O ṣeun fun lilo si Nature.com.Ẹya ẹrọ aṣawakiri ti o nlo ni atilẹyin to lopin fun CSS.Fun iriri ti o dara julọ, a ṣeduro pe ki o lo ẹrọ aṣawakiri imudojuiwọn kan (tabi pa ipo ibamu ni Internet Explorer) .Ni akoko yii, lati rii daju pe atilẹyin tẹsiwaju, a yoo ṣafihan aaye naa laisi awọn aza ati JavaScript.
morphogenesis gut ti eniyan ṣe agbekalẹ awọn ẹya crypt-villus ti 3D epithelial microarchitecture ati agbari aye.Eyi ti o yatọ ni a nilo lati ṣetọju homeostasis ikun nipasẹ idabobo onakan sẹẹli stem ni basal crypt lati awọn antigens microbial exogenous ati awọn metabolites wọn.Ni afikun, villi intestinco ati secreting mucusated on the cell basal mucusal ti o yatọ si awọn sẹẹli ti o ni aabo. Nitorinaa, atunṣe awọn ẹya epithelial 3D jẹ pataki fun ikole awọn awoṣe gut in vitro. Paapaa, Organic mimetic gut-on-a-chip le fa morphogenesis 3D lẹẹkọkan ti epithelium oporoku pẹlu awọn iṣẹ iṣe-ara ti o ni ilọsiwaju ati awọn iṣẹ biomechanics.Nibi, a pese ẹda ti o le ṣe atunjade lori protostin gutproducible protostin gut. dic chip bi daradara bi ni a Transwell embedded hybrid chip.A ṣe apejuwe awọn ọna alaye fun iṣelọpọ ẹrọ, culturing of Caco-2 tabi intestinal organoid epithelial cells intestinal organoid epithelial settings bi daradara bi lori kan microfluidic Syeed, fifa irọbi ti 3D morphogenesis, ati karakitariasesonu ti iṣeto 3D epithelia lilo ọpọ imaging modalities ti aṣepari ti microgeneration ti iṣan ti iṣan ti iṣelọpọ ti iṣẹ-ṣiṣe microfluidic. sisan fun 5 d.Our in vitro morphogenesis ọna ti n gba iṣẹ-ara ti o niiṣe ti iṣan-ara ati iṣipopada imọ-ẹrọ ati pe ko nilo imọ-ẹrọ sẹẹli ti o ni idiwọn tabi ifọwọyi, eyi ti o le ju awọn ilana miiran ti o wa tẹlẹ lọ.
Awọn idanwo ṣe afihan pe awọn sẹẹli ifun-inu Caco-2 ti a gbin ni gut-on-a-chip1,2,3,4,5 tabi bilayer microfluidic devices6,7 le faragba lẹẹkọkan 3D morphogenesis in vitro laisi oye ti o daju ti ilana ti o wa ni ipilẹ.Ninu iwadi wa aipẹ, a rii pe yiyọ kuro ti awọn ohun elo basolaterally ti o ni ikọkọ lati inu awọn ohun elo morphogen ti o jẹ pataki ni 3D. morphogenesis in vitro, eyiti a ti ṣe afihan nipasẹ Caco-2 ati awọn ẹya ara-ara inu alaisan ti ari.Awọn sẹẹli apani ti o wulo. Amuaradagba ti o ni nkan Nipa ṣiṣan ti nṣiṣe lọwọ (fun apẹẹrẹ, ni ikunke-lori-prún tabi awọn iru ẹrọ .Bid.
Ninu ilana yii, a pese ọna alaye fun sisẹ awọn microdevices gut-on-a-chip ati awọn eerun arabara ti a fi sii Transwell-insertable (awọn igbesẹ 1-5) si awọn sẹẹli epithelial intestinal ti aṣa lori polydimethylsiloxane (PDMS) -awọn membran porous ti o da lori (awọn igbesẹ 6A, 7A, 8, 9) ti awọn membran porous (igbesẹ 6A, 7A, 8, 9) ti transwells, 8, polyester, transwell, 8, polyester. induced 3D morphogenesis in vitro (igbesẹ 10) .A tun ṣe afihan awọn ẹya ara ẹrọ cellular ati molikula ti o ṣe afihan histogenesis ti ara-pato ti ara ati iyatọ cellular ti o gbẹkẹle ila-ila nipa lilo awọn ọna aworan pupọ (awọn igbesẹ 11-24) .A nfa morphogenesis nipa lilo ifun inu eniyan ti epithelial ẹyin, gẹgẹbi awọn ẹya ara ilu Caco-2 ti o wa ni oju-iwe ti o wa ni oju-ọna ti Cacorous tabi awọn ẹya ara ẹrọ ti o ni imọran ti Caco-2. ẹda ti awọn monolayers 2D, ati biochemical intestinal and Reproduction of the biomechanical microenvironment.in vitro.Lati jeki 3D morphogenesis lati 2D epithelial monolayers, a yọ morphogen antagonists ni awọn mejeeji gbin fọọmu nipa ti nṣàn awọn alabọde sinu basolateral kompaktimenti ti awọn asa.Nikẹhin, a le pese apẹrẹ ti epitheliD ti o jẹ apẹrẹ ti o le jẹ apẹrẹ 3. morphogen-ti o gbẹkẹle epithelial idagbasoke, gigun-ogun-microbiome àjọ-cultures, pathogen ikolu, iredodo ipalara, epithelial idankan aisedeede, ati probiotic-orisun awọn itọju ailera Example.influences.
Ilana wa le wulo fun ọpọlọpọ awọn onimo ijinlẹ sayensi ni ipilẹ (fun apẹẹrẹ, isedale mucosal oporoku, isedale sẹẹli sẹẹli, ati isedale idagbasoke) ati iwadi ti a lo (fun apẹẹrẹ, idanwo oogun preclinical, iṣapẹẹrẹ arun, imọ-ẹrọ ti ara, ati gastroenterology) ipa gbooro.Nitori atunṣe ati agbara ti ilana ilana wa ti o fa apilẹṣẹ 3 ti ipilẹṣẹ imọ-ẹrọ. nwon.Mirza le ti wa ni tan kaakiri si awọn olugbo ti keko awọn dainamiki ti cell ifihan agbara nigba oporoku idagbasoke, isọdọtun tabi homeostasis .Ni afikun, wa Ilana jẹ wulo fun interrogating ikolu labẹ orisirisi àkóràn òjíṣẹ bi Norovirus 8, Àdájú Àrùn Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium, Salmon Difficile.Awọn olugbohunsafẹfẹ ti aisan aisan ati awọn pathogenesis tun wulo.Lilo eto-ara lori-chip gut microphysiology le jẹ ki o jẹ ki o jẹ ki o jẹ ala-alakoso gigun 10 ati igbelewọn ti o tẹle ti idaabobo ogun, awọn idahun ti ajẹsara ati atunṣe ipalara ti o niiṣe pẹlu ipalara ti o niiṣe pẹlu gastrointestinal tract 11 .Awọn ailera GI miiran ti o ni nkan ṣe pẹlu leaky gut syndrome, arun ti arun celiac, Crohn's syndrome, Crohn's syndrome le jẹ arun ti o leaky, tabi arun Crohn's. 3D oporoku epithelial Layer ti wa ni pese sile nipa lilo awọn alaisan ká 3D oporoku epithelial Layer , wọnyi arun ni villous atrophy, crypt kikuru, mucosal bibajẹ, tabi motiyo epithelial barrier.Biopsy tabi stem cell-ti ari oporoku organoids12,13.Lati dara awoṣe awọn ti o ga awọn sẹẹli-aisan iru awọn iru arun le ka awọn iru awọn ti o ga eka-aisan awọn iru arun le. awọn sẹẹli iparun (PBMCs), si awọn awoṣe ti o ni 3D oporoku villus-crypt microarchitectures.Awọn sẹẹli ajẹsara ara-ara, 5.
Niwọn igba ti microstructure 3D epithelial microstructure le jẹ ti o wa titi ati wiwo laisi ilana ipin, awọn oluwo ti n ṣiṣẹ lori awọn transcriptomics aye ati ipinnu giga-giga tabi aworan ti o ga julọ le nifẹ si aworan agbaye wa ti awọn agbara aye spatiotemporal ti awọn Jiini ati awọn ọlọjẹ lori awọn iho epithelial.Nife ninu imọ ẹrọ.Idahun si microbial tabi ajẹsara stimuli.Pẹlupẹlu, longitudinal host-microbiome crosstalk 10, 14 that coordinate gut homeostasis le ti wa ni idasilẹ ni 3D oporoku mucosal Layer nipa àjọ-culturing orisirisi makirobia eya, microbial agbegbe tabi fecal microbiota-.ni Syeed.This ona jẹ paapa wuni lati jepe keko mucosal ajẹsara, gastroenterology, eda eniyan microbiome, culturomics ati isẹgun microbiology koni lati cultivate tẹlẹ uncultured ikun microbiota ninu awọn labatory.If wa in fitiro morphogenesis Ilana le ti wa ni fara si scalable asa ọna kika, gẹgẹ bi awọn multiwell, 8 repetitions ni 624 platenishs. , Ilana naa tun le tan kaakiri si awọn ti o ndagbasoke elegbogi, biomedical Tabi ibojuwo ti o ga-giga tabi awọn iru ẹrọ afọwọsi fun ile-iṣẹ ounjẹ.Gẹgẹbi ilana-ẹri, a ṣe afihan laipẹ ti o ṣeeṣe ti multiplex giga-throughput morphogenesis eto iwọn si 24-daradara plate plate .Ni afikun,18 ti a ti ṣeto awọn ọja ti o ni eto 1-chi. Ifọwọsi ti ọna morphogenesis in vitro wa le jẹ iyara ati agbara nipasẹ ọpọlọpọ awọn ile-iṣẹ iwadii, ile-iṣẹ tabi ijọba ati awọn ile-iṣẹ ilana lati ni oye atunto cellular ti in vitro gut morphogenesis ni ipele transcriptomic lati ṣe idanwo awọn oogun tabi awọn oogun biotherapeutics Gbigba ati gbigbe ti awọn oludije oogun ni a ṣe ayẹwo nipa lilo awọn awoṣe gut gut 3D tabi lilo awọn eto-iṣatunṣe eto-ara ti eto-ara-ara-ara-ara-ara-ara-ara-ara-ara-ara-ara-ara-ara-ara-ara-ara-ara-ara-ara-ara-ara-ara-ara-ara-ara-ara-ara-ara-ara-ara-ara-ara-ara-ara-ara-ara-ara-ara-ara-ara. ilana.
Nọmba to lopin ti awọn awoṣe adanwo ti o ni ibatan ti eniyan ni a ti lo lati ṣe iwadii morphogenesis ti inu ifun inu, nipataki nitori aini awọn ilana imuse lati fa morphogenesis 3D ni vitro.Ni otitọ, pupọ ninu imọ ti isiyi nipa ikun morphogenesis da lori awọn ẹkọ ẹranko (fun apẹẹrẹ, zebrafish20, mice21 tabi chickens22, bi o ti wu ki o ri, ati pe wọn ko le ṣe pataki ṣaaju ki o to le ṣe pataki) cisely pinnu awọn ilana idagbasoke eniyan.Awọn awoṣe wọnyi tun ni opin pupọ ninu agbara wọn lati ṣe idanwo ni ọna iwọn-ọpọlọpọ ọna.Nitorina, ilana wa fun isọdọtun awọn ẹya ara 3D tissu in vitro outperforms in vivo eranko si dede bi daradara bi miiran ibile aimi 2D cell aṣa awọn awoṣe.Gẹgẹ bi a ti ṣapejuwe tẹlẹ, lilo 3D epithelial ti o yatọ si awọn sẹẹli ti a gba laaye si awọn sẹẹli ti o yatọ si ibi-itumọ ti awọn sẹẹli ti a gba laaye si awọn sẹẹli ti o yatọ. orisirisi mucosal tabi ajẹsara stimuli.3D epithelial Layer le pese aaye kan lati iwadi bi makirobia ẹyin ti njijadu lati dagba awọn aaye aaye ati awọn itankalẹ ilolupo ni esi si ogun okunfa (eg, akojọpọ dipo lode mucus Layer, yomijade ti IgA ati antimicrobial peptides) .Siwaju sii, 3D epithelial morpholoji le gba wa laaye lati ni oye awọn microbial morphology ati awọn agbegbe ti o le gba wa laaye lati ni oye microbit. metabolites (fun apẹẹrẹ, awọn acids fatty pq kukuru) ti o ṣe apẹrẹ eto cellular ati awọn ohun elo sẹẹli stem ni awọn crypts basal.Awọn ẹya wọnyi le ṣe afihan nikan nigbati awọn ipele epithelial 3D ti fi idi mulẹ ni vitro.
Ni afikun si ọna wa ti ṣiṣẹda 3D intestinal epithelial structures, nibẹ ni o wa ni ọpọlọpọ awọn in vitro awọn ọna.Intestinal organoid asa ti wa ni a ipinle-ti-ti-aworan tissue engineering ilana ti o da lori awọn ogbin ti oporoku stem ẹyin labẹ awọn pato morphogen ipo23,24,25.Sibẹsibẹ, awọn lilo ti 3D organoid organoid-mode-mode fun gbigbe gbigbe-modulemo-mikini igba ni como-modulemo atupale tabi awọn awoṣe lulú. ti wa ni pipade laarin organoid ati, nitorina, iṣafihan awọn paati itanna gẹgẹbi awọn sẹẹli microbial tabi awọn antigens exogenous ti ni opin.Wiwọle si awọn lumens organoid le ni ilọsiwaju nipa lilo microinjector, 26,27 ṣugbọn ọna yii jẹ invasive ati iṣẹ-ṣiṣe ati pe o nilo imoye pataki lati ṣe.Pẹlupẹlu, awọn aṣa aṣa organoid ti aṣa ti a tọju ni awọn scaffolds hydrogel labẹ awọn ipo aimi ko ṣe afihan deede ni iṣẹ-ṣiṣe ni vivo biomechanics.
Awọn ọna miiran ti a gba nipasẹ awọn ẹgbẹ iwadii pupọ lo awọn iṣipopada hydrogel 3D ti a ti ṣatunto lati ṣe afiwe ilana eto epithelial ikun nipasẹ dida awọn sẹẹli ifun eniyan ti o ya sọtọ lori oju gel. gradients, Igbekale kan to ga aspect ratio epithelial be ati stroma-epithelial crosstalk nipa pẹlu stromal ẹyin ninu awọn scaffold.Sibẹsibẹ, awọn iseda ti prestructured scaffolds le se awọn ifihan ti awọn lẹẹkọkan morphogenetic ilana ara.These si dede tun ko ba pese ìmúdàgba luminal tabi interstitial shephysiar iṣan ti o nilo awọn aapọn ti iṣan ti iṣan ti iṣan ti o wa labẹ iṣan ti iṣan. iwadi miiran laipẹ ti a lo awọn scaffolds hydrogel ni aaye microfluidic kan ati awọn ẹya apẹrẹ ti oporoku ti iṣan nipa lilo awọn ilana imudara laser-etching. lati inu ẹgbẹ kanna ni o le ṣẹda awọn tubes gut kekere pẹlu awọn ilana morphogenetic lẹẹkọkan.Pelu awọn iṣelọpọ eka ti awọn ẹya ikun ti o yatọ laarin tube, awoṣe yii tun ko ni ṣiṣan ṣiṣan luminal ati abuku ẹrọ.Ni afikun, iṣẹ ṣiṣe awoṣe le ni opin, paapaa lẹhin ilana ilana bioprinting ti pari, awọn ipo idanwo perturbing tabi awọn ibaraenisepo ti sẹẹli. , Fisioloji ti o yẹ wahala rirẹ, biomechanics ti o fara wé gut motility, Ayewo ti ominira apical ati basolateral compartments, ati ki o tun-ẹda ti eka ti ibi microenvironments ti modularity.Nitorina, wa in vitro 3D morphogenesis Ilana le pese kan tobaramu ona lati bori awọn italaya ti wa tẹlẹ ọna.
Ilana wa ti wa ni idojukọ patapata lori 3D epithelial morphogenesis, pẹlu awọn sẹẹli epithelial nikan ni aṣa ati pe ko si awọn iru miiran ti awọn sẹẹli ti o wa ni ayika gẹgẹbi awọn sẹẹli mesenchymal, awọn sẹẹli endothelial, ati awọn sẹẹli ajẹsara.Gẹgẹbi a ti ṣalaye tẹlẹ, ipilẹ ti ilana wa ni ifakalẹ ti morphogen epithelial nipasẹ yiyọ awọn inhibitors morphogen ti a fi pamọ si ti ẹgbẹ-ihamọ-robu ti o wa ni iha ti rosost-gusu. -chip ati hybrid-on-a-chip gba wa laaye lati tun ṣẹda Layer epithelial 3D ti ko ni ailopin, afikun awọn eka ti ibi-ara gẹgẹbi awọn ibaraenisepo epithelial-mesenchymal33,34, extracellular Matrix (ECM) deposition 35 ati, ninu awoṣe wa, awọn ẹya crypt-villus ti o gbe awọn niches cell niches basal crypts. ni iṣelọpọ ti awọn ọlọjẹ ECM ati ilana ti morphogenesis intestinal in vivo35,37,38.Awọn afikun ti awọn sẹẹli mesenchymal si awoṣe wa ṣe imudara ilana morphogenetic ati ṣiṣe asopọ sẹẹli.The endothelial Layer (ie, capillaries or lymphatics) ṣe ipa pataki ninu iṣakoso awọn ohun elo molecular transportmenturmentur3440 ti o le wa ni ti sopọ laarin awọn awoṣe tissu jẹ ohun pataki ṣaaju nigbati awọn awoṣe tissu ti ṣe apẹrẹ lati ṣe afihan awọn ibaraẹnisọrọ ti awọn ohun-ara-pupọ.Nitorina, awọn sẹẹli endothelial le nilo lati wa pẹlu awọn ẹya ara ẹrọ ti o peye diẹ sii pẹlu ipinnu ipele ti eto-ara.
Lilo awọn eerun arabara jẹ taara diẹ sii ju gut-on-a-chip nitori iṣeto ẹrọ jẹ rọrun ati lilo awọn ifibọ Transwell ngbanilaaye fun aṣa ti iwọn ti gut epithelium.Sibẹsibẹ, awọn ifibọ Transwell ti o wa ni iṣowo pẹlu awọn membran polyester kii ṣe rirọ ati pe ko le ṣe simulate peristaltic-like agbeka.Pẹlupẹlu, apical ti a fi sii apikal ti a fi sii ti chibrirt ti a fi sii ti apical ti a fi sii pẹlu awọn apikal ti a fi sii ti o wa ni idawọle ti o wa ni erupẹ ti a fi sii ti o wa ni erupẹ ti a fi sii ti apical ti a fi sii pẹlu awọn apikal ti a fi sii ti o wa ni erupẹ ti o wa ni erupẹ ti o wa ni erupẹ. apical side.Clearly, awọn aimi-ini ninu awọn apical kompaktimenti ṣọwọn jeki gun-igba kokoro arun àjọ-asa ni arabara chips.While a le robustly jeki 3D morphogenesis ni Transwell ifibọ nigba lilo arabara awọn eerun igi, awọn aito ti physiologically ti o yẹ biomechanics ati apical ito sisan le se idinwo awọn seese elo Syeed ti hybrid hybrid.
Awọn atunṣe ti o ni kikun ti eniyan crypt-villus axis ni gut-on-a-chip ati awọn aṣa arabara-on-a-chip ti ko ti ni idasilẹ ni kikun.Niwọn igba ti morphogenesis bẹrẹ lati monolayer epithelial, 3D microarchitectures ko ni dandan pese iṣeduro morphological si crypts ni vivo.Biotilẹjẹpe 3D ti o wa ni agbegbe ti o wa ni agbegbe ti microcrypter ti o wa ni agbegbe ti o wa ni agbegbe crypter ni vivo. Lium, awọn crypt ati awọn agbegbe villous ko ni iyasọtọ kedere.Biotilẹjẹpe awọn ikanni ti o ga julọ lori ërún asiwaju si ilosoke ti o pọju ti epithelium microengineered, giga ti o pọju ṣi wa ni opin si ~ 300-400 µm. Ijinle gangan ti awọn ifun inu eniyan ni awọn ifun kekere ati nla jẹ ~ 135 µm, ni ọwọ ati ~ 400, iwọn ti o ga julọ jẹ ~ 135 µm µm, ati ~ 4. 600µm41.
Lati oju wiwo aworan, ni ipo ti o ga julọ ti awọn aworan 3D microarchitectures le ni opin si ikun lori chirún kan, nitori pe ijinna iṣẹ ti a beere lati lẹnsi ojulowo si Layer epithelial wa lori aṣẹ ti awọn milimita diẹ. Lati bori iṣoro yii, ipinnu ti o jinna le nilo.Pẹlupẹlu, ṣiṣe awọn apakan tinrin fun aworan aworan ni idi ti o ga julọ. , Niwọn bi microfabrication Layer-by-Layer microfabrication ti ikun lori chirún kan jẹ ifaramọ titilai laarin Layer kọọkan, o jẹ ipenija pupọ lati ṣii tabi yọkuro Layer oke lati ṣe ayẹwo igbekalẹ dada ti Layer epithelial.Fun apẹẹrẹ, nipa lilo microscope elekitironi ọlọjẹ (SEM).
Awọn hydrophobicity ti PDMS ti jẹ ifosiwewe idiwọn ni awọn ẹkọ-orisun microfluidic ti o niiṣe pẹlu awọn ohun elo kekere hydrophobic, niwon PDMS le ṣe aiṣedeede adsorb iru awọn ohun elo hydrophobic. Awọn iyipada si PDMS le ṣe ayẹwo pẹlu awọn ohun elo polymeric miiran. ize adsorption ti hydrophobic moleku.
Nikẹhin, ọna wa ko ti ni ijuwe daradara ni awọn ofin ti pese ibojuwo ti o ga-giga tabi "ọkan-iwọn-fits-all" olumulo ore-afẹfẹ Syeed. Ilana ti o wa lọwọlọwọ nilo fifa syringe fun microdevice, eyi ti o gba aaye ni incubator CO2 ati idilọwọ awọn adanwo-nla. Eleyi aropin le ti wa ni significantly dara si nipasẹ awọn scalability, tabi 4 Culture-format 4 (eg 4) - daradara la kọja awọn ifibọ ti o gba lemọlemọfún replenishment ati yiyọ ti basolateral media).
Lati jeki 3D morphogenesis ti eniyan ifun epithelium ni fitiro, a lo microfluidic chirún oporoku ẹrọ ti o ni awọn meji ni afiwe microchannels ati awọn ẹya rirọ porous awo laarin lati ṣẹda a lumen-capillary ni wiwo.A tun afihan awọn lilo ti a nikan-ikanni microfluidic ẹrọ (a arabara chirún) ti o wa ni lemọlemọfún basolar Layers Layer ti a fi sii lori awọn mejeeji Layer ti a fi sii Layer ti o wa ni erupe ile. morphogenesis ti awọn oriṣiriṣi awọn sẹẹli epithelial intestinal eniyan ni a le ṣe afihan nipasẹ lilo ifọwọyi itọnisọna ti sisan lati yọ awọn antagonists morphogen kuro ni aaye basolateral.Gbogbo ilana idanwo (Figure 1) ni awọn ẹya marun: (i) microfabrication ti gut chip tabi Transwell insertable chip hybrid (igbesẹ 1-5; 2) Apoti-ẹyin ninu awọn sẹẹli ti o wa ninu apo-ara (ipin 1-2) Apoti inu awọn sẹẹli ti o wa ninu apo-ara eniyan. stinal organoids;apoti 2-5), (iii) asa ti awọn ẹyin epithelial oporoku lori awọn eerun ifun tabi awọn eerun arabara (igbesẹ 6-9), (iv) induction of 3D morphogenesis in vitro (Igbese 10) ati (v) ) lati ṣe apejuwe 3D epithelial microstructure (igbesẹ 11-24) ti a ṣe ilana ti o munadoko ni isalẹ ti iṣakoso ti o yẹ ni isalẹ. morphogenesis nipa fifiwera morphogenesis epithelial si aaye, akoko, ipo, tabi awọn iṣakoso ilana.
A lo awọn iru ẹrọ aṣa meji ti o yatọ: gut-on-a-chip pẹlu awọn ikanni ti o taara tabi awọn ikanni convoluted ti kii ṣe deede, tabi awọn eerun arabara ti o ni awọn ifibọ Transwell (TW) ninu ẹrọ microfluidic kan, ti a ṣe gẹgẹ bi a ti ṣalaye ninu apoti 1, ati igbesẹ 1 -5. In vitro morphogenesis” ṣe afihan awọn igbesẹ gbogbogbo ninu eyiti Caco-2 tabi awọn sẹẹli epithelial ti o ni organoid ti gbin lori chirún oporoku tabi lori awọn ifibọ Transwell ti chirún arabara, atẹle nipa ifakalẹ ti morphogenesis 3D ati dida nọmba ti ohun elo ti a ṣe afihan ni isalẹ apoti eto apẹrẹ ni isalẹ. stinal epithelial layers le ṣee lo, fun apẹẹrẹ, ni iyasọtọ iyatọ sẹẹli, awọn ẹkọ ẹkọ fisioloji gut, idasile awọn ilolupo eda abemi-ogun-microbiome, ati awoṣe aisan.Immunofluorescence images in "Cell Differentiation" ti o nfihan awọn ekuro, F-actin ati MUC2 ti o han ni 3D Caco-2 epithelial epithelial chipd mucosal mucosal ti o wa ninu awọn ẹyin mucosal mucosal ti a ti gbejade ni awọn ẹyin mucosal mucosal. surfaces.Fluorescent images in Gut Physiology show mucus produced by spoting for sialic acid and N-acetylglucosamine residues using fluorescent alikama germ agglutinin.Awọn aworan agbekọja meji ni "Olugbalejo-Microbe Co-Cultures" ṣe afihan aṣoju-aṣoju-microbiome co-cultures ni ikun ti o wa ninu ikun ti o wa ni apa osi ti Epo-Culturen Fluorisenti Fluorisenti. gineered 3D Caco-2 epithelial cell. Awọn apa ọtun fihan isọdibilẹ ti GFP E. coli co-cultured with 3D Caco-2 epithelial cell, atẹle nipa imunofluorescence idoti pẹlu F-actin (pupa) ati awọn ekuro (bulu) . Arun modeli n ṣe afihan ilera ni ilera dipo ikun leaky ni gut lipopolochi chips, egusi liana ti o ni kokoro-arun L. ati awọn sẹẹli ajẹsara (fun apẹẹrẹ, PBMC;alawọ ewe) .Caco-2 ẹyin ti a gbin lati fi idi kan 3D epithelial Layer.Scale bar, 50 µm.Aworan ni isalẹ kana: "Iyatọ ti awọn sẹẹli" fara pẹlu aiye lati itọkasi.2.Oxford University Press;Atunse pelu igbanilaaye Ref.5.NAS;"Olugbalejo-Microbe Co-Culture" fara pẹlu aiye lati ref.3.NAS;"Modeling Arun" fara pẹlu aiye lati itọkasi.5.NAS.
Mejeeji gut-on-chip ati awọn eerun arabara ni a ṣe pẹlu lilo awọn ẹda PDMS ti a fi silẹ lati awọn apẹrẹ silikoni nipasẹ lithography rirọ1,44 ati apẹrẹ pẹlu SU-8.Apẹrẹ ti microchannels ni chirún kọọkan ni a pinnu nipasẹ ṣiṣe akiyesi awọn hydrodynamics bii wahala irẹwẹsi ati titẹ agbara hydrodynamic1,4,12.Awọn atilẹba gut-on-a-chip Data ti o ni taara ti o jẹ apẹrẹ parax. microchannels, ti wa sinu eka gut-on-a-chip (Extended Data Fig. 1b) ti o ni awọn meji ti awọn microchannels ti o tẹ lati mu ki akoko gbigbe omi ti o pọ sii, awọn ilana ṣiṣan ti kii ṣe deede, ati idibajẹ multiaxial ti awọn sẹẹli ti o gbin (Fig. 2a-f) 12. Nigbati diẹ sii idiju gut biomechanics, ti o nilo lati ṣe afihan gutchilu-gutcreaon. ted Gut-Chip tun fi agbara mu morphogenesis 3D ni akoko kanna pẹlu iwọn iru ti idagbasoke epithelial ti a fiwewe si Gut-Chip atilẹba, laibikita iru sẹẹli ti o gbin.Nitorina, lati fa morphogenesis 3D, laini ati eka lori-chip gut awọn aṣa jẹ interchangeable.PDMS awọn ẹda ti a ṣe arowoto lori awọn apẹrẹ silikoni 8 (Fig.2a) .Lati ṣe ifun inu lori chirún kan, Layer PDMS ti o ti pese silẹ ni a ti sopọ si fiimu PDMS ti o pọju ati lẹhinna ni ibamu pẹlu iwọn ilawọn PDMS kekere nipasẹ isunmọ ti ko ni iyipada nipa lilo olutọpa corona (Fig. 2b-f) .Lati ṣe awọn eerun arabara, awọn atunṣe PDMS ti o ni arowoto ti wa ni asopọ si awọn ifaworanhan gilasi kan ti o le ṣẹda awọn ohun elo ti o ni ẹyọkan-ikanni ti o le fi sii kan microflud. Nọmba data ti o gbooro sii.
a, Sikematiki apejuwe ti awọn igbaradi ti PDMS awọn ẹya ara lati SU-8 patterned silikoni molds.The uncured PDMS ojutu ti a dà pẹlẹpẹlẹ a silikoni mold (osi), si bojuto ni 60 °C (arin) ati demolded (ọtun) .The demolded PDMS ti a ge si awọn ege ati ki o mọtoto fun siwaju lilo.b, Aworan ti awọn silikoni moldMS lo lati mura silikoni moldm. rous membrane.d, A jara ti awọn aworan ti oke ati isalẹ PDMS irinše ati awọn ti apejo on-chip oporoku ẹrọ.e, Sikematiki ti awọn alignment ti awọn oke, awo, ati isalẹ PDMS irinše.Each Layer ti wa ni irreversibly bonded nipa pilasima tabi corona treat.f, Ero ti awọn se gut-on-a-chipmber ohun elo, supervacated gut-on-a-chimber ẹrọ pẹlu supervacuum. lori-a-chip fun aṣa sẹẹli microfluidic.Ifun ti a ṣe lori chirún kan ti a pejọ pẹlu tube silikoni ati syringe ti a gbe sori ibori kan.A ti gbe ẹrọ chirún sori ideri ti 150 mm Petri satelaiti fun sisẹ.A lo binder lati pa silikoni tube.h, Awọn aworan iwo wiwo ti arabara chipsmorphation ti arabara2D 3D ti a pese silẹ ni ominira ti iṣelọpọ chibridwell2D. ers of intestinal epithelial ẹyin ti a ti fi sii sinu awọn arabara ërún lati jeki oporoku 3D morphogenesis.The alabọde ti wa ni perfused nipasẹ microchannels nisalẹ awọn cell Layer ti iṣeto lori Transwell ifibọ.Scale bar, 1 cm.h Tuntun pẹlu aiye lati itọkasi.4.Elsevier.
Ninu ilana yii, laini sẹẹli Caco-2 ati awọn ẹya ara inu ifun ni a lo bi awọn orisun epithelial (Fig. 3a) . Mejeeji awọn iru sẹẹli ni a gbin ni ominira (Apoti 2 ati Apoti 5) ati pe a lo lati irugbin awọn microchannels ti a bo ECM ti inu-chip gut tabi awọn ifibọ Transwell.Nigbati awọn sẹẹli ba wa ni confluent (> sk95% Cabet 1) awọn sẹẹli ti o wa ni deede ati awọn sẹẹli flawee 95% , awọn sẹẹli ti o ni ibatan si 95% Cweebet. 50) ni T-flasks ti wa ni ikore lati mura awọn ifasilẹ awọn sẹẹli ti a ti ya sọtọ nipasẹ ito trypsinization (apoti 2) . Awọn ohun alumọni intestinal ti ara eniyan lati inu awọn biopsies intestinal tabi awọn atunṣe abẹ-abẹ ni a gbin ni Matrigel scaffold domes ni awọn apẹrẹ 24-daradara lati ṣe atilẹyin fun awọn microenvironment morphogens ti o wa ni ipilẹ, awọn ohun elo ti o niiṣe pẹlu awọn ohun elo ti o niiṣe pẹlu awọn ohun elo ti ko ni imọran. bi a ti ṣe apejuwe rẹ ni Apoti 3 ni a ṣe afikun ni gbogbo ọjọ miiran titi awọn organoids yoo dagba si ~ 500 µm ni iwọn ila opin. Awọn ohun elo ti o ni kikun ti wa ni ikore ati ki o pin si awọn sẹẹli kan fun irugbin lori ikun tabi awọn ifibọ Transwell lori ërún (Apoti 5) .Gẹgẹbi a ti sọ tẹlẹ, o le ṣe iyatọ gẹgẹbi arun type12,13, arun ti o ni arun ti o jẹ deede , fun apẹẹrẹ, arun akàn ti 12,13, fun apẹẹrẹ awọ-aisan awọ-ara , tabi aarun ayọkẹlẹ ti Croectative , fun apẹẹrẹ. dipo agbegbe ti ko ni ipalara) ati ipo ikun ati inu ikun (fun apẹẹrẹ, duodenum, jejunum, ileum, cecum, colon, or rectum) .A pese ilana ti o dara julọ ni Apoti 5 fun dida awọn organoids colonic (coloids) ti o nilo awọn ifọkansi ti o ga julọ ti awọn morphogens ju awọn ẹya ara inu ifun kekere lọ.
a, Ṣiṣan iṣẹ fun ifisi ti gut morphogenesis ninu gut chip.Caco-2 eniyan intestinal epithelium ati awọn ẹya ara inu ifun ni a lo ninu ilana yii lati ṣe afihan morphogenesis 3D. Awọn sẹẹli epithelial ti o ya sọtọ ni a ti gbin ni ohun elo gut-on-a-chip ti a pese silẹ (pipe igbaradi) MS ti wa ni irugbin (seeded 0) ati awọn sẹẹli ti a fi silẹ (seeded dayrous) (seeded) Apical (AP) ṣiṣan ti wa ni ipilẹṣẹ ati titọju fun awọn ọjọ 2 akọkọ (sisan, AP, D0-D2) .Basolateral (BL) ṣiṣan tun bẹrẹ pẹlu awọn iṣipopada cyclic cyclic (na, sisan, AP ati BL) nigbati 2D monolayer pipe ti wa ni akoso. morphogenesis 3D intestinal ti morphogenesis waye lairotẹlẹ ti awọn aworan microogenesis ti awọn ọjọ 5. co-2 ẹyin ni kọọkan esiperimenta igbese tabi akoko ojuami (bar graph, 100 µm) .Mrin sikematiki awọn aworan atọka illustrating awọn ti o baamu cascades ti gut morphogenesis (oke apa ọtun) .The dashed ọfà ninu awọn sikematiki soju fun awọn itọsọna ti ito flow.b, SEM image fifi awọn dada topology ti iṣeto ti 3D Caco-2 epitheliified apoti fihan (Apoti ti a ti tunṣe) ni agbegbe ti o pọju. villi lori 3D Caco-2 Layer (ọtun) .c, Petele iwaju wiwo ti mulẹ Caco-2 3D, claudin (ZO-1, pupa) ati lemọlemọfún fẹlẹ aala membran ike F-actin (alawọ ewe) ati awọn arin (bulu) Immunofluorescence confocal iworan ti epithelial ẹyin tọkasi awọn ifun ipo kọọkan ti awọn oporoku chips. .d, Akoko akoko ti awọn iyipada morphological ninu awọn organoids ti o gbin lori chirún ti a gba nipasẹ microscopy itansan alakoso ni awọn ọjọ 3, 7, 9, 11, ati 13. Inset (oke apa ọtun) ṣe afihan titobi giga ti aworan ti a pese.e, DIC photomicrograph of organoid 3D epithelium ti iṣeto ni ikun lori awọn ege ti ajẹsara ti o ya ni ọjọ 7, Awọn aworan ajẹsara ti ajẹsara 5.magenta), awọn sẹẹli goblet (MUC2; alawọ ewe), F-actin (grẹy) ati awọn ekuro (cyan) ti o dagba lori awọn eerun ikun fun awọn ọjọ 3, lẹsẹsẹ (Osi) ati 13-ọjọ (arin) organoids lori Layer epithelial. Wo tun Extended Data Figure 3, eyi ti o ṣe afihan LGR5 ifihan agbara lai ṣe afihan awọn aworan ifihan agbara LGR5 ti MUC2s epitureceliD. organoid epithelium ti iṣeto ni ikun lori kan ni ërún nipa didaba pilasima awo pẹlu CellMask dye (ọtun) ni ọjọ 13 ti asa.Awon igi jẹ 50 μm ayafi ti bibẹkọ ti so.b Tuntun pẹlu aiye lati itọkasi.2.Oxford University Press;c Ti a mu pelu igbanilaaye lati Itọkasi.2.Oxford University Press;e and f adapted with ašẹ nipa itọkasi.12 Labẹ Creative Commons License CC BY 4.0.
Ninu ikun ti o wa ni chirún, o jẹ dandan lati ṣe atunṣe oju omi hydrophobic ti PDMS porous membrane fun aṣeyọri ECM ti o ni ilọsiwaju.Ninu ilana yii, a lo awọn ọna oriṣiriṣi meji lati ṣe atunṣe hydrophobicity ti awọn membran PDMS.Fun culturing Caco-2 cells, iṣiṣẹ dada nipasẹ UV/ozone itọju nikan ni o to lati dinku awọn hydrophobicity ti ECM ati awọn sẹẹli ti o wa ni oju-iwe CaPD-CM. , Aṣa microfluidic ti organoid epithelium nilo iṣẹ-ṣiṣe dada ti o dada ti kemikali lati ṣaṣeyọri ifisilẹ daradara ti awọn ọlọjẹ ECM nipasẹ titẹle polyethyleneimine (PEI) ati glutaraldehyde si microchannels PDMS.Lẹhin iyipada oju-aye, awọn ọlọjẹ ECM ti wa ni ipamọ lati bo oju-iwe PDMS ti o ṣiṣẹ ti iṣẹ-ṣiṣe, ti a fi sii awọn sẹẹli ti o wa ni ipilẹ ti o wa ni ipilẹṣẹ microfluter. s nipa perfusing nikan ni alabọde sinu microchannel oke titi ti awọn sẹẹli ṣe agbekalẹ monolayer pipe, lakoko ti microchannel isalẹ n ṣetọju awọn ipo aimi.Ọna iṣapeye yii fun imuṣiṣẹ dada ati ideri ECM jẹ ki asomọ ti epithelium organoid lati fa morphogenesis 3D lori oju PDMS.
Awọn aṣa transwell tun nilo ibora ECM ṣaaju ki irugbin sẹẹli;sibẹsibẹ, awọn aṣa Transwell ko nilo awọn igbesẹ pretreatment ti o nipọn lati mu dada ti awọn ifibọ la kọja ṣiṣẹ.Fun dagba awọn sẹẹli Caco-2 lori awọn ifibọ Transwell, ECM ti a bo lori awọn ifibọ la kọja accelerates awọn asomọ ti dissociated Caco-2 ẹyin (<1 wakati) ati kiko junction idena Ibiyi (<1-2 ọjọ) .Lati asa organoids on Transwell awọn ẹya ara ẹrọ ti wa ni ti wa ni so awọn ECM-ti a fi sii awọn ẹya ara ilu ti o wa ni erupe ile-iṣẹ ti a fi sii si awọn ẹya ara ti ECM ti a fi sii, ti a fi sii awọn ohun elo ti o wa ni erupẹ ti ECM ti a fi sii lori awọn ohun elo ti a fi sii sinu awọn ohun elo ti o wa ni erupẹ ti a ti fi sii ti ECM. 3 h) ati muduro titi ti awọn organoids ṣe agbekalẹ monolayer pipe pẹlu iduroṣinṣin idena .Awọn aṣa Transwell ni a ṣe ni awọn apẹrẹ 24-daradara laisi lilo awọn eerun arabara.
In vitro 3D morphogenesis ni a le bẹrẹ nipasẹ fifi ṣiṣan omi si abala basolateral ti Layer epithelial ti iṣeto.Ninu ikun lori chirún kan, morphogenesis epithelial bẹrẹ nigbati alabọde ti wa ni perfused sinu awọn microchannels oke ati isalẹ (Fig. 3a) .Gẹgẹbi a ti ṣalaye tẹlẹ, o ṣe pataki lati ṣafihan ṣiṣan ṣiṣan omi ni isalẹ (basolateral yiyọ kuro) awọn ohun elo aṣiri ti o to ni itosi. omi ara si awọn sẹẹli ti a dè lori awọn membran la kọja ati ṣe ina wahala rirẹ luminal, a maa n lo ṣiṣan meji ninu ikun lori chirún kan.Ninu awọn eerun arabara, awọn ifibọ Transwell ti o ni awọn monolayers epithelial ti a fi sii sinu awọn chips arabara.Lẹhinna, a ti lo alabọde labẹ ẹgbẹ basolateral ti fi sii la kọja Transwell fi sii nipasẹ microchannelogenesis intestination intestinal days intestinal.
Awọn ẹya ara ẹrọ morphological ti microengineered 3D epithelial layers le ṣe atupale nipa lilo orisirisi awọn ọna kika aworan, pẹlu microscopy itansan alakoso, iyatọ kikọlu iyatọ (DIC) microscopy, SEM, tabi immunofluorescence confocal microscopy (Awọn nọmba 3 ati 4) .Itọsọna alakoso tabi aworan DIC le ṣe ni irọrun ti a ṣe ni irọrun ni eyikeyi akoko ti o wa ni apẹrẹ ti o wa ni apẹrẹ ti o wa ni akoko 3. ical transparency of PDMS ati polyester films, mejeeji gut-on-a-chip ati awọn iru ẹrọ chibrid arabara le pese akoko gidi ni ibi-itumọ aaye laisi iwulo fun apakan tabi disassembly ti ẹrọ naa.Nigbati o ba n ṣe imunofluorescence aworan (Awọn nọmba 1, 3c, f ati 4b, c), awọn sẹẹli ti wa ni deede ti o wa titi pẹlu paramita 1% (volde 1) 2% (wt / vol) ) bovine serum albumin (BSA), ni ibere.Ti o da lori iru sẹẹli, o yatọ si awọn atunṣe, awọn permeabilizers, ati awọn aṣoju idinamọ le ṣee lo. indole, DAPI) tabi F-actin (fun apẹẹrẹ, aami fluorescently phalloidin) . Aworan igbesi aye ti o da lori fluorescence tun le ṣe ni ipo lati rii iṣelọpọ mucus (Fig.1, "Iyatọ ti sẹẹli" ati "Ẹkọ-ara-ara Gut"), isọdọtun laileto ti awọn sẹẹli microbial (Fig. 1, "Aṣa-ajọpọ-ile-ogun-microbe"), igbanisiṣẹ ti awọn sẹẹli ti ajẹsara (Fig. 1, 'Aṣaro Arun') tabi awọn apẹrẹ ti 3D epithelial morphology (Fig. 4bifying the bottom Layer, f 3ct) ti o wa ni isalẹ lati microchant. nel Layer, gẹgẹbi a ti ṣe apejuwe rẹ ni ref.Bi o ti han ni aworan 2, 3D epithelial morphology bi daradara bi awọn microvilli lori apical fẹlẹ aala le wa ni visualized nipa SEM (Fig. 3b) .The ikosile ti iyato asami le ti wa ni iwon nipa sise pipo PCR5 tabi nikan-cell RNA sequencing.Ninu idi eyi, Chibrin Layer ti awọn sẹẹli dagba ninu awọn ẹyin 3 ti awọn epibrid ti awọn epibrid ti awọn sẹẹli ti o dagba ni awọn sẹẹli RNA ti o wa ni erupẹ 3 ti awọn epin. trypsinization ati lẹhinna lo fun molikula tabi itupalẹ jiini.
a, Ṣiṣan iṣẹ-ṣiṣe fun ifisi ti morphogenesis intestinal ni chibrid arabara.Caco-2 ati awọn ohun elo intestinal ti wa ni lilo ninu ilana yii lati ṣe afihan morphogenesis 3D ni apẹrẹ chibrid. (TW asa) .Lẹhin 7 ọjọ, a nikan Transwell ifibọ ti o ni awọn kan 2D monolayer ti epithelial ẹyin ti a ese sinu kan arabara ërún lati se agbekale a basolateral sisan (Sisan, BL), eyi ti o be yori si awọn iran ti a 3D epithelial Layer (morphogenesis) .Phase itansan micrographs afihan morphological awọn ẹya ara ẹrọ ti eda eniyan ẹya ara epithelial donor akoko ni akoko 1 ti adanwo akoko ni akoko idanwo. schematics ni awọn ipele oke ṣe apejuwe iṣeto idanwo fun igbesẹ kọọkan.b, Awọn eerun arabara (iṣiro osi) le ja si morphogenesis 3D ti awọn sẹẹli epithelial organoid pẹlu awọn iwo microscopy confocal oke-isalẹ ti o ya ni awọn ipo Z ọtọtọ (oke, arin, ati isalẹ;wo eto eto ọtun ati awọn ila ti o baamu).ṣe afihan awọn abuda ẹya ara ẹni ti o han gbangba.F-actin (cyan), arin (grẹy) .c, Fluorescence confocal micrographs (3D angled view) ti organoid-ti ari epithelial ẹyin gbin ni aimi Transwell (TW; inset laarin funfun dashed apoti) dipo arabara ërún (tobi kikun shot) comparing 3D morphology versus versus 2D views. inset ni igun apa ọtun oke; “XZ”) tun fihan awọn ẹya 2D ati 3D. Pẹpẹ iwọn, 100 µm.c Ti a tun tẹ pẹlu igbanilaaye lati itọkasi.4.Elsevier.
Awọn iṣakoso ni a le pese sile nipasẹ dida awọn sẹẹli kanna (Caco-2 tabi awọn sẹẹli epithelial organoid intestinal) sinu awọn monolayers onisẹpo meji labẹ awọn ipo aṣa aimi ti aṣa. Paapaa, idinku ounjẹ le ja si nitori iwọn iwọn didun lopin ti awọn microchannels (ie ~ 4 µL ni ikanni oke lori atilẹba gut-chip design, ati pe o le jẹ ki o to fiwewe pe apiti ti iṣan ti iṣan ti iṣan). .
Ilana lithography rirọ yẹ ki o ṣee ṣe ni yara ti o mọ. Fun Layer kọọkan lori chirún (awọn ipele oke ati isalẹ ati awọn membran) ati awọn eerun arabara, awọn oriṣiriṣi photomasks ni a lo ati ti a ṣe lori awọn wafer silikoni lọtọ nitori awọn giga ti microchannels yatọ.Awọn ibi ibi-afẹde ti awọn microchannels oke ati isalẹ ti ikun lori chirún jẹ 500 µm ti ibi-afẹde giga ati 500 µm ti ibi-afẹde. 200µm.
Fi 3-inch silikoni wafer sinu satelaiti pẹlu acetone. rọra yi awo naa fun awọn aaya 30, lẹhinna afẹfẹ gbẹ wafer.Gbigbe lọ si awo kan pẹlu IPA, lẹhinna yi awo naa fun 30 s lati nu.
Ojutu piranha kan (adapọ ti hydrogen peroxide ati sulfuric acid ogidi, 1: 3 (vol/vol)) le ṣee lo ni yiyan lati mu yiyọkuro awọn iṣẹku Organic pọ si lati dada wafer silikoni.
Ojutu Piranha jẹ ipalara pupọ ati pe o nmu ooru ṣiṣẹ.Awọn iṣọra ailewu afikun jẹ pataki.Fun isọnu egbin, jẹ ki ojutu naa tutu ati ki o gbe lọ si mimọ, egbin egbin gbigbẹ.Lo awọn apoti keji ati fi aami si awọn apoti egbin daradara.Jọwọ tẹle awọn itọnisọna ailewu ti ohun elo fun awọn ilana alaye diẹ sii.
Dehydrate awọn wafers nipa gbigbe wọn si ori 200 °C ti o gbona fun awọn iṣẹju 10. Lẹhin gbigbẹ, a ti mì wafer ni igba marun ni afẹfẹ lati dara.
Tú ~ 10 g ti photoresist SU-8 2100 si aarin ti wafer silikoni ti a ti mọtoto.Lo awọn tweezers lati tan photoresist ni deede lori wafer.Lẹẹkọọkan gbe wafer lori 65 ° C ti o gbona awo lati jẹ ki photoresist kere si alalepo ati ki o rọrun lati tan.Ma ṣe gbe wafer taara lori awo ti o gbona.
SU-8 ni a pin ni deede lori wafer nipasẹ ṣiṣatunṣe iyipo ti nwọle. Layer oke ti ikun lori chirún; wo “Awọn igbesẹ pataki” ni isalẹ) ṣeto ni isare ti 300 rpm/s 30 aaya ni 1,200 rpm.
Iyara alayipo akọkọ le ṣe atunṣe ni ibamu si sisanra ibi-afẹde ti ilana SU-8 lori wafer ohun alumọni.
Lati ṣe awọn ilana SU-8 ti giga 500 µm fun ipele oke ti ikun lori chirún, ideri iyipo ati awọn igbesẹ beki rirọ ti Apoti yii (awọn igbesẹ 7 ati 8) ni a tun ṣe ni atẹlera (wo igbesẹ 9) lati gbe awọn fẹlẹfẹlẹ meji ti 250 µm A Layer ti o nipọn ti SU-8, eyiti o le ṣe Layer ati darapo nipasẹ UV0 5 ni ipele giga kan.
Rirọ beki awọn wafers ti a bo SU-8 nipa gbigbe awọn wafers ni pẹkipẹki sori awo gbigbona ni 65 °C fun iṣẹju 5, lẹhinna yipada eto si 95 °C ati incubate fun iṣẹju 40 afikun.
Lati ṣaṣeyọri giga 500 μm ti ilana SU-8 ni microchannel oke, tun ṣe awọn igbesẹ 7 ati 8 lati ṣe ina awọn ipele SU-8 nipọn 250 μm meji.
Lilo UV Mask Aligner, ṣe idanwo atupa ni ibamu si awọn itọnisọna olupese lati ṣe iṣiro akoko ifihan ti wafer.(akoko ifihan, ms) = (iwọn ifihan, mJ/cm2) / (agbara atupa, mW/cm2).
Lẹhin ti npinnu akoko ifihan, gbe fotomask sori ohun elo iboju-boju ti aligner boju-boju UV ki o gbe iboju fọto sori wafer ti a bo SU-8.
Gbe oju ti a tẹjade ti iboju fọto taara si ẹgbẹ SU-8 ti a bo ti wafer ohun alumọni lati dinku pipinka UV.
Fi SU-8 wafer ti a bo ati iboju fọto ni inaro si 260 mJ/cm2 ti ina UV fun akoko ifihan ti a ti pinnu tẹlẹ (wo igbesẹ 10 ti apoti yii).
Lẹhin ifihan UV, SU-8-coated silicon wafers ti wa ni ndin ni 65 ° C fun 5 min ati 95 ° C fun 15 min lori awopọ gbigbona kọọkan lati ṣe awọn ilana pẹlu giga ti 200 μm. Fa akoko lẹhin-beke ni 95 °C si 30 min lati ṣe awọn apẹrẹ pẹlu giga ti 500 µm.
Awọn Olùgbéejáde ti wa ni dà sinu gilasi kan satelaiti, ati awọn ti o yan wafer ti wa ni gbe sinu awọn satelaiti.The iwọn didun ti SU-8 Olùgbéejáde le yato da lori awọn iwọn ti awọn gilasi plate.Make sure to use to SU-8 developer to complete remove unexposed SU-8.Fun apẹẹrẹ, nigba lilo a 150 mm diamita gilasi satelaiti pẹlu kan 1 L agbara, lo ~ 300 mL ti SU-8 mL ti nmulẹmu fun awọn iṣẹju ro deve .
Fi omi ṣan mimu ti o ni idagbasoke pẹlu ~ 10 milimita ti olupilẹṣẹ tuntun ti o tẹle nipasẹ IPA nipa sisọ ojutu naa nipa lilo pipette kan.
Fi wafer sinu ẹrọ mimọ pilasima ati fi han si pilasima atẹgun (gaasi oju aye, titẹ ibi-afẹde 1 × 10-5 Torr, agbara 125 W) fun awọn iṣẹju 1.5.
Fi wafer sinu ẹrọ apanirun igbale pẹlu ifaworanhan gilasi inu.Wafers ati awọn ifaworanhan le wa ni ẹgbẹ si ẹgbẹ.Ti a ba pin desiccator vacuum si awọn ipele pupọ nipasẹ awo kan, gbe awọn ifaworanhan ni iyẹwu isalẹ ati awọn wafers ni iyẹwu oke.Drop 100 μL ti trichloro (1H, 1Hroo) 2H, 2H, 2H, 2H, 2H, 1Hrooct, silflu, silflu, silflu, silflu, silli, silli, ati 100 μL ti trichloro. isọdọtun.
Tú vial kan ti awọn sẹẹli Caco-2 tio tutunini ni iwẹ omi 37°C, lẹhinna gbe awọn sẹẹli yo si ọpọn T75 ti o ni 15 milimita ti 37°C prewarmed Caco-2 alabọde.
Lati kọja awọn sẹẹli Caco-2 ni ~ 90% confluency, akọkọ gbona Caco-2 alabọde, PBS, ati 0.25% trypsin/1 mM EDTA ni iwẹ omi 37°C.
Aspirate awọn alabọde nipa igbale aspiration.Wẹ ẹyin lemeji pẹlu 5 milimita ti gbona PBS nipa tun igbale aspiration ati fifi titun PBS.