O ṣeun fun lilo si Nature.com.O nlo ẹya ẹrọ aṣawakiri kan pẹlu atilẹyin CSS lopin.Fun iriri ti o dara julọ, a ṣeduro pe ki o lo ẹrọ aṣawakiri imudojuiwọn kan (tabi mu Ipo Ibamu ṣiṣẹ ni Internet Explorer).Ni afikun, lati rii daju atilẹyin ti nlọ lọwọ, a fihan aaye naa laisi awọn aza ati JavaScript.
Ṣe afihan carousel ti awọn kikọja mẹta ni ẹẹkan.Lo awọn Bọtini Iṣaaju ati Next lati gbe nipasẹ awọn ifaworanhan mẹta ni akoko kan, tabi lo awọn bọtini ifaworanhan ni ipari lati gbe nipasẹ awọn ifaworanhan mẹta ni akoko kan.
Idena ọpọlọ-ẹjẹ ati idena-ọpọlọ ẹjẹ ṣe idiwọ awọn aṣoju biotherapeutic lati de ibi-afẹde wọn ni eto aifọkanbalẹ aarin, nitorinaa ṣe idiwọ itọju to munadoko ti awọn arun iṣan.Lati ṣe iwari aramada ọpọlọ awọn gbigbe ni vivo, a ṣe agbekalẹ ile-ikawe peptide T7 phage kan ati ẹjẹ ti a gba ni tẹlentẹle ati omi cerebrospinal (CSF) ni lilo awoṣe adagun adagun nla mimọ ti awọn eku.Awọn ere ibeji phage kan pato ni imudara ga ni CSF lẹhin awọn iyipo mẹrin ti yiyan.Idanwo awọn peptides oludije kọọkan ṣe afihan diẹ sii ju imudara-pupọ 1000 ni CSF.Bioactivity ti ifijiṣẹ mediated peptide si ọpọlọ ni a jẹrisi nipasẹ idinku 40% ni ipele amyloid-β ninu omi cerebrospinal nipa lilo inhibitor peptide BACE1 ti o sopọ mọ peptide transit aramada ti a mọ.Awọn abajade wọnyi daba pe awọn peptides ti a mọ nipasẹ awọn ọna yiyan vivo phage le jẹ awọn ọkọ ti o wulo fun ifijiṣẹ eto ti awọn macromolecules si ọpọlọ pẹlu ipa itọju ailera.
Eto aifọkanbalẹ aifọwọyi (CNS) iwadii itọju ailera ti dojukọ pupọ lori idamo awọn oogun ti o dara julọ ati awọn aṣoju ti o ṣafihan awọn ohun-ini ìfọkànsí CNS, pẹlu ipa ti o dinku lori wiwa awọn ọna ṣiṣe ti o mu ifijiṣẹ oogun lọwọ si ọpọlọ.Eyi n bẹrẹ lati yipada ni bayi bi ifijiṣẹ oogun, paapaa awọn ohun elo nla, jẹ apakan pataki ti idagbasoke oogun neuroscience ode oni.Ayika ti eto aifọkanbalẹ aarin ni aabo daradara nipasẹ eto idena cerebrovascular, ti o wa ninu idena ọpọlọ-ẹjẹ (BBB) ​​ati idena ọpọlọ-ẹjẹ (BCBB) 1, ti o jẹ ki o nira lati fi awọn oogun ranṣẹ si ọpọlọ1,2.A ṣe iṣiro pe o fẹrẹ to gbogbo awọn oogun moleku nla ati diẹ sii ju 98% ti awọn oogun moleku kekere ni a yọkuro kuro ninu ọpọlọ3.Ti o ni idi ti o ṣe pataki pupọ lati ṣe idanimọ awọn ọna gbigbe ọpọlọ tuntun ti o pese daradara ati ifijiṣẹ pato ti awọn oogun oogun si CNS 4,5.Bibẹẹkọ, BBB ati BCSFB tun ṣafihan aye ti o dara julọ fun ifijiṣẹ oogun bi wọn ṣe wọ inu ati wọ gbogbo awọn ẹya ti ọpọlọ nipasẹ iṣọn-ara nla rẹ.Nitorinaa, awọn akitiyan lọwọlọwọ lati lo awọn ọna ti kii ṣe apaniyan ti ifijiṣẹ si ọpọlọ jẹ ipilẹ pupọ lori ilana ti gbigbe gbigbe olugba (PMT) nipa lilo olugba BBB6 endogenous.Pelu awọn ilọsiwaju bọtini aipẹ ni lilo ọna ọna olugba gbigbe gbigbe7,8, ilọsiwaju siwaju ti awọn eto ifijiṣẹ tuntun pẹlu awọn ohun-ini ti o dara si nilo.Ni ipari yii, ibi-afẹde wa ni lati ṣe idanimọ awọn peptides ti o lagbara lati ṣe ilaja gbigbe CSF, bi wọn ṣe le lo ni ipilẹ lati fi awọn macromolecules ranṣẹ si CNS tabi lati ṣii awọn ipa ọna olugba tuntun.Ni pataki, awọn olugba kan pato ati awọn gbigbe ti eto cerebrovascular (BBB ati BSCFB) le ṣe iranṣẹ bi awọn ibi-afẹde ti o pọju fun iṣiṣẹ ati ifijiṣẹ pato ti awọn oogun biotherapeutic.Omi cerebrospinal (CSF) jẹ ọja aṣiri ti choroid plexus (CS) ati pe o wa ni olubasọrọ taara pẹlu ito interstitial ti ọpọlọ nipasẹ aaye subarachnoid ati ventricular space4.Laipẹ o ti fihan pe omi-omi cerebrospinal subarachnoid n tan kaakiri pupọ sinu interstitium ti ọpọlọ9.A nireti lati wọle si aaye parenchymal nipa lilo ọna ṣiṣanwọle subarachnoid yii tabi taara nipasẹ BBB.Lati ṣaṣeyọri eyi, a ṣe imuse ilana yiyan ti o lagbara ni vivo phage ti o ṣe idanimọ pipe ti awọn peptides ti o gbe nipasẹ ọkan ninu awọn ipa ọna ọtọtọ meji wọnyi.
Ni bayi a ṣapejuwe ọna ṣiṣe iboju vivo phage lẹsẹsẹ ni vivo phage pẹlu iṣapẹẹrẹ CSF papọ pẹlu ilana igbejade giga (HTS) lati ṣe atẹle awọn iyipo yiyan akọkọ pẹlu oniruuru ile-ikawe giga julọ.Ṣiṣayẹwo ni a ṣe lori awọn eku ti o ni imọran pẹlu kannula nla kan ti a gbin (CM) patapata lati yago fun ibajẹ ẹjẹ.Ni pataki, ọna yii yan ifọkansi ọpọlọ mejeeji ati awọn peptides pẹlu iṣẹ gbigbe kọja idena cerebrovascular.A lo awọn phages T7 nitori iwọn kekere wọn (~ 60 nm) 10 ati daba pe wọn dara fun gbigbe ti awọn vesicles ti o jẹ ki o kọja transcellular ti endothelial ati / tabi epithelial-medulla idena.Lẹhin awọn iyipo mẹrin ti panning, awọn olugbe phage ti ya sọtọ ti n ṣafihan lagbara ni imudara CSF vivo ati ẹgbẹ microvessel cerebral.Ni pataki, a ni anfani lati jẹrisi awọn awari wa nipa fifihan pe awọn peptides oludije ti o fẹ julọ ati iṣelọpọ kemikali ni anfani lati gbe ẹru amuaradagba sinu omi cerebrospinal.Ni akọkọ, awọn ipa elegbogi ti CNS ni a ti fi idi mulẹ nipasẹ apapọ peptide irekọja asiwaju pẹlu oludena kan ti peptide BACE1.Ni afikun si iṣafihan pe ni awọn ilana iboju iṣẹ ṣiṣe vivo le ṣe idanimọ awọn peptides gbigbe gbigbe ọpọlọ aramada bi awọn gbigbe ẹru amuaradagba ti o munadoko, a nireti awọn isunmọ yiyan iṣẹ ṣiṣe ti o jọra lati tun di pataki ni idamo awọn ipa ọna gbigbe ọpọlọ aramada.
