O ṣeun fun lilo si Nature.com.Ẹya ẹrọ aṣawakiri ti o nlo ni atilẹyin opin fun CSS.Fun iriri ti o dara julọ, a ṣeduro pe ki o lo ẹrọ aṣawakiri imudojuiwọn kan (tabi pa ipo ibaramu ni Internet Explorer) .Ni akoko yii, lati rii daju pe atilẹyin tẹsiwaju, a yoo ṣafihan aaye naa laisi awọn aza ati JavaScript.
morphogenesis eniyan n ṣe agbekalẹ awọn ẹya crypt-villus ti 3D epithelial microarchitecture ati agbari aye.Eyi ti o yatọ ni a nilo lati ṣetọju homeostasis ikun nipa idabobo onakan sẹẹli stem ni basal crypt lati awọn antigens microbial exogenous ati awọn metabolites wọn.Ni afikun, villi intestinal ati secreting mucused on the cell barrite secretally ti o yatọ si awọn sẹẹli ti o ni aabo ninu awọn sẹẹli ti o ni aabo lọwọlọwọ. dada mucosal.Nitorina, atunṣe awọn ẹya epithelial 3D jẹ pataki fun ikole ti awọn awoṣe gut in vitro. Paapaa, Organic mimetic gut-on-a-chip le fa morphogenesis 3D lẹẹkọkan ti epithelium oporoku pẹlu awọn iṣẹ iṣe-ara ti o ni ilọsiwaju ati biomechanics.Nibi, a pese awọn ipadasẹhin prosttoprost. morphogenesis ninu ikun lori chirún microfluidic bi daradara bi ni Transwell ti a fi sinu chibrid arabara.A ṣe apejuwe awọn ọna alaye fun iṣelọpọ ẹrọ, cultuing of Caco-2 or intestinal organoid epithelial cell intestinal organoid cell settings as well as on a microfluidic platform, induction of 3D morphogenesis, and characterization of 3D morphogenesis, ti o ti mulẹ nipa lilo imuduro 3D ti awọn ẹda ti o ni ilọsiwaju ti awọn ẹda-ara ti o ni ilọsiwaju. microarchitecture gut iṣẹ ṣiṣe nipasẹ ṣiṣakoso ṣiṣan omi basolateral fun 5 d.Ọna in vitro morphogenesis wa ti n gba aapọn rirẹ-ara ti o ni ibatan ti ẹkọ-ara ati iṣipopada ẹrọ ati pe ko nilo imọ-ẹrọ sẹẹli ti o nipọn tabi ifọwọyi, eyiti o le kọja awọn imuposi miiran ti o wa tẹlẹ. fun biomedical, isẹgun, ati elegbogi awọn ohun elo.
Awọn idanwo ṣe afihan pe awọn sẹẹli ifun-inu Caco-2 ti a gbin ni gut-on-a-chip1,2,3,4,5 tabi bilayer microfluidic devices6,7 le faragba lẹẹkọkan 3D morphogenesis in vitro laisi oye ti o daju ti ilana ti o wa ni ipilẹ. Ninu iwadi wa laipe, a rii pe yiyọkuro awọn ohun elo basolaterally ti o ni ikọkọ lati inu awọn ohun elo morphogen ti o ṣe pataki lati fa awọn ohun elo morphogen. 3D epithelial morphogenesis in vitro, eyiti a ti ṣe afihan nipasẹ Caco-2 ati awọn ẹya ara ti o wa ni inu alaisan. Awọn sẹẹli Epithelial ti ni ifọwọsi.Ninu iwadi yii, a ni idojukọ pataki lori iṣelọpọ sẹẹli ati pinpin ifọkansi ti antagonist Wnt ti o lagbara, Dickkopf-1 (DKK-1), ninu gut-on-a-chip ati awọn ẹrọ microfluidic ti a yipada ti o ni awọn ifibọ Transwell, ti a pe ni “Chip Hybrid”. frizzled-related protein 1, tabi Soggy-1) si on-chip gut idinamọ morphogenesis tabi disrupts awọn prestructured 3D epithelial Layer , ni iyanju wipe antagonistic wahala nigba asa jẹ lodidi fun oporoku morphogenesis in vitro.Nitorina, a wulo ona lati se aseyori logan morphogenesis ni awọn epithelial ni wiwo ti o kere Wẹ jẹ ki o mu awọn ipele ti o lagbara ni wiwo ti o kere ju ni wiwo ti o wa ni iwọn apọju Wẹ. kompaktimenti nipa ti nṣiṣe lọwọ flushing (fun apẹẹrẹ, ni gut-on-a-chip tabi arabara-on-a-chip awọn iru ẹrọ) tabi itankale .Basolateral media (fun apẹẹrẹ, lati Transwell ifibọ sinu tobi basolateral reservoirs ni kanga).
Ninu ilana yii, a pese ọna alaye fun sisẹ awọn microdevices gut-on-a-chip ati awọn eerun arabara ti a fi sii Transwell-insertable (awọn igbesẹ 1-5) si awọn sẹẹli epithelial intestinal ti aṣa lori polydimethylsiloxane (PDMS) -awọn membran porous ti o da lori (awọn igbesẹ 6A, 7A, 8, 9) ti awọn membran porous (igbesẹ 6A, 7A, 8, 9) tabi transwells 7B steps. 8, 9) ati induced 3D morphogenesis in vitro (igbesẹ 10) .A tun ṣe afihan awọn ẹya ara ẹrọ cellular ati molikula ti o ṣe afihan histogenesis ti ara-pato ati iyatọ ti cellular ti o gbẹkẹle ila-ila nipa lilo awọn ilana aworan pupọ (igbesẹ 11-24) .A nfa morphogenesis nipa lilo awọn ifun inu inu eniyan bi awọn ẹya-ara ti epithelial-2 iru awọn sẹẹli-ara-ara ti Castin-2 iru awọn ohun elo ti o wa ninu ẹda ara-ara ni awọn sẹẹli-ara-ara ti Castinal. Awọn alaye imọ-ẹrọ pẹlu iyipada dada ti awọn membran la kọja, ẹda ti awọn monolayers 2D, ati biochemical intestinal and Reproduction of the biomechanical microenvironment.in vitro.Lati fa 3D morphogenesis lati 2D epithelial monolayers, a yọ awọn antagonists morphogen ni awọn fọọmu mejeeji ti gbin nipasẹ ṣiṣan alabọde sinu basolateralcompartment. Layer epithelial 3D ti o tun ṣe atunṣe ti o le ṣee lo lati ṣe apẹẹrẹ idagbasoke epithelial ti o gbẹkẹle morphogen, gigun-ogun-microbiome co-cultures, ikolu pathogen, ipalara ipalara, aiṣedeede epithelial, ati awọn itọju ti o da lori probiotic Example.influences.
