטאַד ccfDNA אַבדזשעקטיווז (<10 נג/מיליטער) און פאַרשרייַבן, עס קען נישט זיין קאַנסאַנטרייטאַד אין 5-10 טעג פון צייט патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. ccfDNA קאנצענטראציעס זענען געווענליך נידעריג (<10 ng/ml) אין געזונטע מענטשן, אבער קענען זיין געוואקסן 5-10-פאך אין פאציענטן מיט פארשידענע פאטאלאגיעס אדער סטרעס, וואס רעזולטירט אין געוועב שאדן.די גרייס פון ccfDNA פראגמענטן ווערירט שטארק, אבער געווענליך ריינדזשט עס פון 150 ביז 200 bp. [12]. אנאליז פון זעלבסט-דערייווד ccfDNA, ד.ה. ccfDNA פון נארמאלע אדער טראנספארמירטע באלעבאס צעלן, קען גענוצט ווערן צו דעטעקטירן גענעטישע און עפיגענעטישע ענדערונגען וואס זענען פאראן אין די נוקלעארע און/אדער מיטאכאנדריעלע גענאם, דערמיט העלפן קליניקער אויסקלויבן ספעציפישע מאלעקולאר-געצילטע טעראפיעס [13]. אבער, ccfDNA קען באקומען ווערן פון פרעמדע קוועלער ווי ccfDNA פון פעטאלע צעלן בעת ​​שוואנגערשאפט אדער פון טראנספלאנטירטע ארגאנען [14,15,16,17]. ccfDNA איז אויך א וויכטיגע מקור אינפארמאציע פארן דעטעקטירן די אנוועזנהייט פון נוקלעאיק זויערן פון אן אינפעקציעזער אגענט (פרעמד), וואס ערלויבט נישט-אינוואזיווע דעטעקציע פון ​​פארשפרייטע אינפעקציעס וואס ווערן נישט אידענטיפיצירט דורך בלוט קולטורן, פארמיידנדיג אינוואזיווע ביאפסיע פון ​​אינפעקטירטן געוועב [18]. פרישע שטודיעס האבן טאקע געוויזן אז מענטשלעך בלוט אנטהאלט א רייכע מקור אינפארמאציע וואס קען גענוצט ווערן צו אידענטיפיצירן וויראלע און באַקטיריעלע פּאַטאָגענס, און אז בערך 1% פון די ccfDNA וואס געפינט זיך אין מענטשלעך פּלאַזמע איז פון פרעמדן אָפּשטאַם [19]. די שטודיעס ווייזן אז די ביאדיווערסיטי פון אן ארגאניזם'ס צירקולירנדיקן מיקראביאם קען ווערן אפגעשאצט מיט ccfDNA אנאליז. אבער, ביז לעצטנס, איז דעם קאנצעפט גענוצט געווארן אויסשליסלעך אין מענטשן און, צו א קלענערער מאס, אין אנדערע ווערטעבראטן [20, 21].
אין דער איצטיקער פאפיר, ניצן מיר דעם LB פאטענציאל צו אנאליזירן די ccfDNA פון Aulacomya atra, א דרום מינים וואס מען געפינט געוויינטלעך אין די סובאנטארקטישע קערגועלען אינזלען, א גרופע אינזלען אויף א גרויסן פלאטא וואס האט זיך געשאפן 35 מיליאן יאר צוריק. וואולקאנישע אויסברוך. ניצנדיג אן אין וויטרא עקספערימענטאלע סיסטעם, האבן מיר געפונען אז DNA פראגמענטן אין ים-וואסער ווערן שנעל אויפגענומען דורך מוסלען און גייען אריין אין דעם העמאָלימפע קאמפארטמענט. שאטגאן סיקווענסינג האט געוויזן אז מוסל העמאָלימפע ccfDNA אנטהאלט DNA פראגמענטן פון איר אייגענעם און נישט-זעלבסטשטענדיגן אפשטאם, אריינגערעכנט סימביאטישע באקטעריע און DNA פראגמענטן פון ביאָמעס טיפיש פאר קאלטע וואולקאנישע מארינע ברעג עקא-סיסטעמען. העמאָלימפע ccfDNA אנטהאלט אויך וויראלע סיקווענסן דעריוואטירט פון ווירוסן מיט פארשידענע באלעבאס ראיאנען. מיר האבן אויך געפונען DNA פראגמענטן פון מולטיסעלולארע בעלי חיים ווי ביינערישע פיש, ים אנעמאָנעס, אלגע און אינסעקטן. אין מסקנא, אונזער שטודיע ווייזט אז דער LB קאנצעפט קען ווערן ערפאלגרייך אנגעווענדעט צו מארינע ינווערטעבראטן צו שאפן א רייכן גענאמישן רעפערטואר אין מארינע עקא-סיסטעמען.
דערוואַקסענע (55-70 מ"מ לאַנג) Mytilus platensis (M. platensis) און Aulacomya atra (A. atra) זענען געזאַמלט געוואָרן פֿון די צווישן-טיידאַלע שטיינערנע ברעגעס פֿון פּאָרט-אָ-פֿראַנקרײַך (049°21.235 S, 070°13.490 E). קערגועלען אינזלען אין דעצעמבער 2018. אַנדערע דערוואַקסענע בלויע מוסלען (Mytilus spp.) זענען באַקומען געוואָרן פֿון אַ קאמערציעלן סאַפּלייער (PEI Mussel King Inc., פּרינץ עדוואַרד אינזל, קאַנאַדע) און געשטעלט אין אַ טעמפּעראַטור קאָנטראָלירטן (4°C) לופֿטיקן טאַנק מיט 10-20 ל פֿון 32‰ קינסטלעכן זאַלץ-וואַסער (קינסטלעכער ים-זאַלץ Reef Crystal, Instant Ocean, ווירדזשיניע, USA). פֿאַר יעדן עקספּערימענט איז די לענג און וואָג פֿון די יחידישע שעלז געמאָסטן געוואָרן.
א פרייער אפענער צוטריט פראטאקאל פאר דעם פראגראם איז פאראן אנליין (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). בקיצור, LB העמאָלימפע איז געזאמלט געווארן פון אבדוקטאר מוסקלען ווי באשריבן [22]. די העמאָלימפע איז קלאר געמאכט געווארן דורך צענטריפוגאציע ביי 1200×g פאר 3 מינוט, דער סופערנאטאנט איז געפרוירן געווארן (-20°C) ביז נוצן. פאר אפגעזונדערטקייט און רייניקונג פון cfDNA, זענען מוסטערן (1.5-2.0 מל) אויפגעטויט און פארארבעט געווארן מיטן NucleoSnap cfDNA קיט (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) לויט די אינסטרוקציעס פונעם פאבריקאנט. ccfDNA איז געהאלטן געווארן ביי -80°C ביז ווייטערדיגע אנאליז. אין עטלעכע עקספערימענטן, איז ccfDNA אפגעזונדערט און גערייניקט געווארן מיטן QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, טאראנטא, אנטעריא, קאנאדע). גערייניקטע DNA איז קוואנטיפיצירט געווארן מיטן סטאַנדארט PicoGreen אסיי. די פראַגמענט פאַרשפּרייטונג פון די אפגעזונדערטע ccfDNA איז אַנאַליזירט געוואָרן דורך קאַפּילאַר עלעקטראָפאָרעזיס ניצנדיק אַן Agilent 2100 ביאָאַנאַליזער (Agilent Technologies Inc., סאַנטאַ קלאַראַ, CA) ניצנדיק אַ High Sensitivity DNA קיט. די פּראָבע איז דורכגעפירט געוואָרן ניצנדיק 1 µl פון די ccfDNA מוסטער לויט די אינסטרוקציעס פונעם פאַבריקאַנט.