Da lori awọn ẹya ti o ṣẹda okuta iranti (PFU), lẹhin igbesẹ iṣakojọpọ phage, ile-ikawe kan ti lainidi 12-mer linear T7 phage peptides pẹlu oniruuru ti isunmọ 109 jẹ apẹrẹ ati ṣẹda (wo Awọn ohun elo ati Awọn ọna).O ṣe pataki lati ṣe akiyesi pe a farabalẹ ṣe atupale ile-ikawe yii ṣaaju ni vivo panning.PCR amúṣantóbi ti phage ìkàwé awọn ayẹwo lilo títúnṣe alakoko ti ipilẹṣẹ amplicons ti o wà taara wulo HTS (Afikun Ọpọtọ. 1a).Nitori a) HTS11 aṣiṣe lesese, b) ikolu lori awọn didara ti alakoko (NNK) 1-12, ati c) niwaju egan-iru (wt) phage (skeleton awọn ifibọ) ni imurasilẹ ìkàwé, a ọkọọkan sisẹ ilana ti a muse lati jade nikan wadi alaye lesese (Afikun Fig. 1b).Awọn igbesẹ àlẹmọ wọnyi kan si gbogbo awọn ile-ikawe ilana ilana HTS.Fun ile-ikawe boṣewa, apapọ awọn kika 233,868 ni a gba, eyiti 39% kọja awọn ibeere àlẹmọ ati pe a lo fun itupalẹ ile-ikawe ati yiyan fun awọn iyipo ti o tẹle (Eya Afikun 1c–e).Awọn kika naa jẹ ọpọlọpọ pupọ julọ ti awọn orisii ipilẹ 3 ni gigun pẹlu tente oke kan ni awọn nucleotides 36 (Afikun Fig. 1c), ifẹsẹmulẹ apẹrẹ ile-ikawe (NNK) 1-12.Ni pataki, isunmọ 11% ti awọn ọmọ ẹgbẹ ile-ikawe ni iru-ẹgan onisẹpo 12 (wt) ẹhin PAGISRELVDKL fi sii, ati pe o fẹrẹ to idaji awọn ilana (49%) ni awọn ifibọ tabi awọn piparẹ ninu.HTS ti ile-ikawe ile-ikawe jẹrisi iyatọ giga ti awọn peptides ninu ile-ikawe: diẹ sii ju 81% ti awọn ilana peptide ni a rii ni ẹẹkan ati pe 1.5% nikan waye ni awọn ẹda ≥4 (Afikun Fig. 2a).Awọn igbohunsafẹfẹ ti amino acids (aa) ni gbogbo awọn ipo 12 ti o wa ni atunṣe ti o ni ibamu daradara pẹlu awọn iwọn ti a reti fun nọmba awọn codons ti a ṣe nipasẹ atunṣe NKK degenerate (Fig. 2b).Igbohunsafẹfẹ ti a ṣe akiyesi ti awọn iṣẹku aa ti a fi koodu si nipasẹ awọn ifibọ wọnyi ni ibamu daradara pẹlu igbohunsafẹfẹ iṣiro (r = 0.893) (Eya afikun. 2c).Igbaradi ti awọn ile ikawe phage fun abẹrẹ pẹlu awọn igbesẹ ti imudara ati yiyọ ti endotoxin.Eyi ti han tẹlẹ lati dinku oniruuru ti awọn ile-ikawe phage12,13.Nitorinaa, a ṣe atẹle ile-ikawe phage awo-apo ti o ti ṣe yiyọkuro endotoxin ati ṣe afiwe rẹ pẹlu ile-ikawe atilẹba lati ṣe iṣiro igbohunsafẹfẹ ti AA.Ibaṣepọ to lagbara (r = 0.995) ni a ṣe akiyesi laarin adagun atilẹba ati adagun ti o pọ si ati mimọ (Afikun Fig. 2d), ti o nfihan pe idije laarin awọn ere ibeji ti o pọ si lori awọn awo ni lilo T7 phage ko fa irẹjẹ pataki.Ifiwewe yii da lori igbohunsafẹfẹ ti awọn idii tripeptide ni ile-ikawe kọọkan, nitori iyatọ ti awọn ile-ikawe (~ 109) ko le gba ni kikun paapaa pẹlu HTS.Ayẹwo igbohunsafẹfẹ ti aa ni ipo kọọkan ṣe afihan irẹjẹ ti o gbẹkẹle ipo kekere ni awọn ipo mẹta ti o kẹhin ti iwe-akọọlẹ ti a tẹ sii (Afikun 2e).Ni ipari, a pari pe didara ati iyatọ ti ile-ikawe jẹ itẹwọgba ati pe awọn ayipada kekere nikan ni oniruuru ni a ṣe akiyesi nitori imudara ati igbaradi ti awọn ile-ikawe phage laarin ọpọlọpọ awọn iyipo yiyan.
Iṣayẹwo omi-ara cerebrospinal ni tẹlentẹle le ṣee ṣe nipasẹ iṣẹ-abẹ gbigbin cannula kan sinu CM ti awọn eku mimọ lati dẹrọ idanimọ ti T7 phage ti a fi abẹrẹ inu iṣọn-ara (iv) nipasẹ BBB ati / tabi BCSFB (Fig. 1a-b).A lo awọn apa yiyan ominira meji (apa A ati B) ni awọn iyipo mẹta akọkọ ti yiyan vivo (Fig. 1c).A di diẹdiẹ pọ si stringency ti yiyan nipa idinku lapapọ iye ti phage ti a ṣe ni awọn iyipo mẹta akọkọ ti yiyan.Fun iyipo kẹrin ti panning, a dapọ awọn ayẹwo lati awọn ẹka A ati B ati ṣe awọn yiyan ominira mẹta afikun.Lati ṣe iwadi awọn ohun-ini in vivo ti awọn patikulu T7 phage ni awoṣe yii, iru phage-igi (PAGISRELVDKL titunto si ifibọ) ni abẹrẹ sinu awọn eku nipasẹ iṣọn iru.Imularada ti awọn phages lati inu omi cerebrospinal ati ẹjẹ ni awọn aaye akoko ti o yatọ fihan pe awọn iwọn kekere T7 icosahedral phages ni ipele imukuro ni iyara ni iyara lati inu apakan ẹjẹ (Afikun Fig. 3).Da lori awọn titers ti a ṣakoso ati iwọn ẹjẹ ti awọn eku, a ṣe iṣiro pe nikan ni iwọn 1% wt.phage lati iwọn lilo ti a nṣakoso ni a rii ninu ẹjẹ ni iṣẹju mẹwa 10 lẹhin abẹrẹ inu iṣan.Lẹhin idinku iyara akọkọ yii, imukuro akọkọ ti o lọra ni a wọn pẹlu idaji-aye ti awọn iṣẹju 27.7.Ni pataki, awọn phages pupọ diẹ ni a gba pada lati inu iyẹwu CSF, ti o nfihan ipilẹ kekere fun iṣilọ phage-iru egan sinu apakan CSF (Afikun Fig. 3).Ni apapọ, nikan nipa 1 x 10-3% titers ti T7 phage ninu ẹjẹ ati 4 x 10-8% ti awọn phages ti a fi sinu ibẹrẹ ni a rii ni omi cerebrospinal lori gbogbo akoko iṣapẹẹrẹ (0-250 min).Ni pataki, idaji-aye (25.7 min) ti iru phage ni omi cerebrospinal jẹ iru eyiti a ṣe akiyesi ninu ẹjẹ.Awọn data wọnyi ṣe afihan pe idena ti o yapa apakan CSF kuro ninu ẹjẹ jẹ mimule ni awọn eku ti a fi sinu CM, gbigba ni vivo yiyan ti awọn ile-ikawe phage lati ṣe idanimọ awọn ere ibeji ti o gbe ni imurasilẹ lati inu ẹjẹ sinu yara CSF.