Ilana wa le wulo fun ọpọlọpọ awọn onimo ijinlẹ sayensi ni ipilẹ (fun apẹẹrẹ, isedale mucosal oporoku, isedale sẹẹli sẹẹli, ati isedale idagbasoke) ati iwadi ti a lo (fun apẹẹrẹ, idanwo oogun preclinical, awoṣe arun, imọ-ẹrọ ti ara, ati gastroenterology) ipa gbooro. ṣe akiyesi pe ilana imọ-ẹrọ wa ni a le tan kaakiri si awọn olugbo ti n ṣe ikẹkọ awọn agbara ti ifihan sẹẹli lakoko idagbasoke ifun, isọdọtun tabi homeostasis .Ni afikun, ilana wa wulo fun ifọrọwanilẹnuwo ikolu labẹ ọpọlọpọ awọn aṣoju àkóràn bii Norovirus 8, Arun Inu atẹgun ti o lagbara Coronavirus 2 (SARS-Costridium tabi 2), Clofficimum. onigbagbo. Awọn olugbohunsafẹfẹ ti aisan ati awọn pathogenesis tun wulo.Lilo ti eto-ara microphysiology lori-chip gut le jẹ ki o jẹ ki iṣọpọ-aṣa gigun gigun 10 ati igbelewọn ti o tẹle ti idaabobo ogun, awọn idahun ti ajẹsara ati awọn ipalara ti o niiṣe pẹlu ipalara ti o niiṣe pẹlu gastrointestinal tract 11 .Awọn ailera GI miiran ti o ni nkan ṣe pẹlu leaky gut syndrome, arun ulcer pouch, arun celiac, Crohn's syndrome. afarawe nigba ti 3D oporoku epithelial Layer ti wa ni pese sile nipa lilo awọn alaisan ká 3D oporoku epithelial Layer , wọnyi arun ni villous atrophy, crypt kikuru, mucosal bibajẹ, tabi motiyo epithelial barrier.Biopsy tabi stem cell-ti ari oporoku organoids-Lati o dara awoṣe ti awọn cell arun organoids12,13. awọn oriṣi, gẹgẹbi awọn sẹẹli agbeegbe ẹjẹ mononuclear (PBMCs), si awọn awoṣe ti o ni awọn microarchitectures intestinal 3D ninu villus-crypt. Awọn sẹẹli ajẹsara ara-ara, 5.
Niwọn igba ti microstructure 3D epithelial microstructure le jẹ ti o wa titi ati wiwo laisi ilana ipin, awọn oluwo ti n ṣiṣẹ lori awọn transcriptomics aye ati ipinnu giga-giga tabi aworan ti o ga julọ le nifẹ si aworan agbaye wa ti awọn agbara aye spatiotemporal ti awọn Jiini ati awọn ọlọjẹ lori awọn iho epithelial. Nife ninu imọ ẹrọ.Idahun si microbial tabi ajẹsara stimuli.Pẹlupẹlu, longitudinal host-microbiome crosstalk 10, 14 that coordinate gut homeostasis le ti wa ni idasilẹ ni 3D oporoku mucosal Layer nipa àjọ-culturing orisirisi makirobia eya, microbial agbegbe tabi fecal microbiota-. ni Syeed.This ona jẹ paapa wuni lati jepe keko mucosal ajẹsara, gastroenterology, eda eniyan microbiome, culturomics ati isẹgun microbiology koni lati cultivate tẹlẹ uncultured ikun microbiota ninu awọn laboratorie.If wa in fitiro morphogenesis Ilana le ti wa ni fara si ti iwọn asa ọna kika, gẹgẹ bi awọn multiwell, repete 4 daradara tabi 624 platenish. basolateral compartments, awọn Ilana le tun ti wa ni tan si awon sese elegbogi, biomedical Tabi ga-throughput waworan tabi afọwọsi awọn iru ẹrọ fun awọn ounje ile ise.Gẹgẹ bi awọn kan atilẹba ti o ti-ilana, a laipe afihan awọn seese ti a multiplex ga-throughput morphogenesis eto scalable to 24-daradara platechi awọn ọja-Inpupu organiformance. commercialized16,17,18.Nitorina, afọwọsi ti wa in vitro morphogenesis ọna le ti wa ni accelerated ati oyi gba nipa ọpọlọpọ awọn iwadi kaarun, ile ise tabi ijoba ati ilana lati ni oye cellular reprogramming ti in vitro gut morphogenesis ni awọn transcriptomic ipele lati se idanwo awọn oogun tabi biotherapeutics Awọn oludije tabi gbigbe ti oogun ti a ṣe ayẹwo ni lilo gut gut. awọn awoṣe eto ara-on-a-chip lati ṣe ayẹwo atunṣe ti ilana morphogenesis gut.
Nọmba to lopin ti awọn awoṣe adanwo ti o ni ibatan ti eniyan ni a ti lo lati ṣe iwadi morphogenesis ti oporoku, nipataki nitori aini awọn ilana ti o ṣee ṣe lati fa morphogenesis 3D ni vitro.Ni otitọ, pupọ ninu imọ ti o wa lọwọlọwọ nipa morphogenesis gut da lori awọn ẹkọ ẹranko (fun apẹẹrẹ, zebrafish20, mice21 tabi chickens22, bi o ti wu ki o ri, ati pe wọn le ṣe iye owo pupọ julọ). Ni pataki, maṣe pinnu ni pato awọn ilana idagbasoke eniyan.Awọn awoṣe wọnyi tun ni opin pupọ ni agbara wọn lati ṣe idanwo ni ọna iwọn-ọpọlọpọ ọna.Nitorina, ilana wa fun isọdọtun awọn ẹya ara 3D tissu in vitro outperforms in vivo eranko si dede bi daradara bi miiran ibile aimi 2D cell awọn awoṣe.Gẹgẹ bi a ti ṣapejuwe tẹlẹ, lilo 3D ti o yatọ si awọn sẹẹli ti a gba laaye lati ṣe ayẹwo awọn sẹẹli ti o yatọ si epithei ti agbegbe ti a gba laaye si epiti awọn crypt-villus axis ni esi si orisirisi mucosal tabi ajẹsara stimuli.3D epithelial Layer le pese aaye kan lati iwadi bi microbial ẹyin ti njijadu lati dagba aaye niches ati itankalẹ ilolupo ni esi si ogun okunfa (fun apẹẹrẹ, inu dipo lode mucus Layer, yomijade ti IgA ati antimicrobial peptides) le gba awọn epithelit gusu 3 siwaju sii. microbiota ẹya awọn oniwe-agbegbe ati ki o synergistically fun makirobia metabolites (eg, kukuru-pq ọra acids) ti o apẹrẹ cellular ajo ati stem cell Koro ni basal crypts.Awọn wọnyi ni awọn ẹya ara ẹrọ le nikan wa ni afihan nigbati 3D epithelial Layer ti wa ni idasilẹ ni fitiro.