פאר סיקווענסינג פון העמאָלימפע ccfDNA פראגמענטן, האט דזשענאָמע קוועבעק (מאָנטרעאַל, קוועבעק, קאַנאַדע) צוגעגרייט שאָטגאַן לייברעריז ניצנדיק דעם Illumina DNA Mix קיט פון דעם Illumina MiSeq PE75 קיט. א סטאַנדאַרט אַדאַפּטער (BioO) איז גענוצט געוואָרן. רויע דאַטן טעקעס זענען פאַראַן פון דעם NCBI סיקווענס ריד אַרכיוו (SRR8924808 און SRR8924809). גרונטלעכע לייענען קוואַליטעט איז געווען אַססעססעד ניצנדיק FastQC [23]. טריממאָמאַטיק [24] איז גענוצט געוואָרן פֿאַר קליפּינג אַדאַפּטערס און שלעכט-קוואַליטעט רידס. שאָטגאַן רידס מיט פּערד ענדס זענען FLASH צונויפגעמישט געוואָרן אין לענגערע איינציקע רידס מיט אַ מינימום אָוווערלאַפּ פון 20 bp צו ויסמיידן מיסמאַטשעס [25]. צוזאמענגעגאסענע לייענונגען זענען אנאטירט געווארן מיט BLASTN ניצנדיק א בייוואַלווע NCBI טאַקסאָנאָמיע דאַטאַבייס (e ווערט < 1e−3 און 90% האָמאָלאָגיע), און מאַסקינג פון נידעריק-קאָמפּלעקסיטי סיקוואַנסן איז דורכגעפירט געווארן ניצנדיק DUST [26]. צוזאמענגעגאסענע לייענונגען זענען אנאטירט געווארן מיט BLASTN ניצנדיק א בייוואַלווע NCBI טאַקסאָנאָמיע דאַטאַבייס (e ווערט < 1e−3 און 90% האָמאָלאָגיע), און מאַסקינג פון נידעריק-קאָמפּלעקסיטי סיקוואַנסן איז דורכגעפירט געווארן ניצנדיק DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии бластныю (זענען e < 1e-3 און 90% גראָמאָלאָגי), אַ מאַסקיראָוואַניע последовательностей низкой сложности было выполнес с 26польностей. צוזאמענגעשטעלטע לייענונגען זענען אנאטירט געווארן מיט BLASTN ניצנדיק די NCBI בייוואַלווע טאַקסאָנאָמיע דאַטאַבייס (e ווערט < 1e-3 און 90% האָמאָלאָגיע), און נידעריק קאָמפּלעקסיטי סיקוואַנס מאַסקינג איז דורכגעפירט געווארן ניצנדיק DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的䶯幕，2.进行低复杂度序列的掩蔽.使用 双 壳类 ncbi 分类 （((<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 诽濔 2 ， 2 ]进行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных двуNC (זענען e <1e-3 און 90% גאָלאָגגיי), אַ מאַסקיראָוואַניע последовательностей низкой сложности было выполненольнос ис 26]. צוזאמענגעשטעלטע לייענונגען זענען אנאטירט געווארן מיט BLASTN ניצנדיק די NCBI בייוואַלוו טאַקסאָנאָמישע דאַטאַבייס (e ווערט <1e-3 און 90% האָמאָלאָגי), און נידעריק קאָמפּלעקסיטי סיקוואַנס מאַסקינג איז דורכגעפירט געווארן ניצנדיק DUST [26].לייענונגען זענען צעטיילט געוואָרן אין צוויי גרופּעס: פֿאַרבונדן מיט בייוואַלווע סיקוואַנסן (דאָ גערופֿן זיך-לייענונגען) און נישט-פֿאַרבונדענע (נישט-זעלבסט-לייענונגען). צוויי גרופּעס זענען באַזונדער צוזאַמענגעשטעלט געוואָרן מיט MEGAHIT צו שאַפֿן קאָנטיגס [27]. דערווייל, די טאַקסאָנאָמישע פֿאַרשפּרייטונג פֿון פֿרעמדע מיקראָביאָם לייענונגען איז קלאַסיפֿיצירט געוואָרן מיט Kraken2 [28] און גראַפֿיש רעפּרעזענטירט דורך אַ Krona פּיראָג טשאַרט אויף Galaxy [29, 30]. די אָפּטימאַלע קמערס איז באַשטימט געוואָרן צו זיין קמערס-59 פֿון אונדזערע פֿאָרלייפיקע עקספּערימענטן. זעלבסט-קאנטיגס זענען דעמאָלט אידענטיפיצירט געוואָרן דורך אַליינמענט מיט BLASTN (ביוואַלווע NCBI דאַטאַבאַזע, e ווערט < 1e−10 און 60% האָמאָלאָגיע) פֿאַר אַ לעצטער אַנאָטאַציע. זעלבסט-קאנטיגס זענען דעמאָלט אידענטיפיצירט געוואָרן דורך אַליינמענט מיט BLASTN (ביוואַלווע NCBI דאַטאַבאַזע, e ווערט < 1e−10 און 60% האָמאָלאָגיע) פֿאַר אַ לעצטער אַנאָטאַציע. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. זעלבסט-קאנטיגס זענען דעמאָלט אידענטיפיצירט געוואָרן דורך צופּאַסן קעגן BLASTN (NCBI בייוואַלווע דאַטאַבייס, e ווערט <1e-10 און 60% האָמאָלאָגיע) פֿאַר לעצטער אַנאָטאַציע.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% אַבאָנירן צו דער אינסטיטוט פון קאַנטראַקץ פֿאַר קאַנסאַנטריישאַן פון בלאַקאַן (באַנק) קאַנסאַנטריישאַן פון מאַלישאַס, און <1e-10 און 60%. זעלבסט-קאנטיגס זענען דעמאָלט אידענטיפיצירט געוואָרן פֿאַר לעצטער אַנאָטאַציע דורך גלייַכן קעגן BLASTN (NCBI בייוואַלוו דאַטאַבייס, e ווערט <1e-10 און 60% האָמאָלאָגי). אין פּאַראַלעל, זענען נישט-זעלבסט גרופע קאָנטיגס אַנאָטירט געוואָרן מיט BLASTN (nt NCBI דאַטאַבייס, e ווערט < 1e−10 און 60% האָמאָלאָגיע). אין פּאַראַלעל, זענען נישט-זעלבסט גרופע קאָנטיגס אַנאָטירט געוואָרן מיט BLASTN (nt NCBI דאַטאַבייס, e ווערט < 1e−10 און 60% האָמאָלאָגיע). 10 יאנואר 10 יאנואר 10 יאנואר 10 60%. אין פּאַראַלעל, זענען פרעמדע גרופּע קאָנטיגס אַנאָטירט געוואָרן מיט BLASTN (NT NCBI דאַטאַבאַזע, e ווערט <1e-10 און 60% האָמאָלאָגיע).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重〠平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重〠 פּאַלעסטינער קאַנטיניואַסלי, ניט אָטנאָוסיאַщиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база даннын, <1e-10 און גאָמע 60%. אין פּאַראַלעל, נישט-זעלבסט גרופע קאָנטיגס זענען אַנאָטירט געוואָרן מיט BLASTN (nt NCBI דאַטאַבייס, e ווערט <1e-10 און 60% האָמאָלאָגיע). בלאַסטקס איז אויך דורכגעפירט געוואָרן אויף נישט-זעלבסט קאָנטיגס ניצנדיק די nr און RefSeq פּראָטעין NCBI דאַטאַבייסעס (e ווערט < 1e−10 און 60% האָמאָלאָגיע). בלאַסטקס איז אויך דורכגעפירט געוואָרן אויף נישט-זעלבסט קאָנטיגס ניצנדיק די nr און RefSeq פּראָטעין NCBI דאַטאַבייסעס (e ווערט < 1e−10 און 60% האָמאָלאָגיע). בלאַסטקס קענען זיין רעגיסטרירט פֿאַר די נויטיק קאַנטיניואַסלי מיט יקסעפּשאַנאַל ביילאגעס און רעפסעק NCBI (זען 01-0. גאָמאָלאָגייאַ 60%. בלאַסטקס איז אויך דורכגעפירט געוואָרן אויף נישט-זעלבסט קאָנטיגס ניצנדיק די nr און RefSeq NCBI פּראָטעין דאַטאַבייסעס (e ווערט < 1e-10 און 60% האָמאָלאָגיע).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 咧 咧怉携% ェ还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 咧 咧怉携% ェ BLASTX איז בארעכטיגט פֿאַר די נויטיק קאַנטיניואַסלי מיט יקסעפּשאַנאַל ביילאגעס און רעפסעק NCBI (זען 1 און 1 יאנואר 1) גאָמאָלאָגייאַ 60%. BLASTX איז אויך דורכגעפירט געוואָרן אויף נישט-זעלבסט קאָנטיגס ניצנדיק די nr און RefSeq NCBI פּראָטעין דאַטאַבייסעס (e ווערט <1e-10 און 60% האָמאָלאָגיע).די BLASTN און BLASTX פּולס פון נישט-זעלבסט-קאנטיגס רעפּרעזענטירן די לעצטע קאנטיגס (זע סאַפּלעמענטאַרי טעקע).
די פריימערס גענוצט פאר PCR זענען ליסטעד אין טאבעלע S1. טאק דנא פאלימעראז (ביא בייסיק קאנאדע, מארקהאם, אנטעריא) איז גענוצט געווארן צו פארגרעסערן די ccfDNA ציל גענעס. די פאלגנדע רעאקציע באדינגונגען זענען גענוצט געווארן: דענאטוראציע ביי 95°C פאר 3 מינוט, 95°C פאר 1 מינוט, איינגעשטעלטע אנילינג טעמפעראטור פאר 1 מינוט, פארלענגערונג ביי 72°C פאר 1 מינוט, 35 ציקלען, און צום סוף 72°C אין 10 מינוט. . PCR פראדוקטן זענען אפגעשיידט געווארן דורך עלעקטראפארעזיס אין אגאראוז דזשעלס (1.5%) מיט SYBRTM סעיף דנא דזשעל סטיין (אינוויטראדזשען, בורלינגטאן, אנטעריא, קאנאדע) ביי 95 V.
מוסלען (Mytilus spp.) זענען אַקקלימאַטיזירט געוואָרן אין 500 מל זויערשטאָף-גענומענע ים-וואַסער (32 PSU) פֿאַר 24 שעה ביי 4°C. פּלאַזמיד דנאַ מיט אַן אייַנפֿיר וואָס קאָדירט די מענטשלעכע גאַלעקטין-7 cDNA סיקוואַנס (NCBI אַקסעסיע נומער L07769) איז צוגעגעבן געוואָרן צו דער פֿלאַש מיט אַ לעצטיקער קאָנצענטראַציע פֿון 190 μg/μl. מוסלען וואָס זענען אינקובירט געוואָרן אונטער די זעלבע באַדינגונגען אָן דנאַ צוגאב זענען געווען די קאָנטראָל. דער דריטער קאָנטראָל טאַנק האט ענטהאַלטן דנאַ אָן מוסלען. צו מאָניטאָרירן די קוואַליטעט פֿון דנאַ אין ים-וואַסער, זענען ים-וואַסער מוסטערן (20 μl; דריי איבערחזרן) גענומען געוואָרן פֿון יעדן טאַנק אין דער אָנגעגעבענער צייט. פֿאַר פּלאַזמיד דנאַ טרעיסאַביליטי, זענען LB מוסלען געזאַמלט געוואָרן אין די אָנגעגעבענע צייטן און אַנאַליזירט דורך qPCR און ddPCR. צוליב דעם הויכן זאַלץ אינהאַלט פֿון ים-וואַסער, זענען אַליקוואָטן פֿאַרדיןנט געוואָרן אין PCR קוואַליטעט וואַסער (1:10) פֿאַר אַלע PCR אַסייז.