(a) Ṣiṣeto ọna kan fun tun-ṣapẹẹrẹ omi iṣan cerebrospinal (CSF) lati adagun nla kan.(b) Aworan ti o nfihan ipo cellular ti eto aifọkanbalẹ aarin (CNS) idena ati ilana yiyan ti a lo lati ṣe idanimọ awọn peptides ti o kọja idena-ọpọlọ ẹjẹ (BBB) ​​ati idena ọpọlọ-ẹjẹ.(c) Ni vivo phage àpapọ sisan ṣiṣan.Ninu yiyan kọọkan, awọn phages (awọn oludamọ ẹranko inu awọn itọka) ni abẹrẹ inu iṣọn-ẹjẹ.Awọn ẹka omiiran ominira meji (A, B) ti wa ni ipamọ lọtọ titi di iyipo kẹrin ti yiyan.Fun yiyan awọn iyipo 3 ati 4, ẹda oniye phage kọọkan ti a fa jade lati CSF ni a ti ṣe lẹsẹsẹ pẹlu ọwọ.(d) Kinetics ti phage ti o ya sọtọ lati ẹjẹ (awọn iyika pupa) ati omi cerebrospinal (awọn igun alawọ ewe alawọ ewe) lakoko iyipo akọkọ ti yiyan ni awọn eku cannulated meji lẹhin abẹrẹ inu iṣan ti ile-ikawe T7 peptide (2 x 1012 phages/eranko).Awọn onigun buluu tọkasi apapọ ifọkansi ibẹrẹ ti phage ninu ẹjẹ, iṣiro lati iye ti phage itasi, ni akiyesi iwọn didun ẹjẹ lapapọ.Awọn onigun mẹrin dudu tọkasi aaye ikorita ti laini y ti a yọkuro lati awọn ifọkansi phage ẹjẹ.(e,f) Ṣe afihan igbohunsafẹfẹ ojulumo ati pinpin gbogbo awọn ilana agbekọja tripeptide ti o ṣeeṣe ti a rii ninu peptide.Nọmba awọn idii ti a rii ni awọn iwe kika 1000 ti han.Ni pataki (p <0.001) awọn ero imudara ti wa ni samisi pẹlu awọn aami pupa.(e) Sikakiri ibamu ti o ṣe afiwe igbohunsafẹfẹ ibatan ti ero-itumọ tripeptide ti ile-ikawe abẹrẹ pẹlu phage ti o ni ẹjẹ lati awọn ẹranko # 1.1 ati # 1.2.(f) Itọpa ti o ni ibamu ti o ṣe afiwe awọn igbohunsafẹfẹ ibatan ti awọn ohun elo phage tripeptide eranko # 1.1 ati # 1.2 ti o ya sọtọ ninu ẹjẹ ati iṣan cerebrospinal.(g, h) Aṣoju ID ọkọọkan ti phage ti o ni idarasi ninu ẹjẹ (g) dipo awọn ile ikawe itasi ati phage ti o ni ilọsiwaju ni CSF (h) dipo ẹjẹ lẹhin yiyan ti vivo ninu awọn ẹranko mejeeji.Iwọn koodu lẹta kan tọkasi iye igba ti amino acid waye ni ipo yẹn.Alawọ ewe = pola, eleyi ti = didoju, bulu = ipilẹ, pupa = ekikan ati dudu = hydrophobic amino acids.Nọmba 1a, b jẹ apẹrẹ ati ṣe nipasẹ Eduard Urich.
A itasi ile ikawe phage peptide sinu awọn eku ohun elo CM meji (awọn clades A ati B) ati phage ti o ya sọtọ lati inu omi cerebrospinal ati ẹjẹ (Aworan 1d).Kiliaransi iyara akọkọ ti ile-ikawe ko dinku ni akawe si phage-iru igbẹ.Itumọ idaji-aye ti ile-ikawe itasi ni awọn ẹranko mejeeji jẹ iṣẹju 24.8 ninu ẹjẹ, ti o jọra si phage-iru egan, ati awọn iṣẹju 38.5 ni CSF.Ẹjẹ ati cerebrospinal ito phage awọn ayẹwo lati eranko kọọkan ni a tẹriba si HTS ati gbogbo awọn peptides ti a mọ ni a ṣe atupale fun wiwa kukuru kukuru tripeptide.Awọn idii Tripeptide ni a yan nitori pe wọn pese ipilẹ ti o kere julọ fun iṣeto igbekalẹ ati awọn ibaraẹnisọrọ peptide-amuaradagba14,15.A ri ibamu ti o dara ni pinpin awọn idii laarin ile-ikawe phage injected ati awọn ere ibeji ti a fa jade lati inu ẹjẹ ti awọn ẹranko mejeeji (Fig. 1e).Awọn data tọkasi wipe awọn tiwqn ti awọn ìkàwé ti wa ni nikan iwonba idarato ninu ẹjẹ kompaktimenti.Awọn igbohunsafẹfẹ Amino acid ati awọn ilana ifọkanbalẹ ni a ṣe atupale siwaju ni ipo kọọkan nipa lilo aṣamubadọgba ti sọfitiwia Weblogo16.O yanilenu, a ri imudara to lagbara ninu awọn iṣẹku glycine ẹjẹ (Fig. 1g).Nigbati a ba ṣe afiwe ẹjẹ pẹlu awọn ere ibeji ti a yan lati CSF, yiyan ti o lagbara ati diẹ ninu yiyan ti awọn motifs ni a ṣe akiyesi (Fig. 1f), ati awọn amino acid kan wa ni pataki ni awọn ipo ti a ti pinnu tẹlẹ ni ọmọ ẹgbẹ 12 (Fig. 1h).Ni pataki, awọn ẹranko kọọkan yatọ si pataki ni omi cerebrospinal, lakoko ti a ṣe akiyesi imudara glycine ẹjẹ ni awọn ẹranko mejeeji (Afikun 4a-j).Lẹhin ti stringent sisẹ ti data ọkọọkan ninu awọn cerebrospinal ito ti eranko # 1.1 ati # 1.2, lapapọ 964 ati 420 oto 12-mer peptides gba (Ifikun eeya. 1d-e).Awọn ere ibeji phage ti o ya sọtọ ni a pọ si ati tẹriba si iyipo keji ti yiyan in vivo.Phage ti a fa jade lati iyipo keji ti yiyan ni a tẹriba si HTS ni ẹranko kọọkan ati gbogbo awọn peptides ti a mọ ni a lo bi titẹ sii si eto idanimọ motif lati ṣe itupalẹ iṣẹlẹ ti awọn ohun elo tripeptide (Fig. 2a, b, ef).Ti a ṣe afiwe si ọmọ akọkọ ti phage ti a gba pada lati CSF, a ṣe akiyesi yiyan siwaju ati yiyan ti ọpọlọpọ awọn motifs ni CSF ni awọn ẹka A ati B (Fig. 2).Alugoridimu idanimọ nẹtiwọọki kan ni a lo lati pinnu boya wọn ṣe aṣoju awọn ilana oriṣiriṣi ti ọkọọkan deede.A ṣe akiyesi ibajọra ti o han gbangba laarin awọn ilana onisẹpo 12 ti a gba pada nipasẹ CSF ni yiyan clade A (Fig. 2c, d) ati clade B (Fig. 2g, h).Itupalẹ ti a ṣajọpọ ni ẹka kọọkan ṣe afihan awọn profaili yiyan ti o yatọ fun awọn peptides 12-mer (Afikun 5c, d) ati ilosoke ninu ipin tita CSF / ẹjẹ ni akoko pupọ fun awọn ere ibeji ti a ti ṣajọpọ lẹhin iyipo keji ti yiyan ni akawe si iyipo akọkọ ti yiyan (Afikun Fig. 5e).).
Idara ti awọn idii ati awọn peptides ninu ito cerebrospinal nipasẹ awọn iyipo itẹlera meji ti aṣayan ifihan phage iṣẹ ṣiṣe in vivo.