Ni afikun si ọna wa ti ṣiṣẹda 3D oporoku awọn ẹya epithelial intestinal, ọpọlọpọ awọn ọna in vitro wa.Aṣa organoid intestinal jẹ ilana imọ-ẹrọ ti ara-ti-ti-aworan ti o da lori ogbin ti awọn sẹẹli ifun inu inu labẹ awọn ipo morphogen pato23,24,25.Sibẹsibẹ, lilo 3D organoid organoid host-modedede fun gbigbe awọn ọna gbigbe ni igbagbogbo tabi awọn awoṣe ti o wa ni ile-iṣọpọ ti o wa ni ile-iṣọpọ ti awọn ohun elo ti o ni imọran ti awọn ohun elo ti o ni imọran ti o ni imọran ti o ni imọran ti o ni imọran ti o ni imọran ti o ni imọran ti o ni imọran ti o ni imọran ti o ni imọran ti o ni imọran ti o ni imọran ti o ni imọran ti o ni imọran ti o ni imọran ti o ni imọran ti o ni imọran ti o ni imọran. lumen oporoku ti wa ni pipade laarin organoid ati, nitorinaa, iṣafihan awọn paati itanna gẹgẹbi awọn sẹẹli microbial tabi awọn antigens exogenous ti ni opin. Wiwọle si awọn lumens organoid le ni ilọsiwaju nipa lilo microinjector, 26,27 ṣugbọn ọna yii jẹ invasive ati iṣẹ-ṣiṣe ati pe o nilo imoye pataki lati ṣe.Pẹlupẹlu, awọn aṣa aṣa organoid ti aṣa ti a tọju ni awọn scaffolds hydrogel labẹ awọn ipo aimi ko ṣe afihan deede ni iṣẹ-ṣiṣe ni vivo biomechanics.
Awọn ọna miiran ti a gba nipasẹ awọn ẹgbẹ iwadii pupọ lo awọn iyẹfun hydrogel 3D ti a ti ṣatunto lati ṣe afiwe igbekalẹ epithelial ikun nipasẹ dida awọn sẹẹli ifun eniyan ti o ya sọtọ lori oju gel. ti o yẹ morphogen gradients, Igbekale kan ti o ga aspect ratio epithelial be ati stroma-epithelial crosstalk nipa pẹlu stromal ẹyin ninu awọn scaffold.Sibẹsibẹ, awọn iseda ti prestructured scaffolds le se awọn ifihan ti awọn lẹẹkọkan morphogenetic ilana ara.These si dede tun ko pese ìmúdàgba luminal tabi lacking awọn iṣan omi ti o wa labẹ awọn sẹẹli ti o wa ni erupẹ ti o ni agbara ti o ni agbara ti o wa ni abẹlẹ. morphogenesis ati jèrè iṣẹ iṣe-ara.Iwadi aipẹ miiran ti a lo awọn scaffolds hydrogel ni ipilẹ microfluidic kan ati awọn ẹya apẹrẹ ti oporoku nipa lilo awọn ilana imudara laser-etching. pẹlu ikun mechanobiological movements.3D titẹ sita imuposi lati kanna ẹgbẹ ni anfani lati ṣẹda kekere gut tubes pẹlu lẹẹkọkan morphogenetic ilana.Pelu awọn eka iṣelọpọ ti o yatọ si gut apa laarin awọn tube, awoṣe yi tun ko luminal ito sisan ati darí abuku.Afikun, awoṣe operability le wa ni opin, paapa lẹhin ti awọn pipo-perepere ti ilana-igbeyewo awọn ipo ti awọn bioturing awọn ipo. interactions.Dipo, wa dabaa Ilana pese lẹẹkọkan gut morphogenesis, physiologically ti o yẹ rirẹ wahala, biomechanics ti o mimic gut motility, Ayewo ti ominira apical ati basolateral compartments, ati ki o tun-ẹda ti eka ti ibi microenvironments ti modularity.Nitorina, wa in vitro 3D morphtole morphogenesis le pese awọn ọna ti o wa tẹlẹ si awọn ọna ti o wa ni vitro.
Ilana wa ti wa ni idojukọ patapata lori 3D epithelial morphogenesis, pẹlu awọn sẹẹli epithelial nikan ni aṣa ati pe ko si awọn iru awọn sẹẹli ti o wa ni ayika gẹgẹbi awọn sẹẹli mesenchymal, awọn sẹẹli endothelial, ati awọn sẹẹli ajẹsara.Gẹgẹbi a ti ṣalaye tẹlẹ, ipilẹ ti ilana wa ni ifakalẹ ti morphogenesis epithelial nipasẹ yiyọ awọn inhibitors morphogen ti a fi pamọ si ti ẹgbẹ ti robust. gut-on-a-chip ati hybrid-on-a-chip gba wa laaye lati ṣe atunṣe Layer epithelial 3D ti ko ni ailopin, awọn afikun awọn ohun elo ti ibi bi epithelial-mesenchymal interactions33,34, extracellular Matrix (ECM) deposition 35 ati, ninu awoṣe wa, crypt-villus awọn ẹya ara ẹrọ ti o gbe awọn sẹẹli ti o wa ni crypt ni awọn sẹẹli ti o wa ni basal . fibroblasts) ni mesenchyme ṣe ipa pataki ninu iṣelọpọ awọn ọlọjẹ ECM ati ilana ti morphogenesis intestinal in vivo35,37,38.Afikun awọn sẹẹli mesenchymal si awoṣe wa ṣe imudara ilana ilana morphogenetic ati imudara asomọ sẹẹli. Layer endothelial (ie, capillaries or lymphatics) 3 ti n ṣe ipa ipa-ipa kan ti ajẹsara 3 ṣiṣẹ ni ipasẹ ajẹsara. ninu ikun microenvironment.Pẹlupẹlu, awọn ohun elo vasculature ti o le ni asopọ laarin awọn awoṣe tissu jẹ ohun pataki kan nigbati awọn awoṣe ti ara ti wa ni apẹrẹ lati ṣe afihan awọn ibaraẹnisọrọ ti ara ẹni-pupọ.Nitorina, awọn sẹẹli endothelial le nilo lati wa pẹlu awọn ẹya ara ẹrọ ti ara ẹni deede diẹ sii pẹlu ipinnu ipele-ara-ara. ajesara-pato tissu ni ipo ti afarawe arun ifun.
Lilo awọn eerun arabara jẹ taara diẹ sii ju gut-on-a-chip nitori iṣeto ẹrọ jẹ rọrun ati lilo awọn ifibọ Transwell ngbanilaaye fun aṣa ti iwọn ti gut epithelium.Sibẹsibẹ, awọn ifibọ Transwell ti o wa ni iṣowo pẹlu awọn membran polyester kii ṣe rirọ ati pe ko le ṣe simulate peristaltic-like agbeka.Pẹlupẹlu, apical ti a fi sii ti chibrirt ti a fi sii ti a fi sii ti o wa ni ibudo ti o wa ni pipiti ko si ni idaduro ti apical ti a fi sii pẹlu awọn apikal ti a fi sii ti a fi sii ti apical ti a fi sii ti a fi sii ti a fi sii ti o wa ni ibudo transwell ti o wa ni afikun. rirẹ wahala lori awọn apical side.Kọ, awọn aimi-ini ninu awọn apical kompaktimenti ṣọwọn jeki gun-igba kokoro arun àjọ-asa ni arabara chips.While a le robustly induce 3D morphogenesis ni Transwell awọn ifibọ nigba lilo arabara awọn eerun igi, awọn aito ti physiologically ti o yẹ biomechanics ati apical sisan Syeed ti o pọju le se idinwo awọn hybrid omi sisan elo.
Awọn atunṣe ti o ni kikun ti eniyan crypt-villus axis ni gut-on-a-chip ati awọn aṣa arabara-on-a-chip ti ko ti ni idasilẹ ni kikun.Niwọn igba ti morphogenesis bẹrẹ lati monolayer epithelial, 3D microarchitectures ko ni dandan pese iru-ara-ara-ara si awọn crypts ni vivo.Biotilẹjẹpe a ṣe afihan agbegbe ti microcrypter ti o wa ni agbegbe ti o wa ni agbegbe microcrypter ni vivo. 3D epithelium, awọn crypt ati villous awọn ẹkun ni a ko ṣe afihan kedere.Biotilẹjẹpe awọn ikanni oke ti o ga julọ lori ërún asiwaju si ilosoke giga ti epithelium microengineered, giga ti o pọju ṣi wa ni opin si ~ 300-400 µm. Ijinle gangan ti awọn ifun inu eniyan ni kekere ati nla ifun titobi jẹ ~ 135 µ ati 4µm. villi ifun kekere jẹ ~ 600 µm41.
Lati oju iwoye aworan, ni ipo Super-o ga aworan ti 3D microarchitectures le wa ni opin si ikun lori kan ni ërún, niwon awọn ti a beere ṣiṣẹ ijinna lati awọn ohun to lẹnsi si awọn epithelial Layer jẹ lori awọn ibere ti a diẹ millimeters. Lati bori isoro yi, a ti o jina ohun to le nilo. PDMS.Pẹlupẹlu, niwọn bi microfabrication Layer-nipasẹ-Layer ti ikun lori chirún kan jẹ ifaramọ titilai laarin Layer kọọkan, o jẹ ipenija pupọ lati ṣii tabi yọkuro Layer oke lati ṣe ayẹwo igbekalẹ dada ti Layer epithelial.Fun apẹẹrẹ, nipa lilo microscope elekitironi kan (SEM).
Awọn hydrophobicity ti PDMS ti jẹ ipinnu ti o ni idiwọn ni awọn ẹkọ-ẹkọ ti o da lori microfluidic ti o niiṣe pẹlu awọn ohun elo kekere hydrophobic, niwon PDMS le ṣe aiṣedeede adsorb iru awọn ohun elo hydrophobic. Awọn iyipada si PDMS le ṣe ayẹwo pẹlu awọn ohun elo polymeric miiran. ṣe akiyesi lati dinku adsorption ti awọn ohun elo hydrophobic.
Nikẹhin, ọna wa ko ti ni ijuwe daradara ni awọn ofin ti pese ibojuwo-giga-giga tabi "ọkan-iwọn-fits-all" olumulo ore-aṣeyẹwo Syeed. Ilana ti o wa lọwọlọwọ nilo fifa syringe fun microdevice, eyi ti o gba aaye ni incubator CO2 ati idilọwọ awọn adanwo-nla. Eleyi aropin le ti wa ni significantly dara si nipasẹ awọn scalability, scalability 6-kika-daradara 6 (fun apẹẹrẹ, scalability-9) tabi 384-daradara la kọja awọn ifibọ ti o gba lemọlemọfún replenishment ati yiyọ ti basolateral media).
Lati jeki 3D morphogenesis ti eda eniyan ifun epithelium ni fitiro, a lo microfluidic chirún oporoku ẹrọ ti o ni awọn meji ni afiwe microchannels ati awọn ẹya rirọ la kọja awo laarin lati ṣẹda a lumen-capillary ni wiwo.We tun afihan awọn lilo ti a nikan-ikanni microfluidic ẹrọ (a arabara chirún) ti o pese lemọlemọfún basolarized Layer ti epitheli awọn ifibọ.Ninu awọn iru ẹrọ mejeeji, morphogenesis ti awọn oriṣiriṣi awọn sẹẹli epithelial intestinal eniyan ni a le ṣe afihan nipa lilo ifọwọyi itọnisọna ti ṣiṣan lati yọ awọn antagonists morphogen kuro ni ibi-itọju basolateral. Gbogbo ilana idanwo (Nọmba 1) ni awọn ẹya marun: (i) microfabrication ti gut chip tabi Transwell insertable hybrid), (1-5) apoti 1-pip (steps antagonists) awọn sẹẹli epithelial (awọn sẹẹli Caco-2) tabi awọn ẹya ara eniyan oporoku; apoti 2-5), (iii) asa ti awọn ẹyin epithelial oporoku lori awọn eerun ifun tabi awọn eerun arabara (awọn igbesẹ 6-9), (iv) ifakalẹ ti 3D morphogenesis in vitro (igbesẹ 10) ati (v) ) lati ṣe apejuwe 3D epithelial microstructure (awọn igbesẹ 11-24 ti o yẹ) ti a ṣe apẹrẹ ti o ni ilọsiwaju ti o yẹ ni isalẹ). ti morphogenesis in vitro nipa fifiwera morphogenesis epithelial si aaye, akoko, ipo, tabi awọn iṣakoso ilana.
A lo awọn iru ẹrọ aṣa meji ti o yatọ: gut-on-a-chip pẹlu awọn ikanni ti o taara tabi awọn ikanni convoluted ti kii ṣe deede, tabi awọn eerun arabara ti o ni awọn ifibọ Transwell (TW) ninu ẹrọ microfluidic kan, ti a ṣe gẹgẹ bi a ti ṣalaye ninu Apoti 1, ati igbesẹ 1 -5. (Caco-2 tabi awọn ohun alumọni oporoku eniyan) ati ilana aṣa ti a lo ninu ilana yii. ”In vitro morphogenesis” fihan awọn igbesẹ gbogbogbo eyiti Caco-2 tabi awọn sẹẹli epithelial ti o ni organoid ti gbin lori chirún oporoku tabi lori awọn ifibọ Transwell ti chibrid arabara, atẹle nipa ifakalẹ ti morphogenesis 3D ati nọmba igbekalẹ ti eto igbekalẹ ni isalẹ ti eto igbekalẹ kọọkan. arrow.Ohun elo naa n pese awọn apẹẹrẹ ti bi a ṣe le lo awọn Layer epithelial intestinal ti a ti fi idi mulẹ, fun apẹẹrẹ, ni iyatọ iyatọ ti awọn sẹẹli, awọn ẹkọ ẹkọ fisioloji gut, idasile awọn ilolupo eda abemi-ogun-microbiome, ati awọn awoṣe aisan.Immunofluorescence images in "Cell Differentiation" ti o nfihan awọn ekuro, F-actin ati MUC2 ti a ṣe afihan ni awọn epitheal Layer-2DC. ifihan agbara wa ninu awọn sẹẹli goblet ati mucus ti a fi pamọ lati awọn ipele mucosal. Awọn aworan fluorescent ni Gut Physiology fihan mucus ti a ṣe nipasẹ abawọn fun sialic acid ati N-acetylglucosamine ti o wa ni lilo lilo fluorescent alikama germ agglutinin. Awọn aworan ti o ni agbekọja meji ni "Olugbalejo-Microbe Co-Cultures" fihan aṣoju-gut gut gut panel kan ti o wa ni apa osi. àjọ-asa ti E. coli ti n ṣalaye amuaradagba Fuluorisenti alawọ ewe (GFP) pẹlu microengineered 3D Caco-2 epithelial cell.Apakan ọtun fihan isọdibilẹ ti GFP E. coli co-cultured with 3D Caco-2 epithelial cell, atẹle nipa imunofluorescence idoti pẹlu F-actin (pupa) ati nustrates gusut inflammatory influenza bulu. awọn eerun labẹ ipenija ti ẹkọ-ara pẹlu awọn antigens kokoro-arun (fun apẹẹrẹ, lipopolysaccharide, LPS) ati awọn sẹẹli ajẹsara (fun apẹẹrẹ, PBMC; alawọ ewe) . Caco-2 ẹyin ti gbin lati fi idi Layer epithelial 3D kan. Opa iwọn, 50 µm. Awọn aworan ni ila isalẹ: "Iyatọ ti awọn sẹẹli" 2 ti a ṣe atunṣe pẹlu igbanilaaye lati itọkasi. Oxford University Press; Atunse pelu igbanilaaye Ref.5. NAS; "Olugbalejo-Microbe Co-Culture" fara pẹlu aiye lati ref.3. NAS; "Modeling Arun" fara pẹlu aiye lati itọkasi.5. NAS.
Mejeeji gut-on-chip ati awọn eerun arabara ni a ṣe pẹlu lilo awọn ẹda PDMS ti a fi silẹ lati awọn apẹrẹ silikoni nipasẹ lithography rirọ1,44 ati apẹrẹ pẹlu SU-8.Apẹrẹ ti awọn microchannels ni chirún kọọkan ni a pinnu nipasẹ ṣiṣe akiyesi hydrodynamics bii wahala irẹwẹsi ati titẹ agbara hydrodynamic1,4,12.The atilẹba gut-on-a-chip design . juxtaposed parallel straight microchannels, ti wa sinu kan eka gut-on-a-chip (Extended Data Fig. 1b) ti o ba pẹlu kan bata ti te microchannels lati jeki Alekun omi ibugbe akoko, ti kii-ilaini sisan ilana, ati multiaxial abuku ti gbin ẹyin (Fig. 2a-f) 12. Nigba ti diẹ complexed gut-gut biomeon 12. le ti wa ni yàn.A ti afihan pe awọn convoluted Gut-Chip tun strongly induces 3D morphogenesis ni a iru akoko fireemu pẹlu kan iru ìyí ti epithelial idagbasoke akawe si awọn atilẹba Gut-Chip, laiwo ti awọn gbin cell type.Nitorina, lati jeki 3D morphogenesis, linear ati eka on-chip gut awọn aṣa ti wa ni interchangeable on-chip gut awọn aṣa ti wa ni interchangeable m PD8 awọn ẹya ara ẹrọ ti a ti pese sile lori awọn ẹya ara ẹrọ silikoni SUPPLIMS. demolding (Fig. 2a) .Lati ṣe ifun inu lori chirún kan, Layer PDMS ti o ti pese silẹ ni atẹlera si fiimu PDMS ti o ni la kọja ati lẹhinna ni ibamu pẹlu Layer PDMS isalẹ nipasẹ isunmọ ti ko ni iyipada nipa lilo olutọpa corona (Fig. 2b – f) .Lati ṣe awọn eerun arabara arabara, awọn ẹda PDMS ti o ni arowoto ni a ti sopọ si awọn ẹrọ ifaworanhan kan ti o le ṣẹda kan si awọn ẹrọ ifaworanhan microchannel kan. Awọn ifibọ Transwell (Fig. 2h ati Extended Data Figure 2) . Ilana ifarapọ ni a ṣe nipasẹ ṣiṣe itọju awọn ipele ti PDMS ajọra ati gilasi pẹlu pilasima atẹgun tabi itọju corona. Lẹhin sterilization ti ẹrọ microfabricated ti a so mọ tube silikoni, iṣeto ẹrọ ti ṣetan lati ṣe 3D morphogenesis ti epithelium oporoku).
a, Sikematiki apejuwe ti awọn igbaradi ti PDMS awọn ẹya ara lati SU-8 patterned silikoni molds.The uncured PDMS ojutu ti a dà pẹlẹpẹlẹ a silikoni m (osi), si bojuto ni 60 °C (arin) ati demolded (ọtun) .The demolded PDMS ti a ge si awọn ege ati ki o mọtoto fun siwaju lilo.b, Aworan ti awọn silikoni moldMS lo lati mura silikoni moldMS ti a lo lati mura silikoni molds. awọn PDMS porous membrane.d, A jara ti awọn aworan ti awọn oke ati isalẹ PDMS irinše ati awọn ti apejo on-chip oporoku ẹrọ.e, Sikematiki ti awọn titete ti awọn oke, awo, ati isalẹ PDMS irinše. Kọọkan Layer ti wa ni irreversibly iwe adehun nipa pilasima tabi corona itoju.f, Sikematiki ti awọn ti a se gut-on-on-tease microchannel supervacuum. chambers.g, Iṣeto ti gut-on-a-chip fun aṣa sẹẹli microfluidic.Ifun ti a ṣe lori chirún kan ti a pejọ pẹlu tube silikoni ati syringe ti a gbe sori ibori. chips.Transwell awọn ifibọ ti a pese sile ni ominira si aṣa 2D monolayers ti awọn sẹẹli epithelial intestinal ti a fi sii sinu chirún arabara lati fa morphogenesis 3D oporoku.Iwọn alabọde ti wa ni perfused nipasẹ microchannels nisalẹ awọn cell Layer ti iṣeto lori Transwell ifibọ.Scale bar, 1 cm.h Tuntun pẹlu igbanilaaye lati itọkasi.4. Elsevier.
Ninu ilana yii, laini sẹẹli Caco-2 ati awọn ẹya ara inu ifun ni a lo bi awọn orisun epithelial (Fig 3a) . Mejeeji awọn iru sẹẹli ni a gbin ni ominira (Apoti 2 ati Apoti 5) ati pe a lo lati ṣe irugbin awọn microchannels ti a bo ECM ti inu-chip gut tabi awọn ifibọ Transwell.Nigbati awọn sẹẹli ba wa ni confluent (> sk95% Cabet ni awọn sẹẹli filasi 95% ), awọn sẹẹli ti o niiṣe deede (> sk 95% Cabetly flaners). 10 ati 50) ni T-flasks ti wa ni ikore lati ṣeto awọn ifasilẹ sẹẹli ti a ti ya sọtọ nipasẹ ito ti trypsinization (apoti 2) . Awọn ẹya ara eniyan ti o wa ni inu-ara lati inu awọn biopsies intestinal tabi awọn atunṣe abẹ-abẹ ni a gbin ni Matrigel scaffold domes ni 24-daradara awọn awopọ lati ṣe atilẹyin fun awọn microenvironment ti o wa ni ipilẹ, awọn ohun elo ti o ni awọn microenvironmentoge. R-spondin, ati Noggin) ati awọn ifosiwewe idagbasoke ti a pese silẹ gẹgẹbi a ti ṣe apejuwe rẹ ni Apoti 3 ni a ṣe afikun ni gbogbo ọjọ miiran titi ti awọn organoids yoo dagba si ~ 500 µm ni iwọn ila opin. arun, akàn colorectal, tabi oluranlọwọ deede), aaye ọgbẹ (fun apẹẹrẹ, ọgbẹ lodi si agbegbe ti ko ni ipalara) ati ipo ikun ati inu iṣan (fun apẹẹrẹ, duodenum, jejunum, ileum, cecum, colon, or rectum) .A pese ilana iṣapeye ni Apoti 5 fun dida awọn ohun alumọni colonic (coloids) ti o nilo awọn ifọkansi ti o ga julọ ju awọn ohun-ara kekere.
a, Ṣiṣẹ iṣẹ-ṣiṣe fun ifisi ti gut morphogenesis ninu ikun ikun.Caco-2 epithelium intestinal intestinal human and intestinal organoids ti wa ni lilo ninu ilana yii lati ṣe afihan morphogenesis 3D. Awọn sẹẹli epithelial ti o ya sọtọ ni a ti gbin ni ipese gut-on-a-chip device (pipe igbaradi) MS ti a ti gbin (awọn sẹẹli ti a fi oju-ara) ti a ti gbin (seeded day) ti a ti gbin (awọn sẹẹli ti a fi oju-ara) ti a fi silẹ lori PD. 0 (D0), ṣiṣan apical (AP) ti bẹrẹ ati muduro fun awọn ọjọ 2 akọkọ (sisan, AP, D0-D2) .Basolateral (BL) ṣiṣan tun bẹrẹ pẹlu awọn iṣipopada gigun kẹkẹ cyclic (na, sisan, AP ati BL) nigbati 2D monolayer pipe ti wa ni akoso.Intestinal 3D morphogenesis ti awọn ọjọ spontaneous ti o waye lẹhin awọn ọjọ spontane spontane. D5) .Awọn aworan itansan alakoso ṣe afihan iṣan-ara aṣoju ti awọn sẹẹli Caco-2 ni igbesẹ idanwo kọọkan tabi aaye akoko (igi igi, 100 µm) . Awọn aworan apẹrẹ mẹrin ti o ṣe afihan awọn cascades ti o baamu ti gut morphogenesis (oke apa ọtun). ti n ṣe afihan agbegbe ti o ga julọ (apoti funfun funfun) fihan microvilli ti a ṣe atunṣe lori 3D Caco-2 Layer (ọtun) .c, Iwo iwaju iwaju ti Caco-2 3D ti iṣeto, claudin (ZO-1, pupa) ati awọn awọ-aala ti o ni ilọsiwaju ti a fi aami si F-actin (alawọ ewe) ati awọn ekuro (bulu) ti ajẹsara ti awọn sẹẹli ti o ni idaniloju lori awọn sẹẹli ti o ni idaniloju lori awọn ohun elo ti o ni idaabobo ti iṣan-ara. chips.Arrows ntokasi si awọn arin sikematiki tọkasi awọn ipo ti awọn focal ofurufu fun kọọkan confocal view.d, Akoko akoko ti morphological ayipada ninu organoids gbin lori kan ni ërún gba nipa alakoso itansan microscopy on ọjọ 3, 7, 9, 11, ati 13. Awọn inset (oke ọtun) fihan awọn ga magnification ti awọn pese image.e ti 3 DIC Fọto ti a ti pese sile. Bibẹ ti o ya ni ọjọ 7.f, Awọn aworan imunofluorescence ti a fi bolẹ ti o nfihan awọn ami fun awọn sẹẹli yio (LGR5; magenta), awọn sẹẹli goblet (MUC2; alawọ ewe), F-actin (grẹy) ati awọn ekuro (cyan) ti o dagba lori awọn eerun ikun fun awọn ọjọ 3, lẹsẹsẹ (Osi) ati 13-ọjọ (aarin) awọn ohun-ara ti o wa ninu awọn ohun elo LGR ti o tun ṣe afihan Layer 5. ifihan agbara laisi ifihan agbara MUC2. Awọn aworan Fluorescence ti o nfihan microstructure epithelial (ọtun) ti 3D organoid epithelium ti iṣeto ni ikun lori chirún kan nipa didimu awọ pilasima pẹlu CellMask dye (ọtun) ni ọjọ 13 ti aṣa.Iwọn ilawọn jẹ 50 μm ayafi ti bibẹkọ ti sọ.b Tun ṣe atunṣe pẹlu igbanilaaye lati itọkasi.2. Oxford University Press; c Ti a mu pelu igbanilaaye lati Itọkasi.2. Oxford University Press; e and f adapted with ašẹ nipa itọkasi.12 Labẹ Creative Commons License CC BY 4.0.
Ninu ifun lori chirún, o jẹ dandan lati ṣe atunṣe oju omi hydrophobic ti PDMS porous membrane fun aṣeyọri ECM ti o ni ilọsiwaju.Ninu ilana yii, a lo awọn ọna oriṣiriṣi meji lati ṣe atunṣe hydrophobicity ti awọn membran PDMS.Fun culturing Caco-2 cell, iṣiṣẹ dada nipasẹ UV/ozone itọju nikan ni o to lati dinku hydrophobicity ti awọn sẹẹli ECM, ati pe o le so awọn sẹẹli CPD-CM ti o pọju lati dinku awọn ipele ti CPD-CM. PDMS membrane.Sibẹsibẹ, aṣa microfluidic ti epithelium organoid nilo iṣelọpọ orisun-kemikali lati ṣaṣeyọri ifisilẹ daradara ti awọn ọlọjẹ ECM nipasẹ titẹle polyethyleneimine (PEI) ati glutaraldehyde si awọn microchannels PDMS.Lẹhin iyipada oju-aye, awọn ọlọjẹ ECM ti wa ni ifipamọ lati bo oju-iwe ti iṣẹ-ṣiṣe ati pe a gbejade PDo ti o wa ni oju-iwe ti PDo. awọn sẹẹli ti wa ni asopọ, aṣa sẹẹli microfluidic bẹrẹ nipasẹ perfusing nikan ni alabọde sinu microchannel oke titi awọn sẹẹli yoo fi ṣe monolayer pipe, lakoko ti microchannel isalẹ n ṣetọju awọn ipo aimi.Ọna iṣapeye yii fun imuṣiṣẹ dada ati ideri ECM jẹ ki asomọ ti epithelium organoid lati fa morphogenesis 3D lori oju PDMS.
Awọn aṣa transwell tun nilo ibora ECM ṣaaju ki irugbin sẹẹli; sibẹsibẹ, awọn aṣa Transwell ko nilo awọn igbesẹ pretreatment eka lati mu dada ti awọn ifibọ la kọja ṣiṣẹ.Fun dagba awọn sẹẹli Caco-2 lori awọn ifibọ Transwell, ti a bo ECM lori awọn ifibọ la kọja accelerates awọn asomọ ti dissociated Caco-2 ẹyin (<1 wakati) ati junction idena idena Ibiyi (<1-2 ọjọ) .Lati asa organoids on Transwell-fi sii awọn ẹya ara ẹrọ ti wa ni so sinu ECM, ti wa ni so pọ lori awọn ẹya ara ti a fi sii ECM. dada awo ilu (<3 h) ati muduro titi ti awọn organoids ṣe agbekalẹ monolayer pipe pẹlu iduroṣinṣin idena .Awọn aṣa Transwell ni a ṣe ni awọn apẹrẹ 24-daradara laisi lilo awọn eerun arabara.
In vitro 3D morphogenesis ni a le bẹrẹ nipasẹ fifi ṣiṣan omi si abala basolateral ti Layer epithelial ti a ti iṣeto.Ninu ikun lori chirún kan, morphogenesis epithelial bẹrẹ nigbati alabọde naa ti perfused sinu awọn microchannels oke ati isalẹ (Fig. 3a) .Gẹgẹbi a ti ṣalaye tẹlẹ, o ṣe pataki lati ṣafihan ṣiṣan ṣiṣan omi ni isalẹ (basolateral yiyọ kuro) morphoge ti aṣiri. pese awọn ounjẹ ti o to ati omi ara si awọn sẹẹli ti a dè lori awọn membran la kọja ati ṣe ina aapọn rirẹ luminal, a maa n lo ṣiṣan meji ninu ikun lori chirún kan.Ninu awọn eerun arabara, awọn ifibọ Transwell ti o ni awọn monolayers epithelial ti a fi sii sinu awọn chibrid arabara.Lẹhinna, a ti lo alabọde labẹ ẹgbẹ basolateral ti fi sii Transwell la kọja ti a fi sii nipasẹ microchannel 3. sisan ni mejeji asa awọn iru ẹrọ.
Awọn ẹya ara ẹrọ morphological ti microengineered 3D epithelial layers le ṣe atupale nipasẹ lilo awọn ọna oriṣiriṣi aworan, pẹlu microscopy itansan alakoso, iyatọ kikọlu iyatọ (DIC) microscopy, SEM, tabi immunofluorescence confocal microscopy (Awọn nọmba 3 ati 4) .Itọsọna alakoso tabi aworan DIC le ṣe ni irọrun ti o ṣe ni irọrun ni akoko 3 ti aṣa ni akoko 3 ati pe o le ṣe ni irọrun ti aṣa ni akoko 3. Layers.Nitori si akoyawo opitika ti PDMS ati awọn fiimu polyester, mejeeji gut-on-a-chip ati awọn iru ẹrọ chibrid arabara le pese akoko gidi ni ibi-itumọ aaye laisi iwulo fun apakan tabi disassembly ti ẹrọ naa.Nigbati o ba n ṣe aworan imunofluorescence (Awọn nọmba 1, 3c, f ati 4b, wt / c) parapo ti o wa titi, awọn sẹẹli 4. (PFA), atẹle nipa Triton X-100 ati 2% (wt / vol) ) bovine serum albumin (BSA), ni ibere.Ti o da lori iru sẹẹli, awọn atunṣe oriṣiriṣi, awọn permeabilizers, ati awọn aṣoju idinamọ le ṣee lo. (fun apẹẹrẹ, 4′,6-diamidino-2-phenylene) indole, DAPI) tabi F-actin (fun apẹẹrẹ, fluorescently labeled phalloidin) .Fluorescence-orisun ifiwe aworan le tun ti wa ni ošišẹ ti ni ibi lati ri mucus gbóògì (Fig. 1, "Cell iyato" ati "Gut physiology"), ID Hoste cell (Figures colonization of microbiology). àjọ-asa"), igbanisiṣẹ ti awọn sẹẹli ajẹsara (Fig. 1, 'Modeling Arun') tabi awọn apẹrẹ ti 3D epithelial morphology (Fig. 3c, f ati 4b, c) . Nigbati o ba n ṣe atunṣe ikun lori chirún lati ya awọn ipele ti oke lati isalẹ microchannel Layer, gẹgẹbi a ti ṣe apejuwe rẹ ni ref.As2, epitheli morphology daradara ti microchannel 3. lori aala fẹlẹ apical le jẹ ojulowo nipasẹ SEM (Fig. 3b) .Ikosile ti awọn ami iyasọtọ le ṣe ayẹwo nipasẹ ṣiṣe pipo PCR5 tabi sẹẹli RNA kan-ẹyọkan.Ninu ọran yii, awọn ipele 3D ti awọn sẹẹli epithelial ti o dagba ninu awọn eerun ikun tabi awọn eerun arabara ti wa ni ikore nipasẹ trypsinization ati lẹhinna lo fun iṣiro tabi jiini.
a, Ṣiṣan iṣẹ fun ifisi ti morphogenesis intestinal ni chibrid arabara.Caco-2 ati intestinal organoids ti wa ni lilo ninu ilana yii lati ṣe afihan morphogenesis 3D ni apẹrẹ chibrid. gbin labẹ awọn ipo aimi (asale TW) .Lẹhin awọn ọjọ 7, ifibọ Transwell kan ti o ni monolayer 2D ti awọn sẹẹli epithelial ti a ṣepọ sinu chirún arabara lati ṣafihan ṣiṣan basolateral (Flow, BL), eyiti o yorisi iran ti 3D epithelial Layer (morphogenesis) .Awọn ipele itansan awọn micrographs ipele ti o nfihan awọn ẹya morphological ti awọn sẹẹli donor 3 deede ti awọn sẹẹli epitheli1 epitheli0. colon ni kọọkan esiperimenta igbese tabi akoko ojuami.The schematics ni awọn ipele ti oke sapejuwe awọn esiperimenta iṣeto ni fun kọọkan step.b, arabara awọn eerun (osi sikematiki) le ja si 3D morphogenesis ti organoid epithelial ẹyin pẹlu oke-isalẹ confocal microscopy wiwo ti o ya ni orisirisi awọn ipo Z (oke, arin, ati isalẹ; wo ọtun dotted ila ati bamu). ṣe afihan awọn abuda ẹya ara ẹni ti o han gbangba.F-actin (cyan), nucleus (grẹy).c, Fluorescence confocal micrographs (3D angled view) ti awọn sẹẹli epithelial ti o jẹ ti organoid ti a gbin ni aimi Transwell (TW; inset within white dashed box) versus hybrid chip (tobi full shot) comparing 3D morphology versus 2D versus. awọn iwo-agbelebu (ti a fi sii ni igun apa ọtun oke; “XZ”) tun fihan awọn ẹya 2D ati 3D. Pẹpẹ iwọn, 100 µm.c Ti a tun tẹ pẹlu igbanilaaye lati itọkasi.4. Elsevier.
Awọn iṣakoso ni a le pese sile nipasẹ dida awọn sẹẹli kanna (Caco-2 tabi awọn sẹẹli epithelial organoid intestinal) sinu awọn monolayers onisẹpo meji labẹ awọn ipo aṣa aimi ti aṣa. Paapaa, idinku ounjẹ le ja si nitori iwọn iwọn didun to lopin ti awọn microchannels (ie ~ 4 µL ni ikanni oke lori atilẹba gut-chip design , ati ipilẹṣẹ ti ipilẹṣẹ gut-chip ti ita). sisan le tun ti wa ni akawe.
Ilana lithography rirọ yẹ ki o ṣee ṣe ni yara ti o mọ.Fun Layer kọọkan lori chirún (awọn ipele oke ati isalẹ ati awọn membran) ati awọn eerun arabara, awọn oriṣiriṣi photomasks ni a lo ati ti a ṣe lori awọn wafer silikoni lọtọ nitori awọn giga ti microchannels yatọ.Awọn ibi ibi-afẹde ti awọn microchannels oke ati isalẹ ti ikun lori chirún jẹ 500 µm ti ibi-afẹde ati 500 µm ti ibi-afẹde. Chip arabara jẹ 200 µm.
Fi 3-inch silikoni wafer sinu satelaiti pẹlu acetone. rọra yi awo naa fun awọn aaya 30, lẹhinna afẹfẹ gbẹ wafer.Gbigbe lọ si awo kan pẹlu IPA, lẹhinna yi awo naa fun 30 s lati nu.
Ojutu piranha kan (adapọ ti hydrogen peroxide ati sulfuric acid ogidi, 1: 3 (vol/vol)) le ṣee lo ni yiyan lati mu yiyọkuro awọn iṣẹku Organic pọ si lati dada wafer silikoni.
Ojutu Piranha jẹ ipalara pupọ ati pe o nmu ooru ṣiṣẹ.Awọn iṣọra ailewu afikun jẹ pataki.Fun isọnu egbin, jẹ ki ojutu naa tutu ati ki o gbe lọ si mimọ, egbin egbin gbigbẹ.Lo awọn apoti keji ati fi aami si awọn apoti egbin daradara.Jọwọ tẹle awọn itọnisọna ailewu ti ohun elo fun awọn ilana alaye diẹ sii.
Dehydrate awọn wafers nipa gbigbe wọn si ori 200 °C ti o gbona fun awọn iṣẹju 10. Lẹhin gbigbẹ, a ti mì wafer ni igba marun ni afẹfẹ lati dara.
Tú ~ 10 g ti photoresist SU-8 2100 si aarin ti wafer silikoni ti a ti mọtoto.Lo awọn tweezers lati tan photoresist ni deede lori wafer.Lẹẹkọọkan gbe wafer lori 65 ° C ti o gbona awo lati jẹ ki photoresist kere si alalepo ati ki o rọrun lati tan.Ma ṣe gbe wafer taara lori awo ti o gbona.
SU-8 ni a pin ni deede lori wafer nipasẹ ṣiṣiṣẹsẹhin iyipo. Giga µm fun ipele oke ti ikun lori chirún; wo “Awọn igbesẹ pataki” ni isalẹ) ṣeto ni isare ti 300 rpm/s 30 aaya ni 1,200 rpm.
Iyara alayipo akọkọ le ṣe atunṣe ni ibamu si sisanra ibi-afẹde ti ilana SU-8 lori wafer ohun alumọni.
Lati ṣe awọn ilana SU-8 ti giga 500 µm fun ipele oke ti ikun lori chirún, ideri iyipo ati awọn igbesẹ beki rirọ ti Apoti yii (awọn igbesẹ 7 ati 8) ni a tun ṣe ni atẹlera (wo igbesẹ 9) lati gbe awọn fẹlẹfẹlẹ meji ti 250 µm Layer ti o nipọn ti SU-8, eyiti o le ṣe Layer ati darapọ mọ nipasẹ UV 05 ni ipele kan ga.
Rirọ beki awọn wafers ti a bo SU-8 nipa gbigbe awọn wafers ni pẹkipẹki sori awo gbigbona ni 65 °C fun iṣẹju 5, lẹhinna yipada eto si 95 °C ati incubate fun iṣẹju 40 afikun.
Lati ṣaṣeyọri giga 500 μm ti ilana SU-8 ni microchannel oke, tun ṣe awọn igbesẹ 7 ati 8 lati ṣe ina awọn ipele SU-8 nipọn 250 μm meji.
Lilo UV Mask Aligner, ṣe idanwo atupa ni ibamu si awọn itọnisọna olupese lati ṣe iṣiro akoko ifihan ti wafer.(akoko ifihan, ms) = (iwọn ifihan, mJ/cm2) / (agbara atupa, mW/cm2).
Lẹhin ti npinnu akoko ifihan, gbe fotomask sori ohun elo iboju-boju ti aligner boju-boju UV ki o gbe iboju fọto sori wafer ti a bo SU-8.
Gbe oju ti a tẹjade ti iboju fọto taara si ẹgbẹ SU-8 ti a bo ti wafer ohun alumọni lati dinku pipinka UV.
Fi SU-8 wafer ti a bo ati iboju fọto ni inaro si 260 mJ/cm2 ti ina UV fun akoko ifihan ti a ti pinnu tẹlẹ (wo igbesẹ 10 ti apoti yii).
Lẹhin ifihan UV, SU-8-coated silicon wafers ti wa ni ndin ni 65 ° C fun 5 min ati 95 ° C fun 15 min lori awopọ gbigbona kọọkan lati ṣe awọn ilana pẹlu giga ti 200 μm. Fa akoko lẹhin-beke ni 95 °C si 30 min lati ṣe awọn apẹrẹ pẹlu giga ti 500 µm.
Awọn Olùgbéejáde ti wa ni dà sinu gilasi kan satelaiti, ati awọn ti o yan wafer ti wa ni gbe sinu awọn satelaiti.The iwọn didun ti SU-8 Olùgbéejáde le yato da lori awọn iwọn ti awọn gilasi plate.Make sure to use to SU-8 developer to complete remove unexposed SU-8.Fun apẹẹrẹ, nigba lilo a 150 mm diamita gilasi satelaiti pẹlu kan 1 L agbara, lo ~ 300 mL ti SU-8 mL ti nmulẹmu fun awọn iṣẹju ro deve .
Fi omi ṣan mimu ti o ni idagbasoke pẹlu ~ 10 milimita ti olupilẹṣẹ tuntun ti o tẹle nipasẹ IPA nipa sisọ ojutu naa nipa lilo pipette kan.
Fi wafer sinu ẹrọ mimọ pilasima ati fi han si pilasima atẹgun (gaasi oju aye, titẹ ibi-afẹde 1 × 10-5 Torr, agbara 125 W) fun awọn iṣẹju 1.5.
Fi wafer sinu ẹrọ apanirun igbale pẹlu ifaworanhan gilasi inu.Wafers ati awọn ifaworanhan le wa ni ẹgbẹ ni ẹgbẹ.Ti a ba pin desiccator vacuum si awọn ipele pupọ nipasẹ awo kan, gbe awọn ifaworanhan ni iyẹwu isalẹ ati awọn wafers ni iyẹwu oke.Drop 100 μL ti trichloro (1H, 1Hroo)Hrooctane kan ojutu sillioctane ati ojutu silli2H. igbale fun silanization.
Tú vial kan ti awọn sẹẹli Caco-2 tio tutunini ni iwẹ omi 37°C, lẹhinna gbe awọn sẹẹli yo si ọpọn T75 ti o ni 15 milimita ti 37°C prewarmed Caco-2 alabọde.
Lati kọja awọn sẹẹli Caco-2 ni ~ 90% confluency, akọkọ gbona Caco-2 alabọde, PBS, ati 0.25% trypsin/1 mM EDTA ni iwẹ omi 37°C.
Aspirate awọn alabọde nipa igbale aspiration.Wẹ ẹyin lemeji pẹlu 5 milimita ti gbona PBS nipa tun igbale aspiration ati fifi titun PBS.