דיגיטאַלע טראָפּן PCR (ddPCR) איז דורכגעפירט געוואָרן מיטן BioRad QX200 פּראָטאָקאָל (מיסיסאַוגאַ, אָנטאַריאָ, קאַנאַדע). ניצט דעם טעמפּעראַטור פּראָפיל צו באַשטימען די אָפּטימאַלע טעמפּעראַטור (טאַבעלע S1). טראָפּנס זענען גענערירט געוואָרן מיטן QX200 טראָפּן גענעראַטאָר (BioRad). ddPCR איז דורכגעפירט געוואָרן ווי פאלגנד: 95°C פֿאַר 5 מינוט, 50 ציקלען פון 95°C פֿאַר 30 סעקונדעס און אַ געגעבענע אַנילינג טעמפּעראַטור פֿאַר 1 מינוט און 72°C פֿאַר 30 סעקונדעס, 4°C פֿאַר 5 מינוט און 90°C אין 5 מינוט. די צאָל טראָפּנס און פּאָזיטיווע רעאַקציעס (צאָל קאָפּיעס/µl) זענען געמאָסטן געוואָרן מיטן QX200 טראָפּן לייענער (BioRad). מוסטערן מיט ווייניקער ווי 10,000 טראָפּנס זענען אָפּגעוואָרפן געוואָרן. מוסטער קאָנטראָל איז נישט דורכגעפירט געוואָרן יעדעס מאָל ווען ddPCR איז געלאָפן געוואָרן.
qPCR איז דורכגעפירט געווארן ניצנדיק Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, סידני, אויסטראליע) און LGALS7 ספעציפישע פריימערס. אלע קוואנטיטאטיווע PCRs זענען דורכגעפירט געווארן אין 20 µl ניצנדיק דעם QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN). qPCR איז אנגעהויבן געווארן מיט א 15 מינוט אינקובאציע ביי 95°C נאכגעפאלגט דורך 40 ציקלען ביי 95°C פאר 10 סעקונדעס און ביי 60°C פאר 60 סעקונדעס מיט איין דאטן זאמלונג. שמעלץ קורוועס זענען גענערירט געווארן ניצנדיק נאכאנאנדע מעסטונגען ביי 95°C פאר 5 סעקונדעס, 65°C פאר 60 סעקונדעס, און 97°C ביים סוף פונעם qPCR. יעדער qPCR איז דורכגעפירט געווארן אין דרייפאכיג, אחוץ פאר קאנטראל מוסטערן.
זינט מוסלען זענען באַקאַנט פֿאַר זייער הויכן פֿילטראַציע קורס, האָבן מיר ערשט אויסגעפֿאָרשט צי זיי קענען פֿילטערן און האַלטן DNA פֿראַגמענטן וואָס זענען פֿאַראַן אין ים וואַסער. מיר זענען אויך געווען אינטערעסירט צי די פֿראַגמענטן זאַמלען זיך אָן אין זייער האַלב-אָפֿענעם לימפֿאַטישן סיסטעם. מיר האָבן עקספּערימענטאַל אויסגעפֿאָרשט דעם פּראָבלעם דורך נאָכפֿאָלגן דעם גורל פֿון לייזלעכע DNA פֿראַגמענטן וואָס מען לייגט צו בלויע מוסל טאַנקס. כּדי צו פֿאַרלייכטערן דעם נאָכפֿאָלגן פֿון DNA פֿראַגמענטן, האָבן מיר גענוצט פֿרעמדע (נישט זעלבסטשטענדיקע) פּלאַזמיד DNA וואָס ענטהאַלט דעם מענטשלעכן גאַלעקטין-7 דזשין. ddPCR נאָכפֿאָלגט פּלאַזמיד DNA פֿראַגמענטן אין ים וואַסער און מוסלען. אונדזערע רעזולטאַטן ווײַזן אַז אויב די צאָל DNA פֿראַגמענטן אין ים וואַסער איז געבליבן רעלאַטיוו קאָנסטאַנט איבער צײַט (ביז 7 טעג) אָן מוסלען, דאַן אין דער פֿאַראַן פֿון מוסלען איז דעם לעוועל כּמעט גאָר פֿאַרשוואונדן אין 8 שעה (פֿיגור 1אַ,ב). פֿראַגמענטן פֿון עקסאָגענער DNA זענען לייכט דעטעקטירט געוואָרן אין 15 מינוט אין אינטראַוואַלוולאַרער פֿליסיקייט און העמאָלימפֿע (פֿיגור 1ג). די פֿראַגמענטן קענען נאָך דעטעקטירט ווערן ביז 4 שעה נאָך דער אויסשטעלונג. די פֿילטרירונג אַקטיוויטעט אין באַצוג צו DNA פֿראַגמענטן איז פֿאַרגלײַכלעך צו דער פֿילטרירונג אַקטיוויטעט פֿון באַקטעריעס און אַלדזשי [31]. די רעזולטאַטן פֿאָרשלאָגן אַז מוסלען קענען פֿילטערן און אָנקלײַבן פֿרעמדע DNA אין זייערע פֿליסיקייט אָפּטיילן.
רעלאַטיווע קאָנצענטראַציעס פון פּלאַזמיד דנאַ אין ים-וואַסער אין דער אנוועזנהייט (A) אָדער אָפּוועזנהייט (B) פון מוסלען, געמאָסטן דורך ddPCR. אין A, די רעזולטאַטן ווערן אויסגעדריקט ווי פּראָצענטן, מיט די גרענעצן פון די קעסטלעך וואָס רעפּרעזענטירן די 75סטע און 25סטע פּערסענטילן. די צוגעפּאַסטע לאָגאַריטמישע קורווע ווערט געוויזן אין רויט, און די שטח וואָס איז געשאַטעט אין גרוי רעפּרעזענטירט דעם 95% קאָנפידענץ אינטערוואַל. אין B, די רויטע ליניע רעפּרעזענטירט דעם דורכשניט און די בלויע ליניע רעפּרעזענטירט דעם 95% קאָנפידענץ אינטערוואַל פֿאַר דער קאָנצענטראַציע. C אַקומולאַציע פון ​​פּלאַזמיד דנאַ אין דער העמאָלימפע און וואַלוולאַרער פליסיקייט פון מוסלען אין פֿאַרשידענע צייטן נאָך דעם צולייגן פון פּלאַזמיד דנאַ. רעזולטאַטן ווערן פּרעזענטירט ווי אַבסאָלוטע קאָפּיעס דעטעקטעד/מל (±SE).
ווייטער, האבן מיר אויסגעפארשט דעם מקור פון ccfDNA אין מוסלען געזאמלט פון מוסל בעטן אויף די קערגועלען אינזלען, א אפגעזונדערטע גרופע אינזלען מיט באגרענעצטן מענטשליכן איינפלוס. פאר דעם צוועק, איז cccDNA פון מוסל העמאָלימפן אפגעזונדערט און גערייניקט געווארן דורך מעטאדן וואס ווערן געווענליך גענוצט צו רייניקן מענטשלעכע cccDNA [32, 33]. מיר האבן געפונען אז דורכשניטלעכע העמאָלימפ ccfDNA קאנצענטראציעס אין מוסלען זענען אין די נידעריגע מיקראָגראַמס פּער מל העמאָלימפ קייט (זעה טאבעלע S2, צוגאב אינפארמאציע). די קייט פון קאנצענטראציעס איז פיל גרעסער ווי אין געזונטע מענטשן (נידעריגע נאַנאָגראַמס פּער מיליליטער), אבער אין זעלטענע פעלער, אין קענסער פאציענטן, קען דער לעוועל פון ccfDNA דערגרייכן עטלעכע מיקראָגראַמס פּער מיליליטער [34, 35]. אן אנאליז פון די גרייס פארטיילונג פון העמאָלימפ ccfDNA האט געוויזן אז די פראגמענטן וועריירן שטארק אין גרייס, ריינדזשינג פון 1000 bp ביז 1000 bp. ביז 5000 bp (פיגור 2). ענלעכע רעזולטאַטן זענען באַקומען געוואָרן מיטן סיליקאַ-באַזירטן QIAamp אויספאָרשער קיט, אַ מעטאָד וואָס ווערט געוויינטלעך געניצט אין פאָרענסישער וויסנשאַפֿט צו שנעל איזאָלירן און רייניקן גענאָמישע דנאַ פֿון נידעריק-קאָנצענטראַציע דנאַ מוסטערן, אַרייַנגערעכנט ccfDNA [36].
רעפּרעזענטאַטיוו ccfDNA עלעקטראָפאָרעגראַם פון מוסל העמאָלימפע. עקסטראַקטירט מיט NucleoSnap פּלאַזמע קיט (אויבן) און QIAamp DNA אויספאָרשער קיט. B וויאָלין פּלאַנעווען וואָס ווייזט די פאַרשפּרייטונג פון העמאָלימפע ccfDNA קאָנצענטראַציעס (±SE) אין מוסלען. די שוואַרצע און רויטע ליניעס רעפּרעזענטירן די מעדיאַן און די ערשטע און דריטע קוואַרטילן, ריספּעקטיוולי.
אומגעפער 1% פון ccfDNA אין מענטשן און פרימאטן האט א פרעמדע מקור [21, 37]. געגעבן די האלב-אפענע קרייזלויף סיסטעם פון בייוואַלוועס, מיקראָביאַל-רייך ים וואַסער, און די גרייס פאַרשפּרייטונג פון מוסל ccfDNA, האָבן מיר כייפּאַטאַסייזד אַז מוסל העמאָלימפע ccfDNA קען אַנטהאַלטן אַ רייַך און דייווערס בעקן פון מיקראָביאַל DNA. צו פּרובירן דעם כייפּאַטאַסאַז, מיר סיקוואַנסט העמאָלימפע ccfDNA פון Aulacomya atra סאַמפּאַלז געזאמלט פון די קערגועלען אינזלען, ייעלדינג איבער 10 מיליאָן רידז, 97.6% פון וואָס דורכגעגאנגען קוואַליטעט קאָנטראָל. די רידז זענען דעמאָלט קלאַסאַפייד לויט זיך און ניט-זיך קוואלן ניצן די BLASTN און NCBI בייוואַלווע דאַטאַבייסעס (פיגור S1, סאַפּלעמענטאַרי אינפֿאָרמאַציע).
ביי מענטשן, קענען ביידע נוקלעארע און מיטאָטשאָנדריאַלע דנ״א ארויסגעלאָזט ווערן אין בלוטשטראָם [38]. אָבער, אין דער איצטיקער שטודיע, איז עס נישט געווען מעגלעך צו באַשרייבן אין דעטאַל די נוקלעארע גענאָמישע דנ״א פון מוסלען, געגעבן אַז די A. atra גענאָם איז נישט סיקווענסט אָדער באַשריבן געוואָרן. אָבער, מיר זענען געווען ביכולת צו ידענטיפיצירן אַ צאָל ccfDNA פראַגמענטן פון אונדזער אייגענעם אָפּשטאַם ניצן די בייוואַלווע ביבליאָטעק (פיגור S2, סאַפּלעמענטאַרי אינפֿאָרמאַציע). מיר האָבן אויך באַשטעטיקט די בייַזייַן פון דנ״א פראַגמענטן פון אונדזער אייגענעם אָפּשטאַם דורך דירעקטעד PCR אַמפּליפיקאַציע פון ​​יענע A. atra גענעס וואָס זענען סיקווענסט געוואָרן (פיגור 3). ענלעך, געגעבן אַז די מיטאָטשאָנדריאַלע גענאָם פון A. atra איז בנימצא אין עפנטלעכע דאַטאַבייסעס, קען מען געפֿינען באַווייַזן פֿאַר די בייַזייַן פון מיטאָטשאָנדריאַלע ccfDNA פראַגמענטן אין די העמאָלימפע פון ​​A. atra. די בייַזייַן פון מיטאָטשאָנדריאַלע דנ״א פראַגמענטן איז באַשטעטיקט געוואָרן דורך PCR אַמפּליפיקאַציע (פיגור 3).
פארשידענע מיטאָטשאָנדריאַלע גענעס זענען געווען פאראן אין דער העמאָלימפע פון ​​A. atra (רויטע פונקטן – סטאק נומער: SRX5705969) און M. platensis (בלוי פונקטן – סטאק נומער: SRX5705968) אַמפּליפיצירט דורך PCR. פיגור אַדאַפּטירט פון ברעטאָן et al., 2011 B אַמפּליפיקאַציע פון ​​העמאָלימפע סופּערנאַטאַנט פון A. atra געהיט אויף FTA פּאַפּיר. ניצט אַ 3 מם לאָך צו לייגן גלייך צו די PCR רער וואָס כּולל די PCR מיקס.
געגעבן דעם גרויסן מיקראביאלן אינהאלט אין ים-וואסער, האבן מיר זיך אנפאנגס פאקוסירט אויף דער כאראקטעריזאציע פון ​​מיקראביאלע דנ״א סיקווענצן אין העמאָלימפע. צו טון דאס, ניצן מיר צוויי פארשידענע סטראטעגיעס. די ערשטע סטראטעגיע האט גענוצט Kraken2, אן אלגאריטם-באזירט סיקווענס קלאסיפיקאציע פראגראם וואס קען אידענטיפיצירן מיקראביאלע סיקווענצן מיט אן אקוראטקייט פארגלייכבאר צו BLAST און אנדערע געצייג [28]. מער ווי 6719 לייענונגען זענען באשטימט געווארן צו זיין פון באַקטיריעלן אפשטאם, בשעת 124 און 64 זענען געווען פון ארכעא און ווירוסן, בהתאמה (פיגור 4). די מערסטע פארשפרייטע באַקטיריעלע דנ״א פראגמענטן זענען געווען פירמיקוטעס (46%), פּראָטעאָבאַקטעריאַ (27%), און באַקטעראָידעטעס (17%) (פיגור 4א). די פארשפרייטונג איז קאנסיסטענט מיט פריערדיגע שטודיעס פון דעם מאַרינע בלוי מוסל מיקראָביאָם [39, 40]. גאַמאַפּראָטעאָבאַקטעריאַ זענען געווען די הויפּט קלאַס פון פּראָטעאָבאַקטעריאַ (44%), אַרייַנגערעכנט פילע וויבריאָנאַלעס (פיגור 4ב). די ddPCR מעטאָדע האָט באַשטעטיקט די אנוועזנהייט פון וויבריאָ דנאַ פראַגמענטן אין די ccfDNA פון A. atra העמאָלימפע (פיגור 4c) [41]. כּדי צו באַקומען מער אינפֿאָרמאַציע וועגן דעם באַקטיריעלן אָפּשטאַם פון ccfDNA, איז גענומען געוואָרן אַן נאָך צוגאַנג (פיגור S2, צוגאב אינפֿאָרמאַציע). אין דעם פאַל, לייענונגען וואָס האָבן זיך איבערגעלאַפּט זענען צוזאַמענגעשטעלט געוואָרן ווי פּאָר-ענד לייענונגען און זענען קלאַסיפיצירט געוואָרן ווי פון זיך- (ביוואַלווען) אָדער נישט-זעלבסט אָפּשטאַם ניצנדיק BLASTN און אַן e ווערט פון 1e−3 און אַ גרענעץ-איבערשניט מיט >90% האָמאָלאָגיע. אין דעם פאַל, לייענונגען וואָס האָבן זיך איבערגעלאַפּט זענען צוזאַמענגעשטעלט געוואָרן ווי פּאָר-ענד לייענונגען און זענען קלאַסיפיצירט געוואָרן ווי פון זיך- (ביוואַלווען) אָדער נישט-זעלבסט אָפּשטאַם ניצנדיק BLASTN און אַן e ווערט פון 1e−3 און אַ גרענעץ-איבערשניט מיט >90% האָמאָלאָגיע. עס איז מעגלעך צו אַרבעטן מיט קאָנסומערס און קאָנסומערס אין קאַנסאַלטינג. (דורכגעמאכט מאַלישאַס) אָדער 1e-3 און 9% קאַנסאַנטריישאַן מיט יקסעפּשאַנאַל בלאַסטן און 1-3 און 9 פּראָצענט. אין דעם פאַל, אָוווערלאַפּינג רידז זענען געזאַמלט געוואָרן ווי פּאָר-ענדיקטע רידז און זענען קלאַסיפיצירט געוואָרן ווי נאַטירלעכע (ביוואַלוו) אָדער ניט-אָריגינעל ניצנדיק BLASTN און e ווערט פון 1e-3 און קאַטאָף מיט >90% האָמאָלאָגי.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和和和和和和和和和和和和和和和和和和和数皒> 在这种情况下同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 , 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 , 使用 使用 使焨 使焚 焚 的 的 的 的值 和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。. ווי עס איז מעגלעך צו אַרבעטן מיט די קאַנסאָול און קאַלאַססיפיקאַטיאָנס. (דוווסטוואָרטשאַטыע מאַלישאַס) אָדער ניט-נוסעסיוולי פֿאַר פּראָוסידזשערז מיט יקסעפּשאַנאַל און בלאַסטן און 1e-3 און 9% פון 0%. אין דעם פאַל, אָוווערלאַפּינג רידס זענען געזאַמלט געוואָרן ווי פּאָר-ענדיקטע רידס און קלאַסיפיצירט ווי אייגענע (ביוואַלוועס) אָדער נישט-אָריגינעל ניצן e BLASTN און 1e-3 ווערטן און אַ האָמאָלאָגי שוועל >90%.זינט דער A. atra גענאָם איז נאָך נישט סיקווענסט געוואָרן, האָבן מיר גענוצט די דע נאָוואָ אַסעמבלי סטראַטעגיע פון ​​די MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) אַסעמבלער. א סך הכל פון 147,188 קאָנטיגס זענען אידענטיפיצירט געוואָרן ווי אָפּהענגיקע (ביוואַלוועס) פון אָפּשטאַם. די קאָנטיגס זענען דערנאָך עקספּלאָדירט געוואָרן מיט e-ווערטן פון 1e-10 ניצנדיק BLASTN און BLASTX. די סטראַטעגיע האָט אונדז דערלויבט צו אידענטיפיצירן 482 נישט-ביוואַלווע פראַגמענטן וואָס געפינען זיך אין A. atra ccfDNA. מער ווי האַלב (57%) פון די DNA פראַגמענטן זענען באַקומען געוואָרן פון באַקטעריעס, הויפּטזעכלעך פון קימל סימביאָנטן, אַרייַנגערעכנט סולפאָטראָפֿישע סימביאָנטן, און פון קימל סימביאָנטן סאָלעמיאַ וועלום (פיגור 5).
רעלאַטיווע שעפע אויף דעם טיפּ לעוועל. ב מיקראָביאַלע דייווערסיטי פון צוויי הויפּט פילאַ (פירמיקוטעס און פּראָטעאָבאַקטעריאַ). רעפּרעזענטאַטיווע אַמפּליפיקאַציע פון ​​ddPCR C וויבריאָ מינים. א. פראַגמענטן פון די 16S rRNA גען (בלוי) אין דריי אַטראַ העמאָלימפן.
א סך הכל פון 482 געזאמלטע קאָנטיגס זענען אנאליזירט געווארן. אלגעמיינער פּראָפיל פון דער טאַקסאָנאָמישער פאַרשפּרייטונג פון מעטאַגענאָמישע קאָנטיג אַנאָטאַציעס (פּראָקאַריאָטן און עוקאַריאָטן). ב דעטאַלירטער פאַרשפּרייטונג פון באַקטיריעלע דנאַ פראַגמענטן אידענטיפיצירט דורך BLASTN און BLASTX.
Kraken2 אנאליז האט אויך געוויזן אז מוסל ccfDNA האט אנטהאלטן ארכעאלע DNA פראגמענטן, אריינגערעכנט DNA פראגמענטן פון Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%), און Thaurmarcheota (11%) (פיגור 6a). די אנוועזנהייט פון DNA פראגמענטן וואס שטאמען פון Euryarchaeota און Crenarchaeota, וואס זענען פריער געפונען געווארן אין דער מיקראביאלער געמיינדע פון ​​קאליפארנישע מוסלען, זאל נישט קומען אלס קיין איבערראשונג [42]. כאטש Euryarchaeota ווערט אפט פארבונדן מיט עקסטרעמע באדינגונגען, ווערט יעצט דערקענט אז ביידע Euryarchaeota און Crenarcheota זענען צווישן די מערסטע פארשפרייטע פראקאריאטן אין דער מארינער קריאגענישער סביבה [43, 44]. די אנוועזנהייט פון מעטאנאגענישע מיקראארגאניזמען אין מוסלען איז נישט קיין איבערראשונג, געגעבן די לעצטע באריכטן פון ברייטע מעטאן ליקס פון דנאָ ליקס אויף דעם קערגועלען פּלאַטאָ [45] און מעגלעכע מיקראביאלע מעטאן פּראָדוקציע באמערקט לעבן דעם ברעג פון די קערגועלען אינזלען [46].
אונדזער אויפמערקזאמקייט האט זיך דאן אריבערגעפירט צו לייענונגען פון דנ״א ווירוסן. לויט אונזער וויסן, איז דאס די ערשטע נישט-געצילטע שטודיע פון ​​דעם ווירוס אינהאלט פון מוסלען. ווי ערווארטעט, האבן מיר געפונען דנ״א פראגמענטן פון באקטעריאפאגן (קאודאוויראלעס) (פיגור 6ב). אבער, די מערסטע פארשפרייטע וויראלע דנ״א קומט פון א פילום פון נוקלעאציטאווירוסן, אויך באקאנט אלס דער נוקלעארער ציטאפלאזמישער גרויסער דנ״א ווירוס (NCLDV), וואס האט דעם גרעסטן גענאם פון יעדן ווירוס. אין דעם פילום, געהערן רוב דנ״א סיקווענצן צו די פאמיליעס מימימידאווירידא (58%) און פאקסווירידא (21%), וועמענס נאטירלעכע באלעבאטים שליסן איין ווערטעבראטן און ארטראפאדן, בשעת א קליינער פראפארציע פון ​​די דנ״א סיקווענצן געהערן צו באקאנטע וויראלאגישע אלגע. אינפעקטירט מארינע עוקאריאטישע אלגע. די סיקווענצן זענען אויך באקומען געווארן פון דעם פאנדארא ווירוס, דער ריז ווירוס מיט דער גרעסטער גענאם גרייס פון יעדן באקאנטן וויראלן גענעראַ. אינטערעסאנט, די קייט פון באלעבאטים באקאנט צו זיין אינפעקטירט מיט דעם ווירוס, ווי באשטימט דורך העמאָלימפע ccfDNA סיקווענסינג, איז געווען רעלאטיוו גרויס (פיגור S3, צוגאב אינפארמאציע). עס נעמט אריין ווירוסן וואָס אָנשטעקן אינסעקטן ווי באַקולאָווירידע און אירידאָווירידע, ווי אויך ווירוסן וואָס אָנשטעקן אַמיבעס, אַלדזשי און ווערטעבראַטן. מיר האָבן אויך געפֿונען סיקוואַנסן וואָס פּאַסן צום פּיטהאָווירוס סיבעריקום גענאָם. פּיטאָווירוסן (אויך באַקאַנט ווי "זאָמבי ווירוסן") זענען ערשט אפגעזונדערט געוואָרן פֿון 30,000 יאָר אַלט פּערמאַפֿראָסט אין סיביר [47]. אַזוי, אונדזערע רעזולטאַטן זענען קאָנסיסטענט מיט פֿריִערדיקע באַריכטן וואָס ווייַזן אַז נישט אַלע מאָדערנע מינים פֿון די ווירוסן זענען אויסגעשטאָרבן [48] און אַז די ווירוסן קענען זיין פאָרשטעלן אין ווייטע סובאַרקטישע מאַרינע עקאָסיסטעמען.
צום סוף, האָבן מיר געטעסט צו זען צי מיר קענען געפֿינען DNA פֿראַגמענטן פֿון אַנדערע מולטיסעלולאַרע חיות. אַ סך־הכּל פֿון 482 פֿרעמדע קאָנטיגס זענען אידענטיפֿיצירט געוואָרן דורך BLASTN און BLASTX מיט nt, nr און RefSeq ביבליאָטעקן (גענאָמיש און פּראָטעין). אונדזערע רעזולטאַטן ווײַזן אַז צווישן די פֿרעמדע פֿראַגמענטן פֿון ccfDNA פֿון מולטיסעלולאַרע חיות דאָמינירט DNA פֿון ביינער (פֿיג. 5). DNA פֿראַגמענטן פֿון אינסעקטן און אַנדערע מינים זענען אויך געפֿונען געוואָרן. אַ רעלאַטיוו גרויסער טייל פֿון די DNA פֿראַגמענטן איז נישט אידענטיפֿיצירט געוואָרן, מעגלעך צוליב דער אונטעררעפּרעזענטאַציע פֿון אַ גרויסער צאָל מאַרינע מינים אין גענאָמישע דאַטאַבייסעס אין פֿאַרגלײַך מיט טעראַסטרישע מינים [49].
אין דער איצטיקער פאפיר, נוצן מיר דעם LB קאנצעפט צו מוסלען, טענה'נדיג אז העמאָלימפע ccfDNA שאט סיקווענסינג קען געבן אן איינבליק אין דער צוזאמענשטעלונג פון מארינע קוסט עקא-סיסטעמען. אין באזונדער, האבן מיר געפונען אז 1) מוסעל העמאָלימפע אנטהאלט רעלאטיוו הויכע קאנצענטראציעס (מיקראגראם לעוועלס) פון רעלאטיוו גרויסע (~1-5 קב) צירקולירנדע DNA פראגמענטן; 2) די DNA פראגמענטן זענען ביידע אומאפהענגיק און נישט-אומאפהענגיק 3) צווישן די פרעמדע קוועלער פון די DNA פראגמענטן, האבן מיר געפונען באַקטיריעלע, ארכעאלע און וויראלע DNA, ווי אויך DNA פון אנדערע מולטיסעלולארע בעלי חיים; 4) די אקומולאציע פון ​​די פרעמדע ccfDNA פראגמענטן אין דער העמאָלימפע פאסירט שנעל און ביישטייערט צו דער אינערליכער פילטערינג טעטיקייט פון מוסלען. אין מסקנא, אונזער שטודיע ווייזט אז דער קאנצעפט פון LB, וואס איז ביז איצט געווען אנגעווענדט מערסטנס אין דעם פעלד פון ביאמעדיצין, קאדירט א רייכע אבער אומאויסגעפארשטע מקור פון וויסן וואס קען ווערן גענוצט צו בעסער פארשטיין די אינטעראקציע צווישן סענטינעל מינים און זייער סביבה.
אין צוגאב צו פרימאטן, איז ccfDNA אפגעזונדערטקייט געמאלדן געווארן אין זויגערס, אריינגערעכנט מײַז, הינט, קעץ, און פערד [50, 51, 52]. אבער, לויט אונזער וויסן, איז אונזער שטודיע די ערשטע צו באריכטן די דעטעקציע און סיקווענסינג פון ccfDNA אין ים מינים מיט אן אפענעם צירקולאציע סיסטעם. די אנטאמאטישע אייגנשאפט און פילטערינג פעאיקייט פון מוסלען קען, כאטש טיילווייז, דערקלערן די אנדערע גרייס אייגנשאפטן פון צירקולירנדע DNA פראגמענטן קאמפערד צו אנדערע מינים. אין מענטשן, זענען רוב DNA פראגמענטן וואס צירקולירן אין בלוט קליינע פראגמענטן וואס ריינדזשען אין גרייס פון 150 ביז 200 bp. מיט א מאקסימום שפיץ פון 167 bp [34, 53]. א קליינער אבער באדייטנדער טייל פון DNA פראגמענטן זענען צווישן 300 און 500 bp אין גרייס, און בערך 5% זענען לענגער ווי 900 bp. [54]. די סיבה פֿאַר דעם גרייס פאַרשפּרייטונג איז אַז די הויפּט מקור פון ccfDNA אין פּלאַזמע קומט פֿאָר ווי אַ רעזולטאַט פון צעל טויט, צי צוליב צעל טויט צי צוליב נעקראָזיס פון סערקולירנדיקע העמאַטאָפּאָיעטיק צעלן אין געזונטע מענטשן צי צוליב אַפּאָפּטאָסיס פון טומאָר צעלן אין ראַק פּאַציענטן (באַקאַנט ווי סערקולירנדיק טומאָר DNA). , ctDNA). די גרייס פאַרשפּרייטונג פון העמאָלימפע ccfDNA וואָס מיר האָבן געפֿונען אין מוסלען איז געווען פון 1000 צו 5000 bp, וואָס סאַגדזשעסט אַז מוסל ccfDNA האט אַ אַנדערש אָפּשטאַם. דאָס איז אַ לאָגישע היפּאָטעזע, ווייַל מוסלען האָבן אַ האַלב-אָפענע וואַסקולאַר סיסטעם און לעבן אין מאַרינע וואַסער סביבות מיט הויך קאַנסאַנטריישאַנז פון מיקראָביאַל גענאָמיש DNA. אין פאַקט, אונדזער לאַבאָראַטאָריע עקספּערימענטן ניצן עקסאָגענאָוס DNA האָבן געוויזן אַז מוסלען אַקומולירן DNA פראַגמענטן אין ים וואַסער, לפּחות נאָך אַ ביסל שעה זיי זענען דיגראַדאַד נאָך צעלולאַרע אַפּטייק און / אָדער באַפרייט און / אָדער סטאָרד אין פאַרשידענע אָרגאַניזאַציעס. געגעבן די זעלטנקייט פון צעלן (ביידע פּראָקאַריאָטיק און עוקאַריאָטיק), די נוצן פון ינטראַוואַלווולאַר אָפּטייל וועט רעדוצירן די סומע פון ​​ccfDNA פון זיך-קוואַלן ווי געזונט ווי פון פרעמדע קוואַלן. באַטראַכטנדיק די וויכטיקייט פון ביוואַלוו ינאַטע ימיונאַטי און די גרויסע צאָל פון סערקיאַלייטינג פאַגאָסיטעס, האָבן מיר ווייטער כייפּאַטאַסייזד אַז אפילו פרעמד ccfDNA איז ענריטשט אין סערקיאַלייטינג פאַגאָסיטעס וואָס אַקומולירן פרעמד דנ"א ביי די ינדזשעסטשאַן פון מיקראָאָרגאַניזאַמז און/אָדער צעלולאַר דעבריס. צוזאַמען גענומען, אונדזער רעזולטאַטן ווייַזן אַז ביוואַלוו העמאָלימפע ccfDNA איז אַ יינציק ריפּאַזאַטאָרי פון מאָלעקולאַר אינפֿאָרמאַציע און פארשטארקט זייער סטאַטוס ווי אַ סענטינעל מינים.
אונדזערע דאַטן ווײַזן אָן אַז סיקווענסינג און אַנאַליז פון באַקטיריאַל-דערייווד העמאָלימפע ccfDNA פראַגמענטן קען צושטעלן שליסל אינפֿאָרמאַציע וועגן די באַלעבאָס באַקטיריאַל פלאָראַ און די באַקטיריאַ פאָרשטעלן אין די אַרומיק מאַרינע עקאָסיסטעם. שאָט סיקווענסינג טעקניקס האָבן אַנטפּלעקט סיקווענסעס פון די קאָמענסאַל באַקטיריאַ A. atra gill וואָס וואָלט געווען פאַרפעלט אויב קאַנווענשאַנאַל 16S rRNA אידענטיפיקאַציע מעטהאָדס וואָלט געווען געניצט, רעכט אין טייל צו אַ רעפֿערענץ ביבליאָטעק בייאַס. אין פאַקט, אונדזער נוצן פון LB דאַטן געזאמלט פון M. platensis אין דער זעלביקער מוסל שיכטע אין קערגועלען האט געוויזן אַז די זאַץ פון גill-פֿאַרבונדענע באַקטיריאַל סימביאָנס איז געווען די זעלבע פֿאַר ביידע מוסל מינים (פיגור S4, סאַפּלעמענטאַרי אינפֿאָרמאַציע). די ענלעכקייט פון צוויי דזשאַנעטיקלי פאַרשידענע מוסלס קען שפּיגלען די זאַץ פון באַקטיריאַל קהילות אין די קאַלט, שוועבל-רייַך און וואַלקאַניק דיפּאַזאַץ פון קערגועלען [55, 56, 57, 58]. העכער לעוועלס פון שוועבל-רעדוצירנדיק מיקראָאָרגאַניזאַמז זענען געווען גוט דיסקרייבד ווען כאַרוואַסטינג מוסלס פון ביאָטורבייטיד קאָוסטאַל געביטן [59], אַזאַ ווי די קאָוסט פון פּאָרט-אָו-פֿראַנקרייַך. נאך א מעגלעכקייט איז אז די קאמענסאלע מוסל פלאָרא קען זיין באאיינפלוסט דורך האריזאנטאלע טראנסמיסיע [60, 61]. מער פאָרשונג איז דארף צו באַשטימען די קאָרעלאַציע צווישן די מאַרינע סביבה, ים שטאָק ייבערפלאַך, און די זאַץ פון סימביאָטישע באַקטעריע אין מוסלען. די שטודיעס זענען איצט אין גאַנג.
די לענג און קאנצענטראציע פון ​​העמאָלימפע ccfDNA, איר גרינגקייט פון רייניקונג, און הויכע קוואַליטעט צו דערמעגלעכן שנעלע שאָטגאַן סיקווענסינג זענען עטלעכע פון ​​די פילע אַדוואַנטאַגעס פון ניצן מוסל ccfDNA צו אַססעסס ביאָדיווערסיטי אין מאַרינע קאָוסטאַל עקאָסיסטעמען. דעם צוגאַנג איז ספּעציעל עפעקטיוו פֿאַר קעראַקטעריזירן וויראַל קהילות (וויראָמעס) אין אַ געגעבן עקאָסיסטעם [62, 63]. ניט ווי באַקטיריאַ, אַרכעאַ, און עוקאַריאָטעס, וויראַל גענאָמעס טאָן ניט אַנטהאַלטן פילאָגענעטיקלי קאָנסערווד גענעס אַזאַ ווי 16S סיקוואַנסעס. אונדזער רעזולטאַטן ווייַזן אַז פליסיק ביאָפּסיעס פון ינדיקאַטאָר מינים אַזאַ ווי מוסלען קענען זיין געניצט צו ידענטיפיצירן לעפיערעך גרויס נומערן פון ccfDNA ווירוס פראַגמאַנץ באַוווסט צו ינפעקטירן כאָוסץ וואָס טיפּיקלי באַוווינען קאָוסטאַל מאַרינע עקאָסיסטעמען. דאָס כולל ווירוסעס באַוווסט צו ינפעקטירן פּראָטאָזאָאַ, אַרטראָפּאָדס, ינסעקץ, געוויקסן, און באַקטיריאַל ווירוסעס (למשל, באַקטעריאָפאַגעס). א ענלעכע פאַרשפּרייטונג איז געפֿונען ווען מיר האָבן יגזאַמאַנד די העמאָלימפע ccfDNA וויראָמע פון ​​בלוי מוסלען (M. platensis) געזאמלט אין דער זעלביקער מוסל שיכטע אין קערגועלען (טאַבעלע S2, סאַפּלעמענטאַרי אינפֿאָרמאַציע). שאָטגאַן סיקווענסינג פון ccfDNA איז טאַקע אַ נייַער צוגאַנג וואָס געווינט מאָמענטום אין דער שטודיע פון ​​די וויראָם פון מענטשן אָדער אַנדערע מינים [21, 37, 64]. דער צוגאַנג איז ספּעציעל נוצלעך פֿאַר שטודירן טאָפּל-שטראַנדעד DNA ווירוסן, ווייַל קיין איין גען איז נישט קאָנסערווירט צווישן אַלע טאָפּל-שטראַנדעד DNA ווירוסן, וואָס רעפּרעזענטירט די מערסט דייווערס און ברייט קלאַס פון ווירוסן אין באַלטימאָר [65]. כאָטש רובֿ פון די ווירוסן בלייבן אַנקלאַסיפיצירט און קען אַרייַננעמען ווירוסן פון אַ גאָר אומבאַקאַנט טייל פון דער וויראַל וועלט [66], מיר געפֿונען אַז די וויראָמעס און באַלעבאָס ריינדזשאַז פון די מוסלען A. atra און M. platensis פאַלן צווישן די צוויי מינים. ענלעך (זען פיגור S3, נאָך אינפֿאָרמאַציע). די ענלעכקייט איז נישט חידוש, ווייַל עס קען שפּיגלען אַ מאַנגל פון סעלעקטיוויטי אין אַפּטייק פון DNA פאָרשטעלן אין דער סביבה. צוקונפֿט שטודיעס ניצן פּיוראַפייד RNA זענען דערווייַל דארף צו כאַראַקטערייז די RNA וויראָם.
אין אונדזער שטודיע, האָבן מיר גענוצט אַ זייער שטרענגע פּייפּליין אַדאַפּטירט פֿון דער אַרבעט פֿון קאָוואַרסקי און קאָלעגן [37], וועלכע האָבן גענוצט אַ צוויי-סטעפּ דילישאַן פֿון פּולד רידס און קאָנטיגס פֿאַר און נאָך אַסעמבלי פֿון נאַטירלעכער ccfDNA, וואָס האָט רעזולטירט אין אַ הויכן פּראָפּאָרציע פֿון נישט-געמאַפּטע רידס. דעריבער, קענען מיר נישט אויסשליסן אַז עטלעכע פֿון די נישט-געמאַפּטע רידס קענען נאָך האָבן זייער אייגענעם אָפּשטאַם, הויפּטזעכלעך ווייל מיר האָבן נישט קיין רעפֿערענץ גענאָם פֿאַר דעם מוסל מינים. מיר האָבן אויך גענוצט דעם פּייפּליין ווייל מיר זענען געווען באַזאָרגט וועגן די כימעראַס צווישן זיך- און נישט-זעלבסט-רידס און די ריד לענגקטס גענערירט דורך די Illumina MiSeq PE75. נאָך אַ סיבה פֿאַר די מערהייט פֿון נישט-געמאַרטע רידס איז אַז אַ סך פֿון די מאַרינע מיקראָבן, ספּעציעל אין ווייטע געביטן ווי קערגועלען, זענען נישט אַנאָטירט געוואָרן. מיר האָבן גענוצט Illumina MiSeq PE75, אַננעמענדיק ccfDNA פֿראַגמענט לענגקטס ענלעך צו מענטשלעכע ccfDNA. פֿאַר צוקונפֿטיקע שטודיעס, געגעבן אונדזערע רעזולטאַטן וואָס ווייַזן אַז העמאָלימפֿע ccfDNA האָט לענגערע רידס ווי מענטשן און/אָדער זויגערס, רעקאָמענדירן מיר צו נוצן אַ סיקווענסינג פּלאַטפאָרמע מער פּאַסיק פֿאַר לענגערע ccfDNA פֿראַגמענטן. די פּראַקטיק וועט מאַכן עס פיל גרינגער צו ידענטיפיצירן מער אינדיקאַציעס פֿאַר טיפער אַנאַליז. באַקומען די איצט נישט בנימצא גאַנץ A. atra נוקלעאַר גענאָם סיקוואַנס וואָלט אויך זייער פאַסילאַטייט די אונטערשיידונג פון ccfDNA פון זיך- און נישט-זיך-קוואַלן. געגעבן אַז אונדזער פאָרשונג האט זיך פאָקוסירט אויף דער מעגלעכקייט פון אַפּלייינג דעם באַגריף פון פליסיק ביאָפּסי צו מוסלען, מיר האָפן אַז ווי דעם באַגריף וועט ווערן גענוצט אין צוקונפֿט פאָרשונג, וועלן נייע מכשירים און פּייפּליינז ווערן דעוועלאָפּעד צו פאַרגרעסערן דעם פּאָטענציעל פון דעם אופֿן צו שטודירן די מיקראָביאַל דייווערסיטי פון מוסלען אין מאַרינע עקאָסיסטעם.
אלס א נישט-אינוואזיווער קלינישער ביאָמאַרקער, זענען עלעוואַטעד מענטשלעכע פּלאַזמע לעוועלס פון ccfDNA פֿאַרבונדן מיט פֿאַרשידענע קראַנקייטן, געוועב שאָדן, און סטרעס באדינגונגען [67,68,69]. די פאַרגרעסערונג איז פֿאַרבונדן מיט דער באַפֿרײַונג פֿון DNA פֿראַגמענטן פֿון איר אייגענעם אָפּשטאַם נאָך געוועב שאָדן. מיר האָבן אַדרעסירט דעם פּראָבלעם ניצן אַקוטע היץ סטרעס, אין וועלכע מוסלען זענען קורץ אויסגעשטעלט געוואָרן צו אַ טעמפּעראַטור פֿון 30 °C. מיר האָבן דורכגעפֿירט די אַנאַליז אויף דריי פֿאַרשידענע טיפּן מוסלען אין דריי אומאָפּהענגיקע עקספּערימענטן. אָבער, מיר האָבן נישט געפֿונען קיין ענדערונג אין ccfDNA לעוועלס נאָך אַקוטע היץ סטרעס (זען פֿיגור S5, נאָך אינפֿאָרמאַציע). די ענטדעקונג קען דערקלערן, לפּחות טיילווייז, דעם פֿאַקט אַז מוסלען האָבן אַ האַלב-אָפֿן קרייזלויף סיסטעם און אָנקלייַבן גרויסע סומעס פֿון פֿרעמד DNA רעכט צו זייער הויך פֿילטערינג טעטיקייט. פֿון דער אַנדערער זײַט, מוסלען, ווי פֿיל ינווערטעבראַטעס, קען זײַן מער קעגנשטעליק צו סטרעס-ינדוסט געוועב שאָדן, דערמיט באַגרענעצן די באַפֿרײַונג פֿון ccfDNA אין זייער העמאָלימפֿע [70, 71].
ביז היינט, האט DNA אנאליז פון ביאָדיווערסיטי אין וואַסער עקאָסיסטעמען זיך הויפּטזעכלעך פאָקוסירט אויף ענווייראָנמענטאַל DNA (eDNA) מעטאַבאַרקאָדינג. אָבער, די מעטאָדע איז געוויינטלעך באַגרענעצט אין ביאָדיווערסיטי אנאליז ווען פּריימערס ווערן גענוצט. די נוצן פון שאָטגאַן סיקוואַנסינג אַרומגייט די באַגרענעצונגען פון PCR און די בייאַסד סעלעקציע פון ​​פּריימער סעץ. אַזוי, אין אַ זין, איז אונדזער מעטאָדע נעענטער צו די לעצטנס גענוצטע הויך-דורכפֿלוס eDNA שאָטגאַן סיקוואַנסינג מעטאָדע, וואָס איז ביכולת צו דירעקט סיקוואַנסינג פראַגמענטעד DNA און אַנאַליזירן כּמעט אַלע אָרגאַניזמען [72, 73]. אָבער, עס זענען אַ נומער פון פונדאַמענטאַל ישוז וואָס אונטערשיידן LB פון נאָרמאַל eDNA מעטאָדן. פון קורס, דער הויפּט חילוק צווישן eDNA און LB איז די נוצן פון נאַטירלעך פילטער האָסץ. די נוצן פון מאַרינע מינים אַזאַ ווי ספּאַנדזשאַז און ביוואַלוועס (Dresseina spp.) ווי אַ נאַטירלעך פילטער פֿאַר לערנען eDNA איז געווען געמאלדן [74, 75]. אָבער, דרייסענאַ ס לערנען גענוצט געוועב ביאָפּסיעס פון וועלכע DNA איז געווען עקסטראַקטעד. אנאליז פון ccfDNA פון LB ריקווייערז נישט געוועב ביאָפּסי, ספּעשאַלייזד און מאל טייַער ויסריכט און לאָגיסטיק פֿאַרבונדן מיט eDNA אָדער געוועב ביאָפּסי. אין פאַקט, מיר האָבן לעצטנס געמאלדן אַז ccfDNA פֿון LB קען ווערן געהאַלטן און אַנאַליזירט מיט FTA שטיצע אָן צו האַלטן אַ קאַלט קייט, וואָס איז אַ הויפּט אַרויסרופן פֿאַר פאָרשונג אין ווייַט געביטן [76]. די עקסטראַקציע פֿון ccfDNA פֿון פליסיק ביאָפּסיעס איז אויך פּשוט און גיט הויך קוואַליטעט DNA פֿאַר שאָטגאַן סיקוואַנסינג און PCR אַנאַליסיס. דאָס איז אַ גרויס מייַלע געגעבן עטלעכע פון ​​די טעכנישע לימיטיישאַנז פֿאַרבונדן מיט eDNA אַנאַליסיס [77]. די פּשוטקייט און נידעריק קאָסטן פון די סאַמפּלינג מעטאָד איז אויך ספּעציעל פּאַסיק פֿאַר לאַנג-טערמין מאָניטאָרינג מגילה. אין אַדישאַן צו זייער הויך פילטערינג פיייקייַט, אן אנדער באַוווסט שטריך פון בייוואַלוועס איז די כעמישער מוקאָפּאָליסאַקאַריד קאַמפּאַזישאַן פון זייער מוקוס, וואָס פּראַמאָוץ די אַבזאָרפּשאַן פון ווירוסעס [78, 79]. דאָס מאכט בייוואַלוועס אַן ידעאַל נאַטירלעך פילטער פֿאַר קעראַקטעריזינג בייאָודייווערסאַטי און די פּראַל פון קלימאַט ענדערונג אין אַ געגעבן וואַסער עקאָסיסטעם. כאָטש די בייַזייַן פון באַלעבאָס-דערייווד DNA פראַגמאַנץ קען זיין געזען ווי אַ לימיטיישאַן פון די מעטאָד קאַמפּערד צו eDNA, די קאָסטן פֿאַרבונדן מיט האָבן אַזאַ אַ נאַטיוו ccfDNA קאַמפּערד צו eDNA איז סיימאַלטייניאַסלי פֿאַרשטענדלעך פֿאַר די ריזיק סומע פון ​​אינפֿאָרמאַציע בנימצא פֿאַר געזונט שטודיעס. אָפסעט באַלעבאָס. דאָס נעמט אַרײַן די אנוועזנהייט פֿון וויראַלע סיקוואַנסן וואָס זענען אינטעגרירט אין דעם גענאָם פֿונעם באַלעבאָס. דאָס איז ספּעציעל וויכטיק פֿאַר מוסלען, געגעבן די אנוועזנהייט פֿון האָריזאָנטאַל טראַנסמיטירטע לוקעמישע רעטראָווירוסן אין ביוואַלוועס [80, 81]. נאָך אַ פֿאָרטייל פֿון LB איבער eDNA איז אַז עס נוצט אויס די פֿאַגאָציטישע אַקטיוויטעט פֿון צירקולירנדיקע בלוט צעלן אין דער העמאָלימפֿע, וואָס פֿאַרנעמט מיקראָאָרגאַניזמען (און זייערע גענאָמען). פֿאַגאָציטאָזיס איז די הויפּט פֿונקציע פֿון בלוט צעלן אין ביוואַלוועס [82]. צום סוף, נוצט די מעטאָדע אויס די הויכע פֿילטערינג קאַפּאַציטעט פֿון מוסלען (דורכשניטלעך 1.5 ל/שעה ים וואַסער) און צוויי-טאָגיקע צירקולאַציע, וואָס פֿאַרגרעסערן די מישונג פֿון פֿאַרשידענע שיכטן ים וואַסער, און דערמעגלעכן די כאַפּונג פֿון העטעראָלאָגוס eDNA. [83, 84]. אַזוי, מוסל ccfDNA אַנאַליז איז אַן אינטערעסאַנטער וועג געגעבן די נוטרישאַנעלע, עקאָנאָמישע און סביבהדיקע השפּעות פֿון מוסלען. ענלעך צו דער אַנאַליז פֿון LB געזאַמלט פֿון מענטשן, עפֿנט די מעטאָדע אויך די מעגלעכקייט צו מעסטן גענעטישע און עפּיגענעטישע ענדערונגען אין באַלעבאָס DNA אין ענטפֿער צו עקסאָגענע סאַבסטאַנסן. למשל, דריטע-גענעראציע סיקווענסינג טעכנאָלאָגיעס קענען פֿאָרגעשטעלט ווערן צו דורכפֿירן גענאָם-ברייט מעטילאַציע אַנאַליז אין נאַטירלעכער ccfDNA ניצנדיק נאַנאָפּאָר סיקווענסינג. דעם פּראָצעס זאָל פֿאַרלייכטערט ווערן דורך דעם פֿאַקט אַז די לענג פֿון די מוסל ccfDNA פֿראַגמענטן איז ידעאַל קאָמפּאַטיבל מיט לאַנג-לייענען סיקווענסינג פּלאַטפֿאָרמעס וואָס דערמעגלעכן גענאָם-ברייטע DNA מעטילאַציע אַנאַליז פֿון אַ איין סיקווענסינג לויף אָן די נויט פֿאַר כעמישע טראַנספֿאָרמאַציעס.85,86] דאָס איז אַן אינטערעסאַנטע מעגלעכקייט, ווײַל עס איז געוויזן געוואָרן אַז DNA מעטילאַציע פּאַטערנז שפּיגלען אָפּ אַ רעאַקציע צו סביבה-דרוק און בלייבן איבער פֿילע דורות. דעריבער, קען עס צושטעלן ווערטפֿולע אײַנבליקן אין די אונטערלייגנדיקע מעקאַניזמען וואָס רעגירן רעאַקציע נאָך ויסשטעלן צו קלימאַט ענדערונג אָדער פֿאַרפּעסטיקונג [87]. אָבער, די נוצן פֿון LB איז נישט אָן לימיטאַציעס. ניט נויטיק צו זאָגן, דאָס פֿאָדערט די בייַזייַן פֿון אינדיקאַטאָר מינים אין דער עקאָסיסטעם. ווי דערמאָנט אויבן, די נוצן פֿון LB צו אָפּשאַצן די ביאָדיווערסיטי פֿון אַ געגעבענער עקאָסיסטעם פֿאָדערט אויך אַ שטרענגע ביאָאינפֿאָרמאַטיק רערנ-ליניע וואָס נעמט אין חשבון די בייַזייַן פֿון DNA פֿראַגמענטן פֿון דער מקור. נאָך אַ הויפּט פּראָבלעם איז די פֿאַרפֿיגבאַרקייט פֿון רעפֿערענץ גענאָמען פֿאַר מאַרינע מינים. מען האפט אז איניציאטיוון ווי דער מאַרינע זויגערס גענאָמען פּראָיעקט און דער לעצטנס געגרינדעטער Fish10k פּראָיעקט [88] וועלן ערלייכטערן אזעלכע אנאליזן אין דער צוקונפט. די אנווענדונג פון דעם LB קאנצעפט צו מאַרינע פילטער-פיטערנדיקע ארגאניזמען איז אויך קאָמפּאַטיבל מיט די לעצטע פארשריטן אין סיקווענסינג טעכנאָלאָגיע, מאַכנדיג עס גוט פּאַסיק פֿאַר דער אַנטוויקלונג פון מולטי-אָהם ביאָמאַרקערס צו צושטעלן וויכטיקע אינפֿאָרמאַציע וועגן דער געזונטהייט פון מאַרינע לעבנס-שטחים אין ענטפער צו סביבה-דרוק.
גענאָם סיקווענסינג דאַטן זענען דעפּאַזיטעד אין די NCBI סיקווענס לייענען אַרכיוו https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 אונטער ביאָפּראָיעקטן SRR8924808.
בריערלי AS, קינגספארד MJ אימפאקט פון קלימאט ענדערונג אויף ים לעבן און עקאסיסטעמען. קאול ביאלאגיע. 2009; 19: P602–P614.
גיסי ע, מאַנעאַ ע, מאַזאַריס אַ.ד., פראַשעטי ס, אַלמפּאַנידו וו, בעווילאַקוואַ ס, און אַנדערע. באַטראַכטן די קאָמבינירטע ווירקונגען פון קלימאַט ענדערונג און אַנדערע לאָקאַלע דרוק-פאַקטאָרן אויף דער מאַרינער סביבה. אַלגעמיינע וויסנשאַפטלעכע סביבה. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al. ). וויסנשאַפֿט פון דער ערשטער פון מאַרץ. 2020;7:48.
סעראנט ל, ניקאסטרא סי אר, זארדי ג'י, גאבערוויל ע. פארקלענערטע היץ טאלעראנץ אונטער איבערחזרנדיקע היץ סטרעס באדינגונגען דערקלערט די הויכע זומער שטערבליכקייט פון בלויע מוסלען. וויסנשאפטלעכער באריכט 2019; 9:17498.
פעי ס.ב., סיעפּיעלסקי אַ.מ., נוסלע ס., סערוואַנטעס-יאָשידאַ ק., הוואַן דזש.ל., הובער ע.ר., און אַנדערע. לעצטע ענדערונגען אין דער אָפטקייט, סיבות און מאָס פון טויטע חיות. פּראָק נאַטל אַקאַד סיי יו.עס.עי.. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al. קייפל ניט-ספּעציפיש פּאַטאַדזשאַנז קען האָבן געפֿירט מאַסע מאָרטאַליטי פון Pinna nobilis. לעבן. 2020;10:238.
ברעדלי מ, קאוטס סדזש, דזשענקינס ע, א'הארא טם. מעגלעכע ווירקונג פון קלימאט ענדערונג אויף ארקטישע זאאנאטישע קראנקהייטן. אינט. דזש. סירקומפאלאר העלט. 2005; 64:468–77.
בייער דזש., גרין נ"וו, ברוקס ס., אלאן איי דזש., רווס א., גאָמעז ט. און אנדערע. בלויע מוסלען (מיטילוס עדוליס ספּ.) אלס סיגנאל ארגאניזמען אין קאָוסטאַל פאַרפּעסטיקונג מאָניטאָרינג: א איבערבליק. מאַר ענוויראָן רעס 2017; 130:338-65.
סיראַוועגנאַ ג, מאַרסאָני ס, סיענאַ ס, באַרדעללי א. אינטעגראַציע פון ​​פליסיק ביאָפּסי אין ראַק באַהאַנדלונג. נאַט רעוו קלין אָנקאָל. 2017; 14:531–48.
וואַן דזש. סי. עם., מאַסי סי., גאַרסיאַ-קאָרבאַטשאָ דזש., מוליערע פ., ברענטאָן דזש. די., קאַלדאַס סי., און אַנדערע. פליסיקע ביאָפּסי מאַטוראַציע: ערלויבט טומאָר ד.נ.א. צו צירקולירן. נאַט רעוו קענסער. 2017;17:223–38.
מאַנדעל פּ., מעטאַיס ​​פּ. נוקלעיק זויערן אין מענטשלעכער פּלאַזמע. זיצונג פּראָטאָקאָלן פון סאָק ביאָל סאַבסידיעריז. 1948; 142:241-3.
בראָנקהאָרסט AJ, אונגערער W, האָלדענרידער S. א נייע ראָלע פֿאַר צעל-פֿרײַער דנ״א ווי אַ מאָלעקולאַרער מאַרקער פֿאַר ראַק באַהאַנדלונג. קוואַנטיפֿיקאַציע פֿון ביאָמאָלעקולאַרער אַנאַליז. 2019;17:100087.
איגנאטיאדיס מ., סלעדדזש ג.וו., דזשעפרי ס.ס. פליסיקע ביאָפּסי גייט אריין אין דער קליניק – אימפלעמענטאציע פראבלעמען און צוקונפטיגע שוועריקייטן. נאט רעוו קלינאן אנקאלא. 2021; 18:297–312.
לאָ י.מ., קאָרבעטאַ נ., טשעמבערליין פּ.פ., ראַי וו., סאַרדזשענט י.ל., רעדמאַן סי.וו. און אַנדערע. פעטאַלע ד.נ.א. איז פאַראַן אין מוטערלעכער פּלאַזמע און סערום. לאַנסעט. 1997; 350:485-7.
מופאַרריי MN, וואָנג RJ, שאָ GM, סטיווענסאָן DK, קווייק SR שטודיע פון ​​דעם פארלויף פון שוואַנגערשאַפט און זייַנע קאָמפּליקאַציעס ניצן סערקולירנדיקע עקסטראַסעלולאַרע רנאַ אין דעם בלוט פון פרויען בעת ​​שוואַנגערשאַפט. דאָפּעדיאַטריקס. 2020;8:605219.
אָלעריך מ, שערוואוד ק, קעאָן פּ, שוץ ע, בעק דזש, סטעגבאַוער דזש, עט אַל. פליסיק ביאָפּסי: דאָנאָר צעל-פֿרייַ דנאַ ווערט גענוצט צו דעטעקטירן אַלאָגענישע לעזשאַנז אין אַ ניר גראַפט. נאַט רעוו נעפראָל. 2021; 17:591–603.
דזשואַן עף סי, לאָ י עם ינאָוויישאַנז אין פּרענאַטאַל דיאַגנאָסטיק: מוטערלעך פּלאַזמע גענאָם סיקוואַנסינג. אננא מד. 2016;67:419-32.
גו וו, דענג קס, לי מ, סוקו י.ד., אַרעוואַלאָ ס, סטרייק ד, און אַנדערע. שנעלע פּאַטאָגען דעטעקציע מיט נעקסט-גענעראַציע מעטאַגענאָמישע סיקווענסינג פון ינפעקטירטע גוף פלוידס. נאַט מעדיצין. 2021;27:115-24.