Gbogbo cerebrospinal ito phages gba pada lati akọkọ yika ti kọọkan eranko (eranko # 1.1 ati # 1.2) ti a pooled, amplified, HT-sequenced ati reinjected papo (2 x 1010 phages/eranko) 2 SM cannulated eku (# 1.1 → #).2.1 ati 2.2, 1.2 → 2.3 ati 2.4).(a,b,e,f) Awọn itọka ti o ni ibamu ti o ṣe afiwe igbohunsafẹfẹ ibatan ti awọn idii tripeptide ti gbogbo awọn phages ti o jẹ ti CSF ni awọn iyipo yiyan akọkọ ati keji.Igbohunsafẹfẹ ibatan ati pinpin awọn idii ti o nsoju gbogbo awọn tripeptides agbekọja ti o ṣeeṣe ti a rii ni awọn peptides ni awọn iṣalaye mejeeji.Nọmba awọn idii ti a rii ni awọn iwe kika 1000 ti han.Awọn ero ti o ṣe pataki (p <0.001) ti a yan tabi yọkuro ninu ọkan ninu awọn ile ikawe ti a fiwera jẹ afihan pẹlu awọn aami pupa.(c, d, g, h) Aṣoju aami-tẹle ti gbogbo CSF-ọlọrọ 12 amino acid awọn ilana gigun ti o da lori awọn iyipo 2 ati 1 ti yiyan vivo.Iwọn koodu lẹta kan tọkasi iye igba ti amino acid waye ni ipo yẹn.Lati ṣe aṣoju aami naa, igbohunsafẹfẹ ti awọn ilana CSF ti a fa jade lati inu awọn ẹranko kọọkan laarin awọn iyipo yiyan meji ni a ṣe afiwe ati awọn ilana imudara ni iyipo keji ni a fihan: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 ati (h) #1.2–#2.4.Awọn amino acids ti o ni ilọsiwaju julọ ni ipo ti a fun ni (c, d) eranko rara.2.1 ati rara.2.2 tabi (g, h) ninu eranko No.2.3 ati rara.2.4 ti han ni awọ.Alawọ ewe = pola, eleyi ti = didoju, bulu = ipilẹ, pupa = ekikan ati dudu = hydrophobic amino acids.
Lẹhin ti awọn kẹta yika ti yiyan, a mọ 124 oto peptide lesese (# 3.1 ati # 3.2) lati 332 CSF-reconstituted phage clones ya sọtọ lati meji eranko (Afikun Fig. 6a).Ọkọọkan LGSVS (18.7%) ni ipin ibatan ti o ga julọ, atẹle nipa awọn ifibọ iru egan PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), ati SARGSWREIVSLS (2.2%).Ni ipari kẹrin kẹrin, a ṣajọpọ awọn ẹka meji ti a yan ni ominira lati awọn ẹranko lọtọ mẹta (Fig. 1c).Ninu 925 awọn ere ibeji phage ti o tẹle ti a gba pada lati CSF, ni iyipo kẹrin a rii awọn ilana peptide alailẹgbẹ 64 (Afikun 6b), laarin eyiti ipin ibatan ti iru phage egan lọ silẹ si 0.8%.Awọn ere ibeji CSF ti o wọpọ julọ ni iyipo kẹrin ni LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) ati RLSSVDS DLSGC%) (3,%)).Iwọn gigun ti awọn peptides ti a ti yan jẹ nitori awọn ifibọ nucleotide / awọn piparẹ tabi awọn codons iduro ti tọjọ ni awọn alakoko ile-ikawe nigba lilo awọn codons degenerate fun apẹrẹ ile-ikawe NNK.Awọn codons iduro ti tọjọ ṣe ina awọn peptides kuru ati pe wọn yan nitori wọn ni agbaso aa ti o dara.Awọn peptides gigun le ja lati awọn ifibọ/awọn piparẹ ninu awọn alakoko ti awọn ile-ikawe sintetiki.Eyi gbe codon iduro ti a ṣe apẹrẹ si ita fireemu ati ka titi codon iduro tuntun yoo han ni isalẹ.Ni gbogbogbo, a ṣe iṣiro awọn ifosiwewe imudara fun gbogbo awọn iyipo yiyan mẹrin nipa ifiwera data igbewọle pẹlu data igbejade ayẹwo.Fun iyipo akọkọ ti ibojuwo, a lo awọn titers phage-iru egan bi itọkasi abẹlẹ ti kii ṣe pato.O yanilenu, yiyan phage odi lagbara pupọ ni ọmọ CSF akọkọ, ṣugbọn kii ṣe ninu ẹjẹ (Fig. 3a), eyiti o le jẹ nitori iṣeeṣe kekere ti itankale palolo ti ọpọlọpọ awọn ọmọ ẹgbẹ ti ile-ikawe peptide sinu iyẹwu CSF tabi awọn phages ibatan ṣọ lati ni idaduro daradara tabi yọkuro lati inu ẹjẹ ju awọn bacteriophages.Bibẹẹkọ, ni iyipo keji ti panning, yiyan ti o lagbara ti awọn phages ni CSF ni a ṣe akiyesi ni awọn clades mejeeji, ni iyanju pe iyipo iṣaaju ti ni idarato ni awọn phages ti n ṣafihan awọn peptides ti o ṣe agbega gbigba CSF (Fig. 3a).Lẹẹkansi, laisi imudara ẹjẹ pataki.Paapaa ni awọn iyipo kẹta ati kẹrin, awọn ere ibeji phage ni imudara ni pataki ni CSF.Ifiwera awọn ojulumo igbohunsafẹfẹ ti kọọkan oto peptide ọkọọkan laarin awọn ti o kẹhin meji iyipo ti yiyan, a ri pe awọn ọkọọkan wà ani diẹ idarato ni kẹrin yika ti yiyan (olusin 3b).Apapọ 931 awọn idii tripeptide ni a yọ jade lati gbogbo awọn ilana peptide alailẹgbẹ 64 ni lilo awọn iṣalaye peptide mejeeji.Awọn ohun elo imudara julọ julọ ni iyipo kẹrin ni a ṣe ayẹwo ni pẹkipẹki fun awọn profaili imudara wọn ni gbogbo awọn iyipo ni akawe si ile-ikawe itasi (ge-pipa: 10% imudara) (Afikun Fig. 6c).Awọn ilana gbogbogbo ti yiyan fihan pe pupọ julọ awọn idi ti a ṣe iwadi ni idarato ni gbogbo awọn iyipo iṣaaju ti awọn ẹka yiyan mejeeji.Bibẹẹkọ, diẹ ninu awọn idii (fun apẹẹrẹ SGL, VSG, LGS GSV) jẹ pataki julọ lati iboji A, nigba ti awọn miiran (fun apẹẹrẹ FGW, RTN, WGF, NTR) ni imudara ni yiyan clade B.
Ifọwọsi ti gbigbe CSF ti awọn peptides ti o ṣe afihan phage ti CSF ati awọn peptides adari biotinylated ti a so pọ si awọn ẹru isanwo streptavidin.
(a) Awọn ipin imudara ti a ṣe iṣiro ni gbogbo awọn iyipo mẹrin (R1-R4) ti o da lori abẹrẹ (input = I) phage (PFU) titers ati ipinnu CSF phage titers (jade = O).Awọn ifosiwewe imudara fun awọn iyipo mẹta ti o kẹhin (R2-R4) ni iṣiro nipasẹ lafiwe pẹlu iyipo iṣaaju ati iyipo akọkọ (R1) pẹlu data iwuwo.Awọn ifi ṣiṣi jẹ ito cerebrospinal, awọn ọpa iboji jẹ pilasima.(*** p<0.001, da lori t-idanwo Ọmọ ile-iwe).(b) Atokọ ti awọn peptides phage lọpọlọpọ, ni ipo ni ibamu si iwọn ibatan wọn si gbogbo awọn ipele ti a gba ni CSF lẹhin iyipo 4 ti yiyan.Awọn ere ibeji phage mẹfa ti o wọpọ julọ jẹ afihan ni awọ, nọmba ati awọn ifosiwewe imudara wọn laarin awọn iyipo 3 ati 4 ti yiyan (awọn ifibọ).(c,d) Awọn ere ibeji phage mẹfa ti o ni imudara julọ, phage ofo ati awọn ile-ikawe peptide ti obi lati yika 4 ni a ṣe atupale ni ẹyọkan ni awoṣe iṣapẹẹrẹ CSF kan.CSF ati awọn ayẹwo ẹjẹ ni a gba ni awọn aaye akoko itọkasi.(c) Dogba oye ti 6 oludije phage ere ibeji (2 x 1010 phages/eranko), sofo phages (#1779) (2 x 1010 phages/eranko) ati iṣura phage peptide ikawe (2 x 1012 phages / eranko) Abẹrẹ ni o kere 3 CM ti wa ni a nṣakoso awọn ẹranko le lọtọ.Awọn ile elegbogi CSF ti ẹda oniye phage kọọkan ati ile ikawe peptide phage lori akoko ti han.(d) ṣe afihan apapọ CSF/ẹjẹ ipin fun gbogbo awọn phages/mL ti a gba pada ni akoko iṣapẹẹrẹ.(e) Awọn peptides olori sintetiki mẹrin ati iṣakoso scrambled kan ni a ti sopọ pẹlu biotin si streptavidin nipasẹ N-terminus wọn (ifihan tetramer) atẹle nipa abẹrẹ (iru iṣọn iv, 10 mg streptavidin/kg).O kere ju awọn eku ti a fi sinu inu (N = 3).).Awọn ayẹwo CSF ​​ni a gba ni awọn aaye akoko itọkasi ati awọn ifọkansi streptavidin jẹ iwọn nipasẹ CSF anti-streptavidin ELISA (nd = ko rii).(* p <0.05, ** p <0.01, *** p<0.001, da lori idanwo ANOVA).(f) Afiwera ti awọn amino acid ọkọọkan ti awọn julọ idarato phage peptide oniye #2002 (eleyi ti) pẹlu miiran ti a ti yan phage peptide clones lati awọn 4th yika ti yiyan.Awọn ajẹkù amino acid ti o jọra ati ti o jọra jẹ aami-awọ.
Ninu gbogbo awọn phages ti o ni ilọsiwaju ni iyipo kẹrin (Fig. 3b), awọn ere ibeji mẹfa ti o jẹ oludije ni a yan fun itupalẹ ẹni kọọkan siwaju ni awoṣe iṣapẹẹrẹ CSF.Awọn iye deede ti phage oludije mẹfa, phage ofo (ko si ifibọ) ati awọn ile-ikawe peptide prophage ni a ti fi sinu awọn ẹranko CM mẹta ti o lepa, ati pe a ti pinnu awọn oogun elegbogi ni CSF (Fig. 3c) ati ẹjẹ (Afikun 7).Gbogbo awọn ere ibeji phage ni idanwo ifọkansi apakan CSF ni ipele 10-1000 ti o ga ju ti phage iṣakoso ofo (#1779).Fun apẹẹrẹ, awọn ere ibeji #2020 ati #2077 ni nipa awọn akoko 1000 ti o ga julọ CSF ju phage iṣakoso lọ.Profaili pharmacokinetic ti peptide kọọkan ti a yan yatọ, ṣugbọn gbogbo wọn ni agbara homing CSF giga kan.A ṣe akiyesi idinku igbagbogbo lori akoko fun awọn ere ibeji #1903 ati #2011, lakoko ti awọn ere ibeji #2077, #2002 ati #2009 ilosoke lakoko iṣẹju mẹwa 10 akọkọ le tọka si gbigbe ti nṣiṣe lọwọ ṣugbọn o nilo lati rii daju.Awọn ere ibeji #2020, #2002, ati #2077 duro ni awọn ipele giga, lakoko ti ifọkansi CSF ti oniye #2009 dinku laiyara lẹhin ilosoke akọkọ.Lẹhinna a ṣe afiwe igbohunsafẹfẹ ibatan ti oludije CSF kọọkan pẹlu ifọkansi ẹjẹ rẹ (Fig. 3d).Ibaṣepọ ti iwọn ilawọn ti oludije CSF kọọkan pẹlu titer ẹjẹ rẹ ni gbogbo awọn akoko iṣapẹẹrẹ fihan pe mẹta ninu awọn oludije mẹfa ti ni idarato ni pataki ninu CSF ẹjẹ.O yanilenu, oniye #2077 ṣe afihan iduroṣinṣin ẹjẹ ti o ga julọ (Eya Apejuwe 7).Lati jẹrisi pe awọn peptides funrara wọn ni agbara lati gbe ẹru gbigbe miiran ju awọn patikulu phage sinu iyẹwu CSF, a ṣepọ awọn peptides olori mẹrin ti o ni itọsẹ pẹlu biotin ni N-terminus nibiti awọn peptides so mọ patiku phage.Awọn peptides Biotinylated (Nọs. 2002, 2009, 2020 ati 2077) ni a so pọ pẹlu streptavidin (SA) lati gba awọn fọọmu multimeric ni itumo ti o fara wé geometry phage.Ọna kika yii tun gba wa laaye lati wiwọn ifihan SA ninu ẹjẹ ati iṣan cerebrospinal bi awọn peptides amuaradagba gbigbe-ẹru.Ni pataki, data phage le tun tun ṣe nigbagbogbo nigbati awọn peptides sintetiki ti wa ni abojuto ni ọna kika SA-conjugated (Fig. 3e).Awọn peptides scrambled ni ifihan ibẹrẹ kere si ati imukuro CSF ​​yiyara pẹlu awọn ipele ti a ko rii laarin awọn wakati 48.Lati ni oye si awọn ipa ọna ifijiṣẹ ti awọn ibeji peptide phage wọnyi sinu aaye CSF, a ṣe atupale isọdibilẹ ti awọn ikọlu peptide phage kọọkan ni lilo imunohistochemistry (IHC) lati rii taara awọn patikulu phage ni wakati 1 lẹhin abẹrẹ inu iṣan ni vivo.Ni pataki, awọn ere ibeji #2002, #2077, ati #2009 ni a le rii nipasẹ abawọn to lagbara ni awọn iṣan ọpọlọ, lakoko ti a ko rii phage iṣakoso (#1779) ati oniye #2020 (Afikun Aworan 8).Eyi ni imọran pe awọn peptides wọnyi ṣe alabapin si ipa lori ọpọlọ ni pipe nipasẹ lila BBB.Atupalẹ alaye siwaju sii ni a nilo lati ṣe idanwo idawọle yii, nitori ipa ọna BSCFB tun le ni ipa.Nigbati o ba ṣe afiwe ọkọọkan amino acid ti ẹda oniye ti o dara julọ (#2002) pẹlu awọn peptides miiran ti a yan, a ṣe akiyesi pe diẹ ninu wọn ni awọn amugbooro amino acid ti o jọra, eyiti o le tọka si ọna gbigbe ti o jọra (Fig. 3f).
Nitori profaili pilasima alailẹgbẹ rẹ ati ilosoke pataki ni CSF ni akoko pupọ, ẹda oniye ifihan phage #2077 ni a ṣawari siwaju sii lori akoko 48-wakati to gun ati pe o ni anfani lati ṣe ẹda ilosoke iyara ni CSF ti a ṣe akiyesi ni ajọṣepọ pẹlu awọn ipele SA ti o duro (Fig. 4a).Nipa awọn ere ibeji phage miiran ti a mọ, #2077 ni abariwon lagbara fun awọn opolo ọpọlọ ati ṣe afihan ifọkanbalẹ pataki pẹlu lectin asami capillary nigba wiwo ni ipinnu giga ati o ṣee ṣe diẹ ninu abawọn ni aaye parenchymal (Nọmba 4b).Lati ṣe iwadii boya awọn ipa elegbogi ti o ni agbedemeji peptide le gba ni CNS, a ṣe idanwo kan ninu eyiti awọn ẹya biotinylated ti i) peptide transit #2077 ati ii) peptide inhibitor BACE1 ni idapo pẹlu SA ni awọn ipin oriṣiriṣi meji.Fun apapo kan a lo nikan BACE1 peptide inhibitor ati fun ekeji a lo ipin 1:3 ti inhibitor peptide BACE1 si #2077 peptide.Awọn ayẹwo mejeeji ni a ṣakoso ni iṣọn-ẹjẹ ati ẹjẹ ati awọn ipele ito cerebrospinal ti beta-amyloid peptide 40 (Abeta40) ni a wọn ni akoko pupọ.A ṣe iwọn Abeta40 ni CSF bi o ṣe ṣe afihan idinamọ BACE1 ni parenchyma ọpọlọ.Gẹgẹbi a ti ṣe yẹ, awọn eka mejeeji dinku awọn ipele ẹjẹ ti Abeta40 ni pataki (Fig. 4c, d).Sibẹsibẹ, awọn ayẹwo nikan ti o ni adalu peptide No.2077 ati inhibitor ti BACE1 peptide conjugated si SA fa idinku nla ni Abeta40 ninu omi cerebrospinal (Fig. 4c).Awọn data fihan pe peptide No.2077 ni anfani lati gbe amuaradagba 60 kDa SA sinu CNS ati tun fa awọn ipa elegbogi pẹlu awọn inhibitors SA-conjugated ti peptide BACE1.
(a) Abẹrẹ Clonal (2 × 10 phages/eranko) ti T7 phage ti n ṣe afihan awọn profaili elegbogi igba pipẹ ti CSF peptide #2077 (RLSSVDSDLSGC) ati phage iṣakoso ti ko ni itọsi (#1779) ni o kere ju awọn eku inu CM mẹta.(b) Confocal airi aworan ti asoju cortical microvessels ni phage-injected eku (2 × 10 10 phages/eranko) fifi counterstaining ti peptide #2077 ati ohun èlò (lectin).Awọn ere ibeji phage wọnyi ni a ṣakoso si awọn eku 3 ati gba laaye lati kaakiri fun wakati 1 ṣaaju perfusion.Awọn ọpọlọ jẹ apakan ati abariwon pẹlu awọn aporo ti a fi aami si polyclonal FITC lodi si capsid T7 phage.Iṣẹju mẹwa ṣaaju iṣaju perfusion ati imuduro atẹle, DyLight594-aami lectin ni a ṣakoso ni iṣọn-ẹjẹ.Awọn aworan Fuluorisenti ti o nfihan idoti lectin (pupa) ti ẹgbẹ luminal ti awọn microvessels ati awọn phages (alawọ ewe) ninu lumen ti awọn capillaries ati iṣan ọpọlọ perivascular.Pẹpẹ iwọn ni ibamu si 10 µm.(c, d) Biotinylated BACE1 peptide inhibitory nikan tabi ni apapo pẹlu biotinylated transit peptide #2077 ti wa ni idapo pelu streptavidin ti o tẹle pẹlu abẹrẹ inu iṣan ti o kere ju awọn eku CM mẹta cannulated (10 mg streptavidin/kg).BACE1 peptide inhibitor-mediated idinku ninu Aβ40 jẹ iwọn nipasẹ Aβ1-40 ELISA ninu ẹjẹ (pupa) ati omi cerebrospinal (osan) ni awọn aaye akoko itọkasi.Fun alaye ti o dara julọ, laini aami kan ti ya lori aworan ni iwọn ti 100%.(c) Idinku ogorun ninu Aβ40 ninu ẹjẹ (awọn igun pupa pupa) ati omi cerebrospinal (osan triangles) ninu awọn eku ti a tọju pẹlu streptavidin conjugated si peptide transit #2077 ati peptide inhibitory BACE1 ni ipin 3: 1.(d) Idinku ida ọgọrun ninu ẹjẹ Aβ40 (awọn iyika pupa) ati omi cerebrospinal (awọn iyika osan) ti awọn eku ti a tọju pẹlu streptavidin papọ pẹlu peptide inhibitory BACE1 nikan.Idojukọ Aβ ninu iṣakoso jẹ 420 pg/ml (iyọkuro boṣewa = 101 pg/ml).
Ifihan ipele ti ni aṣeyọri ni aṣeyọri ni awọn agbegbe pupọ ti iwadii biomedical17.Ọna yii ni a ti lo fun ni vivo awọn ẹkọ oniruuru iṣan ti iṣan18,19 bakannaa awọn ẹkọ ti o fojusi awọn ohun elo cerebral20,21,22,23,24,25,26.Ninu iwadi yii, a fa ohun elo ti ọna yiyan yii kii ṣe si idanimọ taara ti awọn peptides ti o fojusi awọn ohun elo cerebral, ṣugbọn tun si wiwa awọn oludije pẹlu awọn ohun-ini gbigbe ti nṣiṣe lọwọ lati kọja idena-ọpọlọ ẹjẹ.Bayi a ṣe apejuwe idagbasoke ti ilana yiyan in vivo ni awọn eku intubated CM ati ṣafihan agbara rẹ lati ṣe idanimọ awọn peptides pẹlu awọn ohun-ini homing CSF.Lilo T7 phage ti o nfihan ile-ikawe ti awọn peptides ID 12-mer, a ni anfani lati ṣe afihan pe T7 phage jẹ kekere to (iwọn 60 nm ni iwọn ila opin) 10 lati ṣe deede si idena-ọpọlọ ẹjẹ, nitorina o kọja taara idena-ọpọlọ ẹjẹ tabi choroid plexus.A ṣe akiyesi pe ikore CSF lati awọn eku CM cannulated jẹ iṣakoso daradara ni ọna iboju iṣẹ ṣiṣe vivo, ati pe phage ti a fa jade kii ṣe asopọ nikan si vasculature ṣugbọn tun ṣiṣẹ bi olupona kọja idena-ọpọlọ ẹjẹ.Pẹlupẹlu, nipa gbigba ẹjẹ nigbakanna ati lilo HTS si CSF ati awọn phages ti o ni ẹjẹ, a jẹrisi pe yiyan ti CSF ko ni ipa nipasẹ imudara ẹjẹ tabi amọdaju fun imugboroosi laarin awọn iyipo yiyan.Sibẹsibẹ, apakan ẹjẹ jẹ apakan ti ilana yiyan, nitori awọn phages ti o lagbara lati de iyẹwu CSF gbọdọ wa laaye ati kaakiri ninu iṣan ẹjẹ ni gigun to lati jẹ ki ara wọn di ọlọrọ ni ọpọlọ.Lati le yọ alaye ti o gbẹkẹle jade lati inu data HTS aise, a ṣe imuse awọn asẹ ti o baamu si awọn aṣiṣe ilana ilana-pato ni ṣiṣan iṣẹ itupalẹ.Nipa iṣakojọpọ awọn igbelewọn kainetik sinu ọna iboju, a jẹrisi awọn ile elegbogi iyara ti iru-iru T7 phages (t½ ~ 28 min) ninu ẹjẹ24, 27, 28 ati tun pinnu idaji-aye wọn ni omi cerebrospinal (t½ ~ 26 min) fun iṣẹju kan).Pelu awọn profaili elegbogi ti o jọra ninu ẹjẹ ati CSF, nikan 0.001% ti ifọkansi ẹjẹ ti phage ni a le rii ni CSF, ti o nfihan iṣipopada abẹlẹ kekere ti phage-iru T7 egan kọja idena-ọpọlọ ẹjẹ.Iṣẹ yii ṣe afihan pataki ti yiyan akọkọ ti yiyan nigba lilo ninu awọn ilana panning vivo, pataki fun awọn eto phage ti o yọkuro ni iyara lati kaakiri, nitori awọn ere ibeji diẹ ni anfani lati de ibi CNS.Nitorinaa, ni yika akọkọ, idinku ninu oniruuru ile-ikawe tobi pupọ, nitori pe nọmba to lopin ti awọn ere ibeji ni a gba nikẹhin ni awoṣe CSF ti o muna pupọ yii.Eyi ni ilana panning vivo pẹlu ọpọlọpọ awọn igbesẹ yiyan gẹgẹbi ikojọpọ ti nṣiṣe lọwọ ninu iyẹwu CSF, iwalaaye oniye ninu yara ẹjẹ, ati yiyọkuro iyara ti awọn ere ibeji T7 phage lati inu ẹjẹ laarin awọn iṣẹju 10 akọkọ (Fig. 1d ati Apọju 4M).).Nitorinaa, lẹhin iyipo akọkọ, oriṣiriṣi awọn ere ibeji phage ni a mọ ni CSF, botilẹjẹpe adagun ibẹrẹ kanna ni a lo fun awọn ẹranko kọọkan.Eyi ni imọran pe awọn igbesẹ yiyan ti o muna pupọ fun awọn ile-ikawe orisun pẹlu awọn nọmba nla ti awọn ọmọ ẹgbẹ ile-ikawe ja si idinku pataki ninu oniruuru.Nitorinaa, awọn iṣẹlẹ laileto yoo di apakan pataki ti ilana yiyan akọkọ, ti o ni ipa pupọ si abajade.O ṣeese pe ọpọlọpọ awọn ere ibeji ni ile-ikawe atilẹba ni itara imudara CSF ti o jọra pupọ.Sibẹsibẹ, paapaa labẹ awọn ipo idanwo kanna, awọn abajade yiyan le yatọ nitori nọmba kekere ti ẹda oniye kọọkan ni adagun akọkọ.
Awọn idii ti o ni ilọsiwaju ni CSF yatọ si awọn ti o wa ninu ẹjẹ.O yanilenu, a ṣe akiyesi iyipada akọkọ si awọn peptides ọlọrọ glycine ninu ẹjẹ ti awọn ẹranko kọọkan.(Eya. 1g, Awọn aworan afikun. 4e, 4f).Phage ti o ni awọn peptides glycine le jẹ iduroṣinṣin diẹ sii ati pe o kere julọ lati mu jade kuro ni kaakiri.Sibẹsibẹ, awọn peptides ọlọrọ glycine ni a ko rii ni awọn ayẹwo omi cerebrospinal, ni iyanju pe awọn ile-ikawe ti a ti sọ di mimọ lọ nipasẹ awọn igbesẹ yiyan oriṣiriṣi meji: ọkan ninu ẹjẹ ati omiran ti a gba laaye lati ṣajọpọ ninu omi cerebrospinal.Awọn ere ibeji ti o ni ilọsiwaju CSF ti o waye lati iyipo kẹrin ti yiyan ti ni idanwo lọpọlọpọ.O fẹrẹ to gbogbo awọn ere ibeji ti o ni idanwo ni ẹyọkan ni a jẹrisi lati ni idarato ni CSF ni akawe si phage iṣakoso ofo.Ọkan peptide lu (#2077) ni a ṣe ayẹwo ni awọn alaye diẹ sii.O ṣe afihan igbesi aye idaji pilasima ti o gun ni akawe si awọn deba miiran (Figure 3d ati Nọmba Ipilẹṣẹ 7), ati ni iyanilenu, peptide yii ni iyoku cysteine ​​ninu C-terminus.Laipẹ o ti fihan pe afikun ti cysteine ​​​​si awọn peptides le mu awọn ohun-ini elegbogi wọn pọ si nipa dipọ si albumin 29.Eyi jẹ aimọ lọwọlọwọ fun peptide #2077 ati pe o nilo iwadi siwaju sii.Diẹ ninu awọn peptides ṣe afihan igbẹkẹle-igbẹkẹle ni imudara CSF (data ko han), eyiti o le ni ibatan si geometry dada ti o han ti capsid T7.Eto T7 ti a lo fihan awọn ẹda 5-15 ti peptide kọọkan fun patiku phage.A ṣe IHC lori awọn ere ibeji phage asiwaju oludije itasi ni iṣan sinu kotesi cerebral ti awọn eku (Afikun 8).Awọn data fihan wipe o kere mẹta ere ibeji (No.. 2002, No.. 2009 ati No.. 2077) interacted pẹlu BBB.O wa lati pinnu boya ibaraenisepo BBB yii ṣe abajade ni ikojọpọ ti CSF tabi iṣipopada ti awọn ere ibeji wọnyi taara si BCSFB.Ni pataki, a fihan pe awọn peptides ti a yan ni idaduro agbara gbigbe CSF wọn nigba ti a ṣepọ ati ti a so mọ ẹru amuaradagba.Asopọmọra ti awọn peptides biotinylated N-terminal si SA ni pataki tun awọn abajade ti a gba pẹlu awọn ere ibeji phage wọn ninu ẹjẹ ati omi-ara cerebrospinal (Fig. 3e).Lakotan, a fihan pe peptide asiwaju #2077 ni anfani lati ṣe igbelaruge iṣe ọpọlọ ti inhibitor peptide biotinylated ti BACE1 conjugated si SA, nfa awọn ipa elegbogi ti o sọ ni CNS nipasẹ idinku awọn ipele Abeta40 ni pataki ni CSF (Fig. 4).A ko ni anfani lati ṣe idanimọ eyikeyi awọn homologues ninu aaye data nipa ṣiṣe ṣiṣe iwadii homology lẹsẹsẹ peptide kan ti gbogbo awọn deba.O ṣe pataki lati ṣe akiyesi wipe awọn iwọn ti awọn T7 ìkàwé jẹ to 109, nigba ti o tumq si ìkàwé iwọn fun 12-mers 4 x 1015. Nitorina, a nikan ti a ti yan a kekere ida ti awọn oniruuru aaye ti 12-mer peptide ìkàwé, eyi ti o le tunmọ si wipe diẹ iṣapeye peptides le ti wa ni damo nipa iṣiro to buruju ti awọn aaye to wa nitosi.Ni airotẹlẹ, ọkan ninu awọn idi ti a ko rii eyikeyi awọn homologues adayeba ti awọn peptides wọnyi le jẹ aibikita lakoko itankalẹ lati ṣe idiwọ titẹsi ti ko ni iṣakoso ti awọn ero peptide kan sinu ọpọlọ.
Papọ, awọn abajade wa pese ipilẹ fun iṣẹ iwaju lati ṣe idanimọ ati ṣe afihan awọn ọna gbigbe ti idena cerebrovascular ni vivo ni awọn alaye diẹ sii.Eto ipilẹ ti ọna yii da lori ilana yiyan iṣẹ ṣiṣe ti kii ṣe idanimọ awọn ẹda nikan pẹlu awọn ohun-ini isunmọ iṣọn-ẹjẹ ọpọlọ, ṣugbọn tun pẹlu igbesẹ pataki kan ninu eyiti awọn ere ibeji aṣeyọri ni iṣẹ inu inu lati kọja awọn idena ti ibi ni vivo sinu apakan CNS.ni lati ṣalaye ẹrọ gbigbe ti awọn peptides wọnyi ati ààyò wọn fun sisopọ si microvasculature kan pato si agbegbe ọpọlọ.Eyi le ja si wiwa awọn ipa ọna tuntun fun gbigbe ti BBB ati awọn olugba.A nireti pe awọn peptides ti a mọ le sopọ taara si awọn olugba cerebrovascular tabi si awọn ligands kaakiri ti a gbe nipasẹ BBB tabi BCSFB.Awọn fekito peptide pẹlu iṣẹ gbigbe CSF ti a ṣe awari ni iṣẹ yii yoo ṣe iwadii siwaju.Lọwọlọwọ a n ṣe iwadii pato ọpọlọ ti awọn peptides wọnyi fun agbara wọn lati kọja BBB ati/tabi BCSFB.Awọn peptides tuntun wọnyi yoo jẹ awọn irinṣẹ ti o niyelori pupọ fun wiwa ti o pọju ti awọn olugba tuntun tabi awọn ipa ọna ati fun idagbasoke awọn iru ẹrọ tuntun ti o munadoko pupọ fun ifijiṣẹ ti awọn macromolecules, gẹgẹ bi awọn biologics, si ọpọlọ.
Cannulate kanga nla (CM) ni lilo iyipada ọna ti a ṣapejuwe tẹlẹ.Awọn eku Wistar ti a ti ni anesthetized (200-350 g) ni a gbe sori ohun elo stereotaxic ati lila agbedemeji kan ti a ṣe lori irun ti a ti fá ati ti a pese silẹ ni aseptically lati fi timole han.Lu awọn ihò meji ni agbegbe ti sash oke ati di awọn skru ti n ṣatunṣe sinu awọn ihò.Afikun iho ti gbẹ iho ni ita occipital crest fun itoni stereotactic ti cannula irin alagbara sinu CM.Waye simenti ehín ni ayika cannula ati ni aabo pẹlu awọn skru.Lẹhin fifin-fọto ati lile simenti, ọgbẹ awọ ara ti wa ni pipade pẹlu 4/0 supramid suture.Ibi ti o yẹ ti cannula jẹ timo nipasẹ jijo lẹẹkọkan ti omi cerebrospinal (CSF).Yọ eku kuro ninu ohun elo stereotaxic, gba itọju ti o yẹ lẹhin iṣẹ abẹ ati iṣakoso irora, ki o gba laaye lati gba pada fun o kere ju ọsẹ kan titi awọn ami ti ẹjẹ yoo fi rii ni omi cerebrospinal.Awọn eku Wistar (Crl: WI/Han) ni a gba lati ọdọ Charles River (France).Gbogbo awọn eku ni a tọju labẹ awọn ipo ti ko ni pathogen pato.Gbogbo awọn adanwo ẹranko ni a fọwọsi nipasẹ Ọfiisi Ile-iwosan ti Ilu Basel, Switzerland, ati pe wọn ṣe ni ibamu pẹlu Iwe-aṣẹ Ẹranko No.. 2474 (Iyẹwo ti Ọpọlọ Ọpọlọ Nṣiṣẹ nipasẹ Iwọn Awọn ipele ti Awọn oludije Iwosan ni Cerebrospinal Fluid ati Brain of Rat).
Rọra tọju eku mimọ pẹlu cannula CM ni ọwọ.Yọ Datura kuro ninu cannula ki o gba 10 µl ti ito cerebrospinal ti nṣàn lairotẹlẹ.Niwọn igba ti patency ti cannula ti bajẹ nikẹhin, awọn ayẹwo omi cerebrospinal ti o han gbangba nikan ti ko si ẹri ti ibajẹ ẹjẹ tabi discoloration ni o wa ninu iwadi yii.Ni afiwe, isunmọ 10-20 μl ti ẹjẹ ni a mu lati inu lila kekere kan ni ipari iru sinu awọn tubes pẹlu heparin (Sigma-Aldrich).CSF ati ẹjẹ ni a gba ni ọpọlọpọ awọn aaye akoko lẹhin abẹrẹ iṣan ti T7 phage.Ni isunmọ 5-10 μl ti omi ti a da silẹ ṣaaju gbigba ayẹwo CSF ​​kọọkan, eyiti o ni ibamu si iwọn didun ti o ku ti catheter.
Awọn ile-ikawe ni a ṣe ipilẹṣẹ nipa lilo fekito T7Select 10-3b gẹgẹ bi a ti ṣe apejuwe rẹ ninu itọnisọna eto T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996).Ni ṣoki, ifibọ DNA 12-mer laileto ni a ṣepọ ni ọna kika atẹle:
A lo codon NNK lati yago fun awọn codons iduro meji ati amino acid overexpression ninu ifibọ.N jẹ ipin equimolar ti a dapọ pẹlu ọwọ ti nucleotide kọọkan, ati K jẹ ipin equimolar pẹlu ọwọ ti adenine ati awọn nucleotides cytosine.Awọn ẹkun idalẹnu ẹyọkan ni a yipada si DNA ti o ni okun meji nipasẹ isọdọtun siwaju pẹlu dNTP (Novagen) ati Klenow henensiamu (New England Biolabs) ni ifipamọ Klenow (New England Biolabs) fun awọn wakati 3 ni 37°C.Lẹhin ifasẹyin naa, DNA ti o ni okun meji ni a gba pada nipasẹ ojoriro EtOH.DNA ti o jẹ abajade jẹ digested pẹlu awọn enzymu ihamọ EcoRI ati HindIII (mejeeji lati Roche).Awọn fifọ ati mimọ (QIAquick, Qiagen) ti a fi sii (T4 ligase, New England Biolabs) lẹhinna ni ligated ni-fireemu sinu ẹya T7 vector ti a ti sọ tẹlẹ lẹhin amino acid 348 ti 10B capsid gene.Awọn aati ligation ti wa ni idawọle ni 16 ° C. fun awọn wakati 18 ṣaaju iṣakojọpọ in vitro.Iṣakojọpọ Phage in vitro ni a ṣe ni ibamu si awọn itọnisọna ti a pese pẹlu T7Select 10-3b cloning kit (Novagen) ati ojutu iṣakojọpọ ti pọ si lẹẹkan si lysis nipa lilo Escherichia coli (BLT5615, Novagen).Awọn lysates ti wa ni centrifuged, titrated ati aotoju ni -80 ° C. bi ojutu ọja ti glycerol.
Imudara PCR Taara ti awọn agbegbe oniyipada phage ti o pọ si ni omitooro tabi awo ni lilo awọn alakoko fusion 454/Roche-amplicon.Alakoko idapo iwaju ni awọn ọna ṣiṣe ti o yika agbegbe oniyipada (NNK) 12 (apẹẹrẹ-pato), GS FLX Titanium Adapter A, ati ọna-ọna bọtini ikawe oni-ipilẹ mẹrin (TCAG) (Afikun eeya 1a):
Alakoko idapọpo iyipada tun ni biotin ti o somọ lati mu awọn ilẹkẹ ati GS FLX Titanium Adapter B ti o nilo fun imudara clonal lakoko PCR emulsion:
Lẹhinna a tẹriba awọn amplicon si 454/Roche pyrosequencing ni ibamu si ilana 454 GS-FLX Titanium.Fun itọsẹ Sanger afọwọṣe (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), T7 phage DNA ti pọ si nipasẹ PCR ati tito lẹsẹsẹ pẹlu awọn orisii alakoko wọnyi:
Awọn ifibọ lati awọn okuta iranti kọọkan ni a tẹriba si imudara PCR nipa lilo Ohun elo Roche Yara Ibẹrẹ DNA Polymerase (gẹgẹ bi awọn ilana olupese).Ṣe ibẹrẹ gbigbona (iṣẹju 10 ni 95 °C) ati awọn iyipo igbelaruge 35 (50s ni 95 °C, iṣẹju 1 ni 50 °C, ati iṣẹju 1 ni 72 °C).
Phage lati awọn ile-ikawe, iru phage egan, phage ti a gbala lati CSF ati ẹjẹ, tabi awọn ere ibeji kọọkan ni a pọ si ni Escherichia coli BL5615 ni broth TB (Sigma Aldrich) tabi ni awọn ounjẹ 500 cm2 (Thermo Scientific) fun 4 h ni 37 ° C.Fage ni a yọ jade lati inu awọn awopọ nipa fifi omi ṣan awọn awo pẹlu Tris-EDTA buffer (Fluka Analytical) tabi nipa gbigba awọn okuta iranti pẹlu awọn imọran pipette ti ko tọ.Phage ti ya sọtọ si alabojuto aṣa tabi ifipamọ isediwon pẹlu iyipo kan ti polyethylene glycol (PEG 8000) ojoriro (Promega) ati tun daduro ni ifipamọ Tris-EDTA.
A ti tẹriba phage ti o pọ si awọn iyipo 2-3 ti yiyọkuro endotoxin nipa lilo awọn ilẹkẹ yiyọ kuro endotoxin (Miltenyi Biotec) ṣaaju abẹrẹ iṣọn-ẹjẹ (IV) (500 μl/eranko).Ni akọkọ yika, 2 × 1012 phages ti a ṣe;ni keji, 2× 1010 phages;ni kẹta ati kẹrin yiyan iyipo, 2× 109 phages fun eranko.Akoonu ipele ninu CSF ati awọn ayẹwo ẹjẹ ti a gba ni awọn aaye akoko itọkasi ni ipinnu nipasẹ kika okuta iranti ni ibamu si awọn ilana olupese (T7Select system manual).Aṣayan Phage ni a ṣe nipasẹ abẹrẹ inu iṣọn ti awọn ile-ikawe ti a sọ di mimọ sinu iṣọn iru tabi nipasẹ tun-abẹrẹ ti phage ti a fa jade lati CSF lati yiyan yiyan ti iṣaaju, ati awọn ikore ti o tẹle ni a ṣe ni 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min, ati 240 min ẹjẹ lẹsẹsẹ C.SF.Apapọ awọn iyipo mẹrin ti panning vivo ni a ṣe ninu eyiti awọn ẹka meji ti a yan ni a ti fipamọ lọtọ ati ṣe itupalẹ lakoko awọn iyipo mẹta akọkọ ti yiyan.Gbogbo awọn ifibọ phage ti a fa jade lati CSF lati awọn iyipo meji akọkọ ti yiyan ni a tẹriba si 454/Roche pyrosequencing, lakoko ti gbogbo awