א דאנק פארן באזוכן Nature.com. די בראַוזער ווערסיע וואָס איר ניצט האט באַגרענעצטע CSS שטיצע. פֿאַר די בעסטע דערפאַרונג, מיר רעקאָמענדירן אַז איר ניצט אַן דערהייַנטיקטן בראַוזער (אָדער דיאַקטיווירט קאָמפּאַטיביליטי מאָדע אין אינטערנעט עקספּלאָרער). אין דער דערווייל, צו ענשור ווייטערדיקע שטיצע, וועלן מיר רענדערן דעם וועבזייטל אָן סטילן און דזשאַוואַסקריפּט.
נייע אימונאָלאָגישע און מאַסע ספּעקטראָמעטרישע מעטאָדן פֿאַר קאָמפּלעקסע אַנאַליז פון פּערסיסטענטע אָליגאָסאַקאַרידן אין קאָרן סטאָווער פאַר-באַהאַנדלט מיט AFEX. ליגנאָסעלולאָסיק ביאָמאַסע איז אַ סאַסטיינאַבאַל אָלטערנאַטיוו צו פאַסאַל ברענוואַרג און איז וויידלי געניצט צו אַנטוויקלען ביאָטעכנאָלאָגיעס פֿאַר דער פּראָדוקציע פון ​​פּראָדוקטן אַזאַ ווי עסנוואַרג, פיטער, ברענוואַרג און כעמיקאַלן. דער שליסל צו די טעקנאַלאַדזשיז איז די אַנטוויקלונג פון קאָסטן-קאָנקורענט פּראָצעסן פֿאַר קאָנווערטינג קאָמפּלעקס קאַרבאָוכיידרייץ פאָרשטעלן אין פּלאַנט צעל ווענט אין פּשוט צוקער אַזאַ ווי גלוקאָזע, קסילאָז און אַראַבינאָסע. ווייַל ליגנאָסעלולאָסיק ביאָמאַסע איז זייער האַרטנעקיק, מוז עס זיין אונטערטעניק צו טערמאָכעמישע באַהאַנדלונגען (למשל, אַמאָוניאַ פיברע עקספאָליאַטיאָן (AFEX), דיילוטאַד זויערן (DA), יאָנישע פליסיקייטן (IL)) און ביאָלאָגישע באַהאַנדלונגען (למשל, ענזימאַטיש כיידראָליז און מיקראָביאַל פערמענטאַטיאָן) אין קאָמבינאַציע צו באַקומען דעם געוואונטשענעם פּראָדוקט. . אָבער, ווען קאמערציעלע פונגאַל ענזימען ווערן געניצט אין דעם כיידראָליז פּראָצעס, בלויז 75-85% פון די סאַליאַבאַל צוקערס געשאפן זענען מאָנאָסאַקאַרידן, און די רוען 15-25% זענען סאַליאַבאַל, ינטראַקטאַבאַל אָליגאָסאַקאַרידן, וואָס זענען נישט שטענדיק בנימצא פֿאַר מיקראָאָרגאַניזאַמז. פריער, האבן מיר מצליח געווען צו אפגעזונדערן און רייניקן סאליבלע שווערע אליגאסאכערידן ניצנדיק א קאמבינאציע פון ​​קוילן און דיאטאמאטישער ערד צעשיידונג און גרייס אויסשליסונג כראמאטאגראפיע, און אויך אויסגעפארשט זייערע ענזיים אינהיביטארישע אייגנשאפטן. מיר האבן געפונען אז אליגאסאכערידן מיט העכערע גראד פון פאלימעריזאציע (DP) מעטילירטע אוראנישע זויער סובסטיטוציעס זענען שווערער צו פראצעסירן מיט קאמערציעלע ענזיים בלענדז ווי נידעריק DP און נייטראלע אליגאסאכערידן. דא באריכטן מיר די נוצן פון עטלעכע נאָך מעטאָדן, אַרייַנגערעכנט גליקאַן פּראָופיילינג ניצנדיק מאָנאָקלאָנאַל אַנטיבאָדיעס (mAbs) ספּעציפיש צו פלאַנצן ביאָמאַסע גליקאַנס צו כאַראַקטעריזירן גליקאַן בינדונגען אין פלאַנצן צעל ווענט און ענזימאַטישע כיידראָליזאַטן, מאַטריץ-אַסיסטעד לאַזער דעזאָרפּציע ייאַניזאַציע, צייט-פון-פלי מאַסע-ספּעקטראָמעטריע. . MALDI-TOF-MS) ניצט סטרוקטור-אינפֿאָרמאַטיווע דיאַגנאָסטיק פּיקס באקומען דורך ספּעקטראָסקאָפּי נאָך צווייטיק דיקיי פון נעגאַטיוו יאָנען, גאַז כראמאטאגראפיע און מאַסע ספּעקטראָמעטריע (GC-MS) צו כאַראַקטעריזירן אליגאסאכעריד בינדונגען מיט און אָן דעריוואַטיזאַציע. רעכט צו דער קליינער גרייס פון אליגאסאכערידן (DP 4-20), זענען די מאַלעקולן שווער צו נוצן פֿאַר mAb ביינדינג און כאַראַקטעריזאַציע. כדי צו באַקומען דעם פּראָבלעם, האָבן מיר אָנגעווענדט אַ נייע ביאָטין קאָניוגאַציע-באַזירטע אָליגאָסאַקאַריד ימאָוביליזאַציע מעטאָדע וואָס האָט געראָטן צו לייבאַלירן די מערהייט פון נידעריק DP סאַליאַבאַל אָליגאָסאַקאַרידן אויף דער מיקראָפּלאַטע ייבערפלאַך, וואָס איז דערנאָך געניצט געוואָרן אין אַ הויך-דורכפיר mAb סיסטעם פֿאַר ספּעציפֿישע ליגאַציע אַנאַליז. די נייע מעטאָדע וועט פֿאַרלייכטערן די אַנטוויקלונג פון מער אַוואַנסירטע הויך-דורכפיר גלייקאָם אַסייז אין דער צוקונפֿט וואָס קענען געניצט ווערן צו איזאָלירן און כאַראַקטעריזירן אָליגאָסאַקאַרידן פאָרשטעלן אין ביאָמאַרקערס פֿאַר דיאַגנאָסטיק צוועקן.
ליגנאָסעלולאָסישע ביאָמאַסע, צוזאַמענגעשטעלט פון לאַנדווירטשאַפטלעכע, פאָרעסטרי, גראָז און האָלץ מאַטעריאַלן, איז אַ פּאָטענציעלער רוי מאַטעריאַל פֿאַר דער פּראָדוקציע פון ​​ביאָ-באַזירטע פּראָדוקטן, אַרייַנגערעכנט עסן, פיטער, ברענשטאָף און כעמישע פּריקורסאָרן צו פּראָדוצירן העכער ווערט פּראָדוקטן1. קאַרבאָוכיידרייטן (אַזאַ ווי צעלולאָזע און העמיסעללולאָזע) פאָרשטעלן אין פלאַנצן צעל ווענט ווערן דעפּאָלימעריזירט אין מאָנאָסאַקאַרידן דורך כעמישער פּראַסעסינג און ביאָטראַנספאָרמאַציע (אַזאַ ווי ענזימאַטישע הידראָליז און מיקראָביאַל פערמענטאַציע). געוויינטלעכע פאַר-באַהאַנדלונגען אַרייַננעמען אַמאָוניאַ פיברע יקספּאַנשאַן (AFEX), דיילוטאַד זויער (DA), יאָניק פליסיק (IL), און דאַמף עקספּלאָזיע (SE), וואָס נוצן אַ קאָמבינאַציע פון ​​כעמיקאַלן און היץ צו רעדוצירן ליגנאָסעלולאָז פּראָדוקציע דורך עפן פלאַנצן צעל ווענט3,4. האַרטנעקיקקייט פון מאַטעריע, 5. ענזימאַטישע הידראָליז ווערט דורכגעפירט ביי אַ הויך סאָלידס לאָוד ניצן קאמערציעלע אַקטיווע קאַרבאָוכיידרייט-האַלטיקע ענזימען (CAZymes) און מיקראָביאַל פערמענטאַציע ניצן טראַנסגעניק הייוון אָדער באַקטיריאַ צו פּראָדוצירן ביאָ-באַזירטע ברענשטאָפֿן און כעמיקאַלן6.
CAZymes אין קאמערציעלע ענזימען זענען צוזאמענגעשטעלט פון א קאמפלעקסער געמיש פון ענזימען וואס סינערגיסטיש צעשפּאַלטן קאמפלעקסע קאַרבאהידראַט-צוקער בינדונגען צו פארמירן מאָנאָסאַכאַרידן2,7. ווי מיר האבן פריער געמאלדן, מאכט די קאמפלעקסע נעץ פון אראמאטישע פאלימערן פון ליגנין מיט קאַרבאהידראַטן זיי העכסט שווער צו באהאנדלען, וואס פירט צו אומפארענדיקטע צוקער קאנווערזיע, אקומולירנדיק 15-25% פון געשלעכט אָליגאָסאַקאַרידן וואס ווערן נישט געשאפן בעת ​​ענזימאַטישע הידראָליז פון דער פארבאַהאַנדלטער ביאָמאַסע. דאס איז א געוויינלעכע פראבלעם מיט פארשידענע ביאָמאַסע פארבאַהאַנדלונג מעטאָדן. עטלעכע סיבות פאר דעם באָטאַנעקל זענען ענזיים אינהיביציע בעת הידראָליז, אדער די אַוועק אדער נידעריקע לעוועלס פון עסענציעלע עסענציעלע ענזימען וואס זענען פארלאנגט צו צעברעכן צוקער בינדונגען אין פלאנץ ביאָמאַסע. פארשטיין די צוזאמענשטעלונג און סטרוקטורעלע קעראַקטעריסטיקס פון צוקערס, ווי די צוקער בינדונגען אין אָליגאָסאַקאַרידן, וועט אונז העלפן פארבעסערן צוקער קאנווערזיע בעת הידראָליז, מאכנדיג ביאָטעכנאָלאָגישע פּראָצעסן קאָסטן-קאָנקורענץ-פיייקייט מיט פּעטראָלעום-דערייווד פּראָדוקטן.
באַשטימען די סטרוקטור פון קאַרבאָוכיידרייטן איז אַ שווערע אַרבעט און ריקווייערז אַ קאָמבינאַציע פון ​​מעטאָדן ווי פליסיק כראָמאַטאָגראַפֿיע (LC)11,12, נוקלעאַר מאַגנעטיש רעזאָנאַנס ספּעקטראָסקאָפּיע (NMR)13, קאַפּילאַר עלעקטראָפאָרעזיס (CE)14,15,16 און מאַסע ספּעקטראָמעטריע (MS)17. ,אַכצן. MS מעטאָדן ווי צייט-פון-פלי מאַסע ספּעקטראָמעטריע מיט לאַזער דעזאָרפּציע און ייאַניזאַציע ניצן אַ מאַטריץ (MALDI-TOF-MS) זענען אַ ווערסאַטאַל מעטאָד פֿאַר אידענטיפיצירן קאַרבאָוכיידרייט סטרוקטורן. לעצטנס, קאָליזשאַן-ינדוסט דיסאָסיאַטיאָן (CID) טאַנדעם MS פון סאָדיום יאָן אַדאַקטן איז געווען מערסט וויידלי געניצט צו ידענטיפיצירן פינגערפּרינץ קאָראַספּאַנדינג צו אָליגאָסאַקאַריד אַטאַטשמאַנט שטעלעס, אַנאָמעריק קאַנפיגיעריישאַנז, סיקוואַנסן און בראַנטשינג שטעלעס 20, 21.
גליקאן אנאליז איז אן אויסגעצייכנט געצייג פאר טיפע אידענטיפיקאציע פון ​​קארבאהידראט בונדן22. די מעטאד ניצט מאנאקלאנאלע אנטיקערפערס (mAbs) געריכטעט צו פלאנץ צעל וואנט גליקאן אלס פראבעס צו פארשטיין קאמפלעקסע קארבאהידראט פארבינדונגען. מער ווי 250 mAbs זענען פאראן איבער דער וועלט, דיזיינט קעגן פארשידענע לינעארע און צווייגליכע אליגאסאכארידן ניצנדיג פארשידענע סאקארידן24. פארשידענע mAbs זענען ברייט גענוצט געווארן צו כאראקטעריזירן די סטרוקטור, קאמפאזיציע, און מאדיפיקאציעס פון די פלאנץ צעל וואנט, ווייל עס זענען באדייטנדע אונטערשיידן דעפענדינג אויף פלאנץ צעל טיפ, ארגאן, עלטער, אנטוויקלונג סטאַגע, און וואוקס סביבה25,26. לעצטנס, איז די מעטאד גענוצט געווארן צו פארשטיין וועסיקל פאפולאציעס אין פלאנץ און כייַע סיסטעמען און זייערע ריספּעקטיווע ראלעס אין גליקאן טראנספארט ווי באשטימט דורך סובסעלולאר מארקערס, אנטוויקלונג סטאַגעס, אדער סביבה סטימולן, און צו באשטימען ענזימאטישע טעטיקייט. עטלעכע פון ​​די פֿאַרשידענע סטרוקטורן פֿון גליקאַנען און קסילאַנען וואָס זענען אידענטיפֿיצירט געוואָרן אַרייַננעמען פּעקטין (P), קסילאַן (X), מאַנאַן (M), קסילאָגלוקאַנען (XylG), געמישט-בונד גלוקאַנען (MLG), אַראַבינאָקסילאַן (ArbX), גאַלאַקטאָמאַנאַן (GalG), גלוקוראָניק זויער-אַראַבינאָקסילאַן (GArbX) און אַראַבינאָ-גאַלאַקטאַן (ArbG)29.
אבער, טראץ אלע די דאזיגע פארשונגס-אנשטרענגונגען, האבן נאר א פאר שטודיעס זיך קאנצענטרירט אויף דער נאטור פון אליגאסאכאריד אקומולאציע בעת הויך סאלידס לאוד (HSL) הידראליז, אריינגערעכנט אליגאסאכאריד באפרייאונג, אליגאמערישע קייט לענג ענדערונגען בעת ​​הידראליז, פארשידענע נידריגע DP פאלימערן, און זייערע קורוועס. פארשפרייטונגען 30,31,32. דערווייל, כאטש גליקאן אנאליז האט זיך ארויסגעוויזן צו זיין א נוצלעכער געצייג פאר א פולשטענדיגע אנאליז פון גליקאן סטרוקטור, איז שווער צו אפשאצן וואסער-סאליובליכע נידריגע DP אליגאסאכארידן ניצנדיג אנטיקערפער מעטאדן. קלענערע DP אליגאסאכארידן מיט א מאלעקולארע וואג פון ווייניגער ווי 5-10 kDa בינדן זיך נישט צו ELISA פלאטעס 33, 34 און ווערן אוועקגעוואשן פארן צולייגן אנטיקערפער.
דאָ, צום ערשטן מאָל, דעמאָנסטרירן מיר אַן ELISA אַסיי אויף אַווידין-באדעקטע פּלאַטעס ניצנדיק מאָנאָקלאָנאַל אַנטיקערפּערס, קאָמבינירנדיק אַן איין-שריט ביאָטינילאַציע פּראָצעדור פֿאַר סאַליאַבאַל רעפראַקטאָרי אָליגאָסאַקאַרידן מיט גלייקאָם אַנאַליז. אונדזער צוגאַנג צו גלייקאָם אַנאַליז איז וואַלידירט געוואָרן דורך MALDI-TOF-MS און GC-MS באַזירט אַנאַליז פון קאַמפּלעמענטאַרע אָליגאָסאַקאַריד פֿאַרבינדונגען ניצנדיק טרימעטהיליל (TMS) דעריוואַטיזאַציע פון ​​כיידראָליזירטע צוקער קאַמפּאַזישאַנז. די ינאָוואַטיווע צוגאַנג קען ווערן דעוועלאָפּעד ווי אַ הויך-דורכפֿלוס מעטאָד אין דער צוקונפֿט און געפֿינען ברייטערע אַפּליקאַציע אין ביאָמעדיצינישער פאָרשונג35.
פּאָסט-טראַנסלאַציאָנעלע מאָדיפיקאַציעס פון ענזימען און אַנטיקערפּערס, אַזאַ ווי גליקאָסילאַציע,36 ווירקן אויף זייער ביאָלאָגישע טעטיקייט. למשל, ענדערונגען אין גליקאָסילאַציע פון ​​סערום פּראָטעאינען שפּילן אַ וויכטיקע ראָלע אין אָנצינדונג אַרטריט, און ענדערונגען אין גליקאָסילאַציע ווערן גענוצט ווי דיאַגנאָסטישע מאַרקערס37. פֿאַרשידענע גליקאַנס זענען געמאָלדן געוואָרן אין דער ליטעראַטור צו דערשייַנען גרינג אין אַ פאַרשיידנקייט פון קראַנקייטן, אַרייַנגערעכנט כראָנישע אָנצינדונג קראַנקייטן פון די גאַסטראָוינטעסטאַנאַל טראַקט און לעבער, וויראַלע ינפעקשאַנז, אָווועריאַן, ברוסט און פּראָסטאַט ראַק38,39,40. פֿאַרשטיין די סטרוקטור פון גליקאַנס ניצן אַנטיקערפּער-באַזירט גליקאַן ELISA מעטהאָדס וועט צושטעלן נאָך בטחון אין קראַנקייט דיאַגנאָז אָן די נוצן פון קאָמפּלעקס MS מעטהאָדס.
אונדזער פריערדיקע שטודיע האט געוויזן אז שווערע אליגאסאכערידן זענען געבליבן נישט-הידראָליזירט נאך פאָרבאַהאַנדלונג און ענזימאַטישער הידראָליז (פיגור 1). אין אונדזער פריער פאַרעפֿנטלעכטער אַרבעט, האָבן מיר אַנטוויקלט אַן אַקטיווירטע האָלצקוילן האַרט-פאַסע עקסטראַקציע מעטאָד צו אפגעזונדערן אליגאסאכערידן פון AFEX-פאָרבאַהאַנדלטן קאָרן סטאָווער הידראָליזאַט (ACSH)8. נאָך דער ערשטער עקסטראַקציע און צעשיידונג, זענען די אליגאסאכערידן ווייטער פראַקציאָנירט געוואָרן דורך גרייס אויסשליסונג כראָמאַטאָגראַפֿיע (SEC) און געזאַמלט אין סדר פון מאָלעקולאַר וואָג. צוקער מאָנאָמערס און אליגאמערן באַפרייט פון פאַרשידענע פאָרבאַהאַנדלונגען זענען אַנאַליזירט געוואָרן דורך צוקער זאַץ אַנאַליז. ווען מען פאַרגלייכט דעם אינהאַלט פון צוקער אליגאמערן באַקומען דורך פאַרשידענע פאָרבאַהאַנדלונג מעטאָדן, איז די בייַזייַן פון שווערע אליגאסאכערידן אַ געוויינטלעך פּראָבלעם אין דער קאַנווערזשאַן פון ביאָמאַסע צו מאָנאָסאַקאַרידן און קען פירן צו אַ רעדוקציע אין צוקער טראָגן פון לפּחות 10-15% און אפילו אַרויף צו 18%. US. די מעטאָד ווערט גענוצט פֿאַר ווייטערדיקע גרויס-וואָג פּראָדוקציע פון ​​אליגאסאכעריד פראַקשאַנז. די ריזאַלטינג ACH און זייַן סאַבסאַקוואַנט פראַקשאַנז מיט פאַרשידענע מאָלעקולאַר וואָג זענען גענוצט געוואָרן ווי עקספּערימענטאַל מאַטעריאַל פֿאַר די כאַראַקטעריזאַציע פון ​​אליגאסאכערידן אין דעם אַרבעט.
נאך פאר-באַהאַנדלונג און ענזימאַטישער הידראָליז, זענען די אנהאלטנדיקע אָליגאָסאַקאַרידן געבליבן נישט-הידראָליזירט. דאָ (א) איז אַן אָליגאָסאַקאַריד צעשיידונג מעטאָדע אין וועלכער אָליגאָסאַקאַרידן ווערן אפגעזונדערט פון AFEX-פאר-באַהאַנדלטן קאָרן סטאָווער הידראָליזאַט (ACSH) ניצנדיק אַ פּאַקט בעט פון אַקטיוויזירטן קוילן און דיאַטאָמאַסעאַס ערד; (ב) מעטאָדע פֿאַר צעשיידונג פון אָליגאָסאַקאַרידן. די אָליגאָסאַקאַרידן זענען ווייטער אפגעזונדערט געוואָרן דורך גרייס אויסשליסונג כראָמאַטאָגראַפֿיע (SEC); (ג) סאַקאַריד מאָנאָמערן און אָליגאָמערן באַפרייט פון פֿאַרשידענע פאר-באַהאַנדלונגען (דילוטעד זויער: DA, יאָנישע פליסיקייט: IL און AFEX). ענזימאַטישע הידראָליז באַדינגונגען: הויך סאָלידס לאָודינג פון 25% (w/w) (בעערעך 8% גלוקאַן לאָודינג), 96 שעה הידראָליז, 20 מג/ג קאמערציעלע ענזיים לאָודינג (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 פאַרהעלטעניש) און (ד) צוקער מאָנאָמערן און אָליגאָמערן פון גלוקאָזע, קסילאָז און אַראַבינאָזע באַפרייט פון AFEX פאר-באַהאַנדלטן קאָרן סטאָווער (ACS).
גליקאן אנאליז האט זיך ארויסגעוויזן אלס א נוצלעכער געצייג פאר אן אויספירלעכער סטרוקטורעלער אנאליז פון גליקאנען אין עקסטראקטן אפגעזונדערט פון פעסטע ביאמאסע רעזידוען. אבער, וואסער-לעזלעכע סאקארידן זענען אונטעררעפּרעזענטירט מיט דעם טראדיציאנעלן מעטאד41 ווייל נידריג מאלעקולארע וואג אליגאסאקארידן זענען שווער צו אימאביליזירן אויף ELISA פלאטעס און ווערן אויסגעוואשן פארן צולייגן אנטיקערפער. דעריבער, פאר אנטיקערפער בינדונג און כאראקטעריזאציע, איז א איין-שריט ביאטינילאציע מעטאד גענוצט געווארן צו באדעקן לעזלעכע, נישט-קאמפליענט אליגאסאקארידן אויף אווידין-באדעקטע ELISA פלאטעס. די מעטאד איז געטעסט געווארן מיט אונזער פריער פראדוצירטער ACSH און א פראקציע באזירט אויף זיין מאלעקולארע וואג (אדער גראד פון פאלימעריזאציע, DP). איין-שריט ביאטינילאציע איז גענוצט געווארן צו פארגרעסערן אליגאסאקאריד בינדונג אפיניטי דורך צולייגן ביאטין-LC-הידראזיד צום רעדוצירנדיקן עק פונעם קארבאהידראט (פיגור 2). אין לייזונג, רעאגירט די העמיאצעטאל גרופע ביים רעדוצירנדיקן עק מיט דער הידראזיד גרופע פון ​​ביאטין-LC-הידראזיד צו פארמירן א הידראזאן בונד. אין דער אנוועזנהייט פונעם רעדוצירנדיקן אגענט NaCNBH3, ווערט די הידראזאן בונד רעדוצירט צו א סטאבילן ביאטינילירטן ענד פראדוקט. מיט דער מאָדיפיקאַציע פון ​​דעם צוקער-רעדוצירנדיקן עק, איז די בינדונג פון נידעריק DP אָליגאָסאַקאַרידן צו ELISA פּלאַטעס געוואָרן מעגלעך, און אין אונדזער שטודיע איז דאָס געטאָן געוואָרן אויף אַווידין-באדעקטע פּלאַטעס ניצנדיק גליקאַן-געצילטע mAbs.
סקרינינג פון מאָנאָקלאָנאַל אַנטיקערפּערס באַזירט אויף ELISA פֿאַר ביאָטינילאַטעד אָליגאָסאַקאַרידן. דאָ (A) קאַמביינד ביאָטינילאַטיאָן פון אָליגאָסאַקאַרידן און סאַבסאַקוואַנט ELISA סקרינינג מיט גליקאַן-טאַרגעטעד mAbs אויף NeutrAvidin קאָוטאַד פּלאַטעס און (B) ווייזט אַ איין-שריט פּראָצעדור פֿאַר ביאָטינילאַטיאָן פון רעאַקציע פּראָדוקטן.
אַווידין-באדעקטע פּלאַטעס מיט אָליגאָסאַקאַריד-קאָניוגירטע אַנטיקערפּערס זענען דעמאָלט צוגעגעבן געוואָרן צו די ערשטיקע און צווייטיקע אַנטיקערפּערס און געוואַשן אין אַ ליכט- און צייט-סענסיטיוו מעדיום. נאָכדעם ווי די אַנטיקערפּער בינדונג איז פֿאַרענדיקט, לייגט צו TMB סאַבסטראַט צו אינקובירן די פּלאַטע. די רעאַקציע איז לעסאָף אָפּגעשטעלט געוואָרן מיט שוועבל זויער. די אינקובירטע פּלאַטעס זענען אַנאַליזירט געוואָרן מיט אַן ELISA לייענער צו באַשטימען די בינדונג שטאַרקייט פֿון יעדן אַנטיקערפּער צו דעטעקטירן אַנטיקערפּער-ספּעציפֿישע קראָס-לינקינג. פֿאַר פרטים און פּאַראַמעטערס פֿון דעם עקספּערימענט, זעט די קאָרעספּאָנדירנדיקע סעקציע "מאַטעריאַלן און מעטאָדן".
מיר ווײַזן די נוצלעכקייט פֿון דעם נײַ־אַנטוויקלטן מעטאָד פֿאַר ספּעציפֿישע אַפּליקאַציעס דורך כאַראַקטעריזירן די סאַליאַבאַל אָליגאָסאַקאַרידן וואָס געפֿינען זיך אין ACSH, ווי אויך אין רויע און פּיוראַפייד אָליגאָסאַקאַריד פֿראַקציעס וואָס זענען אפגעזונדערט פֿון ליגנאָסעלולאָסישע הידראָליזאַטן. ווי געוויזן אין פֿיגור 3, די מערסט פֿאַרשפּרייטע עפּיטאָפּ־סאַבסטאַטוטעד קסילאַנען וואָס זענען אידענטיפֿיצירט געוואָרן אין ACSH מיט ביאָאַסילאַטעד גלייקאָם אַסיי מעטאָדן זענען געוויינטלעך אוראָניק (U) אָדער מעטילוראָניק (MeU) און פּעקטיק אַראַבינאָגאַלאַקטאַנען. רובֿ פֿון זיי זענען אויך געפֿונען געוואָרן אין אונדזער פֿריִערדיקער שטודיע וועגן דער אַנאַליז פֿון גליקאַנען פֿון נישט־הידראָליזירטע סאָלידס (UHS)43.
דעטעקציע פון ​​ווידערשטאנדיקע אָליגאָסאַקאַריד עפּיטאָפּס ניצנדיק אַ מאָנאָקלאָנאַל אַנטיבאָדי געריכטעט צו דער צעל וואַנט גליקאַן. די "נייטראַל" פראַקציע איז די ACN פראַקציע און די "זויער" פראַקציע איז די FA פראַקציע. העלערע רויטע אויף דער היץ-מאַפּ ווייַזן העכער עפּיטאָפּ אינהאַלט, און העלערע בלויע ווייַזן אַ ליידיק הינטערגרונט. קאָליר ווערטן אויף דער וואָג זענען באַזירט אויף רויע OD ווערטן פֿאַר פאָרמולאַציעס N=2. די הויפּט עפּיטאָפּס דערקענט דורך די אַנטיבאָדיעס זענען געוויזן אויף דער רעכטער זייט.
די נישט-צעלולאָזע סטרוקטורן האָבן נישט געקענט צעשפּאַלט ווערן דורך די מערסט געוויינטלעכע צעלולאַסעס און העמיסעללולאַסעס אין דער געטעסטער קאמערציעלער ענזיים געמיש, וואָס נעמט אַרײַן די מערסט אָפֿט גענוצטע קאמערציעלע ענזימען. דעריבער, זענען נויטיק נײַע הילפס-ענזימען פֿאַר זייער הידראָליז. אָן די נויטיקע נישט-צעלולאָזע צוגעהערנדיקע ענזימען, פֿאַרהיטן די נישט-צעלולאָזע פֿאַרבינדונגען אַ פֿולשטענדיקע קאָנווערסיע צו מאָנאָסאַכאַרידן, אפילו אויב זייערע עלטערן-צוקער פּאָלימערן ווערן ברייט הידראָליזירט אין קירצערע פֿראַגמענטן און אויפֿגעלייזט מיט קאמערציעלע ענזיים געמישן.
ווייטערדיגע שטודיע פון ​​סיגנאַל פאַרשפּרייטונג און זיין בינדונג שטאַרקייט האט געוויזן אַז בינדונג עפּיטאָפּס זענען געווען נידעריקער אין הויך DP צוקער פראַקשאַנז (A, B, C, DP ביז 20+) ווי אין נידעריק DP פראַקשאַנז (D, E, F, DP) אין דימערס) (פיגור 1). זויער פראַגמענטן זענען מער געוויינטלעך אין ניט-צעליאַלאָוס עפּיטאָפּס ווי נייטראַלע פראַגמענטן. די דערשיינונגען זענען קאָנסיסטענט מיט דעם מוסטער באמערקט אין אונדזער פריערדיקער שטודיע, וווּ הויך DP און זויער מאָיעטיס זענען געווען מער קעגנשטעליק צו ענזימאַטיש כיידראָליזיס. דעריבער, די בייַזייַן פון ניט-צעליאַלאָוס גליקאַן עפּיטאָפּס און U און MeU סאַבסטיטוציעס קענען שטארק בייַשטייַערן צו די פעסטקייַט פון די אָליגאָסאַקאַרידעס. עס זאָל זיין באמערקט אַז בינדונג און דעטעקציע עפעקטיווקייַט קענען זיין פּראָבלעמאַטיק פֿאַר נידעריק DP אָליגאָסאַקאַרידעס, ספּעציעל אויב די עפּיטאָפּ איז אַ דימעריק אָדער טרימעריק אָליגאָסאַקאַריד. דאָס קען זיין טעסטעד ניצן קאמערציעלע אָליגאָסאַקאַרידעס פון פאַרשידענע לענגקטס, יעדער מיט בלויז איין עפּיטאָפּ וואָס בינדט צו אַ ספּעציפיש mAb.
אזוי, די נוצן פון סטרוקטור-ספעציפישע אנטיקערפערס האט אויפגעדעקט געוויסע טיפן ווידערשטאנדיקע בונדן. דעפּענדינג אויף דעם טיפ אנטיקערפער גענוצט, דעם צוגעפאסטן ליגאציע מוסטער, און די שטארקייט פון דעם סיגנאל וואס עס פראדוצירט (מערסט און ווייניגסט פארשפרייט), קענען נייע ענזימען ווערן אידענטיפיצירט און צוגעגעבן האלב-קוואַנטיטאַטיוו צו דער ענזיים געמיש פאר מער פולשטענדיגע גליקאקאנווערזיע. נעמענדיג די אנאליז פון ACSH אליגאסאכארידן אלס א ביישפיל, קענען מיר שאפן א דאטאבאזע פון ​​גליקאן בונדן פאר יעדן ביאמאסע מאטעריאל. עס זאל דא באמערקט ווערן אז די פארשידענע אפיניטי פון אנטיקערפערס זאל גענומען ווערן אין באטראכט, און אויב זייער אפיניטי איז אומבאקאנט, וועט דאס שאפן געוויסע שוועריקייטן ווען מען פארגלייכט די סיגנאלן פון פארשידענע אנטיקערפערס. אין דערצו, קען פארגלייך פון גליקאן בונדן ארבעטן בעסטן צווישן מוסטערן פאר דעם זעלבן אנטיקערפער. די שווערע בונדן קענען דאן פארבונדן ווערן מיט דער CAZyme דאטאבאזע, פון וועלכער מיר קענען אידענטיפיצירן ענזימען, אויסקלויבן קאנדידאט ענזימען און טעסטן פאר בונד-ברעכנדיקע ענזימען, אדער אנטוויקלען מיקראביאלע סיסטעמען צו אויסדריקן די ענזימען פאר נוצן אין ביאראפיינעריעס44.
כדי צו אפשאצן ווי אימונאָלאָגישע מעטאָדן קאָמפּלעמענטירן אַלטערנאַטיווע מעטאָדן פֿאַר כאַראַקטעריזירן נידעריק מאָלעקולאַר וואָג אָליגאָסאַקאַרידן פאָרשטעלן אין ליגנאָסעלולאָסיק הידראָליזאַטעס, האָבן מיר דורכגעפירט MALDI (פיגור 4, S1-S8) און אַנאַליז פון TMS-דערייווד אָליגאָסאַקאַרידן באַזירט אויף GC-MS אויף דער זעלביקער טאַפליע (פיגור 5) אָליגאָסאַקאַריד טייל. MALDI ווערט גענוצט צו פאַרגלייַכן צי די מאַסע פאַרשפּרייטונג פון אָליגאָסאַקאַריד מאָלעקולן שטימט מיט דער בדעה סטרוקטור. אויף פיגור 4 ווייזט MS פון די נייטראַלע קאָמפּאָנענטן ACN-A און ACN-B. ACN-A אַנאַליז האָט באַשטעטיקט אַ קייט פון פּענטאָזע צוקערס ריינדזשינג פון DP 4-8 (פיגור 4) צו DP 22 (פיגור S1), וועמענס וואָג קאָרעספּאָנדירן צו MeU-קסילאַן אָליגאָסאַקאַרידן. ACN-B אַנאַליז האָט באַשטעטיקט די פּענטאָזע און גלוקאָקסילאַן סעריע מיט DP 8-15. אין צוגאב מאַטעריאַל ווי פיגור S3, ווייַזן FA-C זויער מאָיעטי מאַסע פאַרשפּרייטונג מאַפּס אַ קייט פון (Me)U סאַבסטיטוטאַד פּענטאָזע צוקערס מיט אַ DP פון 8-15 וואָס זענען קאָנסיסטענט מיט די סאַבסטיטוטאַד קסילאַנען געפֿונען אין ELISA-באזירט mAb סקרינינג. די עפּיטאָפּס זענען קאָנסיסטענט.
MALDI-MS ספּעקטרום פון סאַליאַבאַל ניט-קאָמפּליאַנט אָליגאָסאַקאַרידן פאָרשטעלן אין ACS. דאָ, (A) ACN-A נידעריק וואָג קייט פראַקשאַנז מיט מעטילאַטעד וראָניק זויער (DP 4-8) סאַבסטיטוטאַד גלוקוראָקסילאַן אָליגאָסאַקאַרידן און (B) ACN-B קסילאַן און מעטילאַטעד וראָניק זויער אָליגאָסאַקאַרידן סאַבסטיטוטאַד מיט גלוקוראָקסילאַן (DP 8-15).
אנאליז פון דער צוזאמענשטעלונג פון די גליקאן רעזידו פון רעפראַקטאָרי אָליגאָסאַקאַרידן. דאָ (א) TMS לאַקאַריד צוזאמענשטעלונג פון פארשידענע אָליגאָסאַקאַריד פראַקציעס באקומען ניצן GC-MS אנאליז. (ב) סטרוקטורן פון פארשידענע TMS-דעריוואַטעד צוקערס פאָרשטעלן אין אָליגאָסאַקאַרידן. ACN – אַצעטאָניטריל פראַקציע וואָס כּולל נייטראַלע אָליגאָסאַקאַרידן און FA – פערוליק זויער פראַקציע וואָס כּולל זויער אָליגאָסאַקאַרידן.
נאך אן אינטערעסאנטע מסקנא איז געצויגן געווארן פון דער LC-MS אנאליז פון דער אליגאסאכאריד פראקציע, ווי געוויזן אין פיגור S9 (מעטאדן קען מען זען אין דעם עלעקטראנישן צוגאב מאטעריאל). פראגמענטן פון העקסאזע און -OAc גרופעס זענען איבערגעחזרט באמערקט געווארן בעת ​​ליגאציע פון ​​דער ACN-B פראקציע. די געפינס באשטעטיגט נישט נאר די פראגמענטאציע באמערקט אין גלייקאם און MALDI-TOF אנאליז, נאר גיט אויך נייע אינפארמאציע וועגן מעגליכע קארבאהידראט דעריוואטיוון אין פארבאהאנדלטער ליגנאצעלולאזישער ביאמאסע.
מיר האָבן אויך דורכגעפירט גליקאַן קאָמפּאָזיציע אַנאַליז פון אָליגאָסאַקאַריד פראַקציעס ניצנדיק TMS גליקאַן דעריוואַטיזאַציע. ניצנדיק GC-MS, האָבן מיר באַשטימט די קאָמפּאָזיציע פון ​​נעוראַלע (נישט-דעריוואַטיווע) און זויערע צוקערס (GluA און GalA) אין דער אָליגאָסאַקאַריד פראַקציע (פיגור 5). גלוקוראָניק זויער געפינט זיך אין זויערע קאָמפּאָנענטן C און D, בשעת גאַלאַקטוראָניק זויער געפינט זיך אין זויערע קאָמפּאָנענטן A און B, ביידע פון ​​וועלכע זענען הויך DP קאָמפּאָנענטן פון זויערע צוקערס. די רעזולטאַטן באַשטעטיקן נישט בלויז אונדזער ELISA און MALDI דאַטן, אָבער זענען אויך קאָנסיסטענט מיט אונדזער פריערדיקע שטודיעס פון אָליגאָסאַקאַריד אַקיומיאַליישאַן. דעריבער, גלויבן מיר אַז מאָדערנע ימיונאָלאָגישע מעטאָדן ניצנדיק ביאָטינילאַציע פון ​​אָליגאָסאַקאַרידן און דערנאָך ELISA סקרינינג זענען גענוג צו דעטעקטירן סאַליאַבאַל ווידערשטאַנדיק אָליגאָסאַקאַרידן אין פאַרשידענע ביאָלאָגישע מוסטערן.
זינט ELISA-באזירטע mAb סקרינינג מעטאָדן זענען וואַלידירט געוואָרן דורך עטלעכע פֿאַרשידענע מעטאָדן, האָבן מיר געוואָלט ווייטער אויספֿאָרשן דעם פּאָטענציאַל פֿון דעם נײַעם קוואַנטיטאַטיוון מעטאָד. צוויי קאָמערציעלע אָליגאָסאַקאַרידן, קסילאָהעקסאַסאַקאַריד אָליגאָסאַקאַריד (XHE) און 23-α-L-אַראַבינאָפֿוראַנאָסיל-קסילאָטריאָז (A2XX), זענען געקויפֿט און געטעסט געוואָרן מיט אַ נײַעם mAb צוגאַנג וואָס צילט דעם צעל-וואַנט גליקאַן. פֿיגור 6 ווײַזט אַ לינעאַרע קאָרעלאַציע צווישן דעם ביאָטינילירטן בינדונג סיגנאַל און די לאָג קאָנצענטראַציע פֿון אָליגאָסאַקאַריד קאָנצענטראַציע, וואָס סאַגדזשעסטירט אַ מעגלעכן לאַנגמויר אַדסאָרפּציע מאָדעל. צווישן די mAbs, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, און CCRC-M151 קאָרעלירט מיט XHE, און CCRC-M108, CCRC-M109, און LM11 קאָרעלירט מיט A2XX איבער אַ קייט פֿון 1 נאַנאָמעטער ביז 100 נאַנאָ. צוליב דער באַגרענעצטער פֿאַרפֿיגבאַרקייט פֿון אַנטיקערפּערס בעת דעם עקספּערימענט, זענען באַגרענעצטע עקספּערימענטן דורכגעפֿירט געוואָרן מיט יעדער אָליגאָסאַקאַריד קאָנצענטראַציע. עס איז וויכטיג צו באַמערקן דאָ אַז עטלעכע אַנטיקערפּערס רעאַגירן זייער אַנדערש צו דער זעלביקער אָליגאָסאַקאַריד ווי אַ סאַבסטראַט, מסתּמא ווייַל זיי בינדן זיך צו אַ ביסל אַנדערע עפּיטאָפּס און קענען האָבן זייער אַנדערע בינדונג אַפיניטיעס. די מעханіזמען און ימפּליקאַציעס פון פּינקטלעכער עפּיטאָפּ אידענטיפֿיקאַציע וועלן זיין פיל מער קאָמפּליצירט ווען דער נייער mAb צוגאַנג וועט ווערן געווענדט צו פאַקטישע מוסטערן.
צוויי קאמערציעלע אָליגאָסאַקאַרידן זענען גענוצט געוואָרן צו באַשטימען דעם דעטעקציע־ראַנג פֿון פֿאַרשידענע גליקאַן־טאַרגעטינג מאַבס. דאָ, לינעאַרע קאָרעלאַציעס מיט לאָג קאָנצענטראַציע פֿון אָליגאָסאַקאַריד קאָנצענטראַציע ווײַזן אויף לאַנגמויר אַדסאָרפּציע מוסטערן פֿאַר (A) XHE מיט מאַב און (B) A2XX מיט מאַב. די קאָרעספּאָנדירנדיקע עפּיטאָפּן ווײַזן אויף די סטרוקטורן פֿון די קאמערציעלע אָליגאָסאַקאַרידן גענוצט ווי סאַבסטראַטן אין דעם אַסיי.
די נוצן פון גליקאן-געצילטע מאָנאָקלאָנאַלע אַנטיקערפּערס (גליקאָקאָמישע אַנאַליז אָדער ELISA-באַזירטע mAb סקרינינג) איז אַ שטאַרק געצייַג פֿאַר טיפע כאַראַקטעריזאַציע פון ​​רובֿ פון די הויפּט צעל וואַנט גליקאַנען וואָס מאַכן אויס פלאַנצן ביאָמאַסע. אָבער, קלאַסישע גליקאן אַנאַליז כאַראַקטעריזירט בלויז גרעסערע צעל וואַנט גליקאַנען, ווייַל רובֿ אָליגאָסאַקאַרידן זענען נישט עפֿעקטיוו ימאָובאַלייזד אויף ELISA פּלאַטעס. אין דעם לערנען, AFEX-פּרעבאַהאַנדלטע קאָרן סטאָווער איז ענזימאַטיש כיידראָליזירט געוואָרן ביי אַ הויך סאָלידס אינהאַלט. צוקער אַנאַליז איז געניצט געוואָרן צו באַשטימען די זאַץ פון ווידערשפּעניקע צעל וואַנט קאַרבאָוכיידרייץ אין די כיידראָליזאַטע. אָבער, mAb אַנאַליז פון קלענערע אָליגאָסאַקאַרידן אין כיידראָליזאַטן איז אַנדערעשאַצט, און נאָך מכשירים זענען דארף צו עפֿעקטיוו ימאָובאַלייזירן אָליגאָסאַקאַרידן אויף ELISA פּלאַטעס.
מיר באריכטן דא א נייע און עפעקטיווע אָליגאָסאַקאַריד ימאָוביליזאַציע מעטאָדע פֿאַר mAb סקרינינג דורך קאַמביינינג אָליגאָסאַקאַריד ביאָטיניליישאַן נאכגעגאנגען דורך ELISA סקרינינג אויף NeurAvidin™ קאָוטאַד פּלאַטעס. די ימאָובאַלייזד ביאָטינילייטיד אָליגאָסאַקאַרידעס האָבן געוויזן גענוג אַפיניטי פֿאַר די אַנטיבאָדי צו געבן מעגלעכקייט שנעל און עפעקטיוו דעטעקציע פון ​​ווידערשפּעניק אָליגאָסאַקאַרידעס. אַנאַליז פון דער זאַץ פון די שווערע אָליגאָסאַקאַרידעס באזירט אויף מאַסע ספּעקטראָמעטריע האט באשטעטיקט די רעזולטאַטן פון דעם נייעם צוגאַנג צו ימיונאָסקרינינג. אזוי, די שטודיעס ווייַזן אַז די קאָמבינאַציע פון ​​אָליגאָסאַקאַריד ביאָטיניליישאַן און ELISA סקרינינג מיט גליקאַן-טאַרגעטעד מאָנאָקלאָנאַל אַנטיבאָדיעס קענען ווערן גענוצט צו דעטעקט קראָסלינקס אין אָליגאָסאַקאַרידעס און קענען ווערן וויידלי געווענדט אין אנדערע בייאָוקעמיקאַל שטודיעס כאַראַקטערייזינג די סטרוקטור פון אָליגאָסאַקאַרידעס.
די ביאָטין-באַזירטע גליקאַן פּראָפֿיל מעטאָדע איז דער ערשטער באַריכט וואָס איז פֿעיִק צו אויספֿאָרשן די ווידערשפּעניקע קאַרבאָוכיידרייט בונדן פֿון סאַליאַבאַל אָליגאָסאַקאַרידן אין פלאַנצן ביאָמאַסע. דאָס העלפֿט פֿאַרשטיין פֿאַרוואָס עטלעכע טיילן פֿון ביאָמאַסע זענען אַזוי האַרטנעקיק ווען עס קומט צו ביופֿיועל פּראָדוקציע. די מעטאָדע פֿילט אויס אַ וויכטיקע לײַכטע אין גלייקאָם אַנאַליז מעטאָדן און פֿאַרברייטערט איר אַפּליקאַציע צו אַ ברייטערע קייט פֿון סאַבסטראַטן ווײַטער פֿון פלאַנצן אָליגאָסאַקאַרידן. אין דער צוקונפֿט, קענען מיר נוצן ראָבאָטיק פֿאַר ביאָטינילאַציע און נוצן די מעטאָדע וואָס מיר האָבן אַנטוויקלט פֿאַר הויך-דורכפֿלוס אַנאַליז פֿון מוסטערן מיט ELISA.
קארן שטרוי (CS) וואס איז געוואקסן פון פיאָניר 33A14 כייבריד זוימען איז געזאמלט געווארן אין 2010 פון קראַמער פארמס אין ריי, קאלאראדא. מיט דער דערלויבעניש פון דעם לאַנד אייגנטימער, קען די ביאָמאַסע גענוצט ווערן פאר פאָרשונג. די מוסטערן זענען געהאלטן געוואָרן טרוקן < 6% פֿײַכטקייט אין זיפּ-לאָק זעקלעך אין צימער טעמפּעראַטור. די מוסטערן זענען געהאלטן געוואָרן טרוקן < 6% פֿײַכטקייט אין זיפּ-לאָק זעקלעך אין צימער טעמפּעראַטור. ינוועסטאַגייטינג קאַנסאַנטריישאַנז פֿאַר קאַנסאַנטריישאַן < 6% אין קאַנסאַנטריישאַנז מיט די קאַנסאַנטרייטאַד קאָמפּיוטער. מוסטערן זענען געהאלטן געוואָרן טרוקן ביי <6% הומידיטי אין פֿאַרמאַכטע זעקלעך ביי צימער טעמפּעראַטור.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% די רעקאַמאַנדיישאַנז פון די קאַנסאַנטריישאַן מיט די קאַנסאַנטריישאַן פון די קאַנסאַנטריישאַן מיט < 6%. מוסטערן ווערן געהאלטן אין זיפּער זעקלעך ביי צימער טעמפּעראַטור מיט אַ הומידיטי < 6%.די שטודיע האט איינגעהאלטן לאקאלע און נאציאנאלע גיידליינז. קאמפאזיציע אנאליז איז דורכגעפירט געווארן מיטן NREL פראטאקאל. די קאמפאזיציע איז געפונען געווארן צו אנטהאלטן 31.4% גלוקאן, 18.7% קסילאן, 3.3% אראבינאַן, 1.2% גאַלאַקטאַן, 2.2% אַצעטיל, 14.3% ליגנין, 1.7% פּראָטעין און 13.4% אש.
Cellic® CTec2 (138 מג פּראָטעין/מל, לאָט VCNI 0001) איז אַ קאָמפּלעקסע געמיש פון צעלולאַזע, β-גלוקאָסידאַזע ​​און Cellic® HTec2 (157 מג פּראָטעין/מל, לאָט VHN00001) פון Novozymes (פראַנקלינטאָן, NC, USA)). מולטיפעקט פּעקטינאַזע® (72 מג פּראָטעין/מל), אַ קאָמפּלעקסע געמיש פון פּעקטין-דעגראַדירנדיקע ענזימען, איז געווען דאָונירט דורך DuPont Industrial Biosciences (פּאַלאָ אַלטאָ, CA, USA). ענזיים פּראָטעין קאָנצענטראַציעס זענען באַשטימט געוואָרן דורך אָפּשאַצן פּראָטעין אינהאַלט (און אַראָפּרעכענען דעם בייַשטייַער פון ניט-פּראָטעין שטיקשטאָף) ניצנדיק Kjeldah שטיקשטאָף אַנאַליז (AOAC מעטאָד 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA). דיאַטאָמאַסעאָוס ערד 545 איז געקויפט געוואָרן פון EMD Millipore (בילעריקאַ, MA). אַקטיווירטע קוילן (דאַרקאָ, 100 מעש גראַניולס), אַוויסעל (PH-101), בוק קסילאַן, און אַלע אַנדערע כעמיקאַלן זענען געקויפט געוואָרן פֿון סיגמאַ-אַלדריטש (סעינט לואיס, מאָ).
AFEX פאָרבאַהאַנדלונג איז דורכגעפירט געוואָרן ביי GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, USA). די פאָרבאַהאַנדלונג איז דורכגעפירט געוואָרן ביי 140°C פֿאַר 15 מינוט. 46 רעזידענץ צייט ביי אַ 1:1 פאַרהעלטעניש פון אַנהידראָוס אַמאָוניאַ צו ביאָמאַסע ביי 60% (w/w) לאָודינג אין אַ ומבאַפלעקט שטאָל בענטשטאָפּ באַטש רעאַקטאָר (Parr Instruments Company). עס האָט גענומען 30 מינוט. דער רעאַקטאָר איז געבראַכט געוואָרן צו 140°C און די אַמאָוניאַ איז שנעל באַפרייט געוואָרן, דערלויבנדיק די ביאָמאַסע צו שנעל צוריקקומען צו צימער טעמפּעראַטור. די קאָמפּאָזיציע פון ​​AFEX פאָרבאַהאַנדלטן קאָרן סטאָווער (ACS) איז געווען ענלעך צו דער פון נישט-באַהאַנדלטן קאָרן סטאָווער (UT-CS).
הויך סאָלידס ACSH 25% (w/w) (אומגעפער 8% דעקסטראַן לאָודינג) איז צוגעגרייט געוואָרן ווי אַן אויסגאַנג מאַטעריאַל פֿאַר גרויס-מאָסשטאַביגע פּראָדוקציע פון ​​אָליגאָסאַקאַרידן. ענזימאַטישע הידראָליז פון ACS איז דורכגעפירט געוואָרן מיט אַ קאמערציעלע ענזיים געמיש אַרייַנגערעכנט Cellic® Ctec2 10 מג פּראָטעין/ג גלוקאַן (אין פאַר-באַהאַנדלטער ביאָמאַסע), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 מג פּראָטעין/ג גלוקאַן, און Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA). ), 5 מג פּראָטעין/ג דעקסטראַן. ענזימאַטישע הידראָליז איז דורכגעפירט געוואָרן אין אַ 5-ליטער ביאָרעאַקטאָר מיט אַן אַרבעטס וואָלומען פון 3 ליטער, pH 4.8, 50°C און 250 רפּם. נאָך הידראָליז פֿאַר 96 שעה, איז די הידראָליזאַט געזאַמלט געוואָרן דורך צענטריפוגאַציע ביי 6000 רפּם פֿאַר 30 מינוט און דערנאָך ביי 14000 רפּם פֿאַר 30 מינוט צו באַזייַטיקן נישט-הידראָליזירטע סאָלידס. דער הידראָליזאַט איז דעמאָלט אונטערגעוואָרפן געוואָרן צו אַ סטעריל פילטראַציע דורך אַ 0.22 מ״מ פילטער בעכער. דער פילטרירטער הידראָליזאַט איז געהאַלטן געוואָרן אין סטעריל פלעשער ביי 4°C און דערנאָך פראַקציאָנירט אויף קוילן.
אנאליז פון דער קאמפאזיציע פון ​​עקסטראַקט-באזירטע ביאָמאַסע מוסטערן לויט NREL לאַבאָראַטאָריע אנאליז פּראָצעדורן: צוגרייטונג פון מוסטערן פֿאַר קאמפאזיציע אנאליז (NREL/TP-510-42620) און באַשטימונג פון סטרוקטורעלע קאַרבאָוכיידרייץ און ליגנין אין ביאָמאַסע (NREL/TP-510 – 42618)47.
אָליגאָסאַקאַריד אַנאַליז פון די הידראָליזאַט שטראָם איז דורכגעפירט געוואָרן אויף אַ 2 מל וואָג מיט אַן אויטאָקלאַוו-באַזירט זויער הידראָליז מעטאָד. מישט די הידראָליזאַט מוסטער מיט 69.7 µl פון 72% שוועבל זויער אין אַ 10 מל שרויף דעקל קולטור רער און אינקובירט פֿאַר 1 שעה אויף אַ בענטשטאָפּ ביי 121 °C, קילט אויף אייז און פילטערט אין אַ הויך פּערפאָרמאַנס פליסיק כראָמאַטאָגראַפֿיע (HPLC) וויאַל. די קאָנצענטראַציע פון ​​אָליגאָסאַקאַרידן איז באַשטימט געוואָרן דורך סובטראַקטירן די קאָנצענטראַציע פון ​​מאָנאָסאַקאַרידן אין די ניט-הידראָליזירטע מוסטער פון די גאַנץ צוקער קאָנצענטראַציע אין די זויער-הידראָליזירטע מוסטער.
גלוקאָזע, קסילאָז, און אַראַבינאָזע קאָנצענטראַציעס אין דער זויער כיידראָליזירטער ביאָמאַסע זענען אַנאַליזירט געוואָרן מיט אַ שימאַדזו HPLC סיסטעם אויסגעשטאַט מיט אַן אויטאָ-סאַמפּלער, קאָלום כיטער, איזאָקראַטישער פּאָמפּע, און רעפראַקטיווער אינדעקס דעטעקטאָר אויף אַ ביאָ-ראַד אַמינעקס HPX-87H קאָלום. די קאָלום איז געהאַלטן געוואָרן ביי 50°C און עלוטירט מיט 0.6 מל/מינוט 5 mM H2SO4 אין וואַסער.
דער הידראָליזאַט סופּערנאַטאַנט איז געוואָרן פארדיןנט און אַנאַליזירט אויף מאָנאָמער און אָליגאָסאַקאַריד אינהאַלט. מאָנאָמערישע צוקערס באַקומען נאָך ענזימאַטיש הידראָליז זענען אַנאַליזירט געוואָרן דורך HPLC אויסגעשטאַט מיט אַ ביאָ-ראַד (הערקולעס, קאַליפאָרניע) אַמינעקס HPX-87P קאָלום און אַן אַש גאַרד קאָלום. די קאָלום טעמפּעראַטור איז געהאַלטן געוואָרן ביי 80°C, וואַסער איז געניצט געוואָרן ווי די מאָבילע פאַזע מיט אַ לויפן קורס פון 0.6 מל/מינוט. אָליגאָסאַקאַרידן זענען באַשטימט געוואָרן דורך הידראָליז אין פארדיןנט זויער ביי 121°C לויט די מעטאָדן באַשריבן אין רעפֿערענצן 41, 48, 49.
סאַכאַריד אַנאַליז איז דורכגעפירט געוואָרן אויף רויע, AFEX פאַר-באַהאַנדלטע און אַלע נישט-הידראָליזירטע ביאָמאַסע רעזאַדוז (אַרייַנגערעכנט פּראָדוקציע פון ​​סעריע צעל וואַנט עקסטראַקטן און זייער mAb סקרינינג) ניצן פריער באַשריבענע פּראָצעדורן 27, 43, 50, 51. פֿאַר גלייקאָם אַנאַליז, אַלקאָהאָל-נישט-לייזלעכע רעזאַדוז פון פלאַנצן צעל וואַנט מאַטעריאַל זענען צוגעגרייט פון ביאָמאַסע רעזאַדוז און אונטערגעוואָרפן צו סעריע עקסטראַקציע מיט ינקריסינגלי אַגרעסיוו רעאַגענץ אַזאַ ווי אַמאָוניאַם אָקסאַלאַטע (50 mM), סאָדיום קאַרבאָנאַט (50 mM און 0.5% w/v), CON. (1M און 4M, ביידע מיט 1% w/v סאָדיום באָראָהידריד) און זויער קלאָריט ווי פריער באַשריבן 52,53. די עקסטראַקטן זענען דעמאָלט אונטערגעוואָרפן צו ELISA קעגן אַ קאָמפּלעקס פּאַנעל פון mAb50s געריכטעט צו די צעל וואַנט גליקאַן, און די mAb ביינדינג ריאַקשאַנז זענען דערלאנגט ווי אַ היץ מאַפּע. mAbs טאַרגעטינג פלאַנצן צעל וואַנט גליקאַן זענען געקויפט פון לאַבאָראַטאָריע סטאַקס (CCRC, JIM און MAC סעריע).
איין-שטאַפּל ביאָטינילאַציע פון ​​אָליגאָסאַקאַרידן. די קאָניוגאַציע פון ​​קאַרבאָוכיידרייטן מיט ביאָטין-LC-הידראַזיד איז דורכגעפירט געוואָרן מיט דער פאלגענדער פּראָצעדור. ביאָטין-LC-הידראַזיד (4.6 מג/12 מיקראָמאָל) איז אויפגעלייזט געוואָרן אין דימעטהיל סולפֿאָקסייד (DMSO, 70 מיקראָל) דורך שטאַרקן רירן און הייצן ביי 65°C פֿאַר 1 מינוט. גלאַציאַל עסיק זויער (30 מיקראָל) איז צוגעגעבן געוואָרן און די געמיש איז אויסגעגאָסן געוואָרן אויף נאַטריום ציאַנאָבאָראָהידריד (6.4 מג/100 מיקראָמאָל) און גאָר אויפגעלייזט נאָך הייצן ביי 65°C פֿאַר אַרום 1 מינוט. דערנאָך, פון 5 ביז 8 מיקראָל פון דער רעאַקציע געמיש איז צוגעגעבן געוואָרן צו דער טרוקענער אָליגאָסאַקאַריד (1-100 נמאָל) צו באַקומען אַ 10-פאַכיגן אָדער מער מאָלאַרן איבערפלוס פון דער לייבל איבער דעם רעדוצירנדיקן עק. די רעאַקציע איז דורכגעפירט געוואָרן ביי 65°C פֿאַר 2 שעה, נאָכדעם זענען די מוסטערן גלייך גערייניקט געוואָרן. קיין סאָדיום ציאַנאָבאָראָהידריד איז נישט גענוצט געוואָרן אין די לייבאַלינג עקספּערימענטן אָן רעדוקציע, און די מוסטערן זענען רעאַגירט געוואָרן ביי 65°C פֿאַר 2.5 שעה.
ELISA באַדעקן און וואַשן פון מוסטערן פון ביאָטינילאַטעד אָליגאָסאַקאַרידן. 25 μl פון ביאָטינילאַטעד מוסטערן (100 μl פון יעדער קאָנצענטרירט מוסטער פארדיןטעט אין 5 מל פון 0.1 M טריס באַפער לייזונג (TBS)) זענען צוגעגעבן געוואָרן צו יעדן ברונעם פון דער אַווידין-באַדעקטע פּלאַטע. קאָנטראָל ברונעם זענען באַדעקט געוואָרן מיט 50 μl פון ביאָטין אין אַ קאָנצענטראַציע פון ​​10 μg/ml אין 0.1 M TBS. דעיאָניזירט וואַסער איז געניצט געוואָרן ווי אַ באַדעקן פֿאַר ליידיקע מעסטונגען. די טאַבלעט איז אינקובירט געוואָרן פֿאַר 2 שעה ביי צימער טעמפּעראַטור אין דער פינצטערניש. וואַשן די פּלאַטע 3 מאָל מיט 0.1% אָפּגעשעפּטע מילך אין 0.1 M TBS ניצנדיק פּראָגראַם נומ. 11 פֿאַר גרעניער פלאַך 3A.
צולייגן און וואַשן די ערשטיקע אַנטיקערפּערס. צולייגן 40 µl פון ערשטיקן אַנטיקערפּער צו יעדן לאָך. אינקובירן די מיקראָפּלאַטע פֿאַר 1 שעה ביי צימער טעמפּעראַטור אין דער פינצטערניש. די פּלאַטעס זענען דערנאָך געוואַשן געוואָרן 3 מאָל מיט 0.1% מילך אין 0.1M TBS ניצנדיק וואַש פּראָגראַם #11 פֿאַר גרעניער פלאַך 3A.
לייגט צו צווייטיקע אנטיקערפער און וואשט. לייגט צו 50 µl פון מויז/ראַט צווייטיקע אנטיקערפער (פארדיןנט 1:5000 אין 0.1% מילך אין 0.1 M TBS) צו יעדן לאָך. אינקובירט די מיקראָפּלאַטע פֿאַר 1 שעה ביי צימער טעמפּעראַטור אין דער פינצטערניש. די מיקראָפּלאַטעס זענען דעמאָלט געוואַשן געוואָרן 5 מאָל מיט 0.1% מילך אין 0.1 M TBS ניצנדיק Grenier Flat 5A פּלאַטע וואַש פּראָגראַם #12.
צולייגן אַ סאַבסטראַט. צולייגן 50 µl פון 3,3′,5,5′-טעטראַמעטהילבענזידין (TMB) צו דעם באַזע סאַבסטראַט (דורך צולייגן 2 טראָפּנס באַפער, 3 טראָפּנס TMB, 2 טראָפּנס הידראָגען פּעראָקסייד צו 15 מל פון דעיאָניזירט וואַסער). צוגרייטן דעם TMB סאַבסטראַט און וואָרטעקס איידער נוצן). אינקובירן די מיקראָפּלאַטע ביי צימער טעמפּעראַטור פֿאַר 30 מינוט. אין דער פינצטערניש.
פֿאַרענדיקט דעם שריט און לייענט די טאַבלעט. לייגט צו 50 µl פון 1 N שוועבל זויער צו יעדן לאָך און רעקאָרדירט ​​די אַבסאָרבאַנס פון 450 ביז 655 נם מיט אַן ELISA לייענער.
צוגרייטן 1 מג/מל לייזונגען פון די אנאליטן אין דעיאָניזירט וואַסער: אַראַבינאָזע, ראַמנאָזע, פוקאָזע, קסילאָזע, גאַלאַקטוראָניק זויער (GalA), גלוקוראָניק זויער (GlcA), מאַנאָזע, גלוקאָזע, גאַלאַקטאָזע, לאַקטאָז, N-אַסעטילמאַנאָסאַמין (manNAc), N-אַסעטילגלוקאָסאַמין (glcNAc), N-אַסעטילגאַלאַקטאָסאַמין (galNAc), ינאָסיטאָל (אינערלעכער סטאַנדאַרט). צוויי סטאַנדאַרדן זענען צוגעגרייט געוואָרן דורך צולייגן די 1 מג/מל צוקער לייזונגען געוויזן אין טאַבעלע 1. מוסטערן זענען געפֿרוירן און ליאָפֿיליזירט ביי -80°C ביז אַלע וואַסער איז אַוועקגענומען (געוויינטלעך וועגן 12-18 שעה).
לייגט צו 100–500 µg פון דער מוסטער צו די שרויף-דעקל רערן אויף אַן אַנאַליטישער וואָג. רעקאָרדירט ​​די צוגעגעבענע מאָס. עס איז בעסטער צו צעלאָזן די מוסטער אין אַ ספּעציפֿישער קאָנצענטראַציע פון ​​סאָלווענט און לייגן עס צו דער רער ווי אַ פליסיק אַליקוואָט. ניצט 20 µl פון 1 מג/מל ינאָסיטאָל ווי אַן אינערלעכער סטאַנדאַרט פֿאַר יעדער מוסטער רער. די מאָס אינערלעכער סטאַנדאַרט וואָס ווערט צוגעגעבן צו דער מוסטער מוז זיין די זעלבע ווי די מאָס אינערלעכער סטאַנדאַרט וואָס ווערט צוגעגעבן צו דער סטאַנדאַרט רער.
לייגט צו 8 מל פון וואַסערפֿרײַער מעטאַנאָל צו אַ פֿלאַש מיט אַ שרויף־דעקל. דערנאָך 4 מל פון אַ 3 N מעטאַנאָלישער הידראָטשלאָריד לייזונג, פֿאַרמאַכט און געשאָקלט. דער פּראָצעס ניצט נישט קיין וואַסער.
לייגט צו 500 µl פון 1 M HCl מעטאנאל לייזונג צו די אָליגאָסאַקאַריד מוסטערן און סטאַנדאַרט TMS טובס. מוסטערן זענען אינקובירט געוואָרן איבער נאַכט (168 שעה) ביי 80°C אין אַ טערמישן בלאָק. טריקנט דעם מעטאנאליז פּראָדוקט ביי צימער טעמפּעראַטור מיט אַ טריקעניש מאַניפאָולד. לייגט צו 200 µl MeOH און טריקנט ווידער. דער פּראָצעס ווערט איבערגעחזרט צוויי מאָל. לייגט צו 200 µl מעטאנאל, 100 µl פּירידין און 100 µl עסיק אַנהידריד צו דער מוסטער און מישט גוט. אינקובירט די מוסטערן ביי צימער טעמפּעראַטור פֿאַר 30 מינוט און טריקנט. לייגט צו 200 µl מעטאנאל און טריקנט ווידער.
לייגט צו 200 µl פון טרי-סיל און הײצט אויף די פֿאַרדעקטע רער פֿאַר 20 מינוט. 80°C, דערנאָך אָפּגעקילט ביז צימער טעמפּעראַטור. ניצט אַ טרוקענע מאַניפאָולד צו ווײַטער טרוקענען די מוסטער צו אַ באַנד פֿון אַרום 50 µl. עס איז וויכטיק צו באַמערקן אַז מיר האָבן נישט דערלויבט די מוסטערן צו גאָר טרוקענען.
לייגט צו 2 מל העקסאן און מישט גוט דורך וואָרטעקסן. פֿילט די שפּיצן פֿון פּאַסטער פּיפּעטן (5-8 מ״מ) מיט אַ שטיק גלאָז וואָל דורך אַרײַנשטעלן די גלאָז וואָל אויף אַ 5-3/4 אינטש דיאַמעטער פּיפּעט. די מוסטערן זענען סענטריפוגירט געוואָרן בײַ 3000 ג פֿאַר 2 מינוט. יעדע נישט-לעזלעכע רעשטלעך ווערן אָפּגעזאָגט. טריקנט די מוסטער צו 100-150 µl. אַ באַנד פֿון בערך 1 μl איז אײַנגעשפּריצט געוואָרן אין די GC-MS בײַ אַן אָנהייב טעמפּעראַטור פֿון 80 °C און אַן אָנהייב צײַט פֿון 2.0 מינוט (טאַבעלע 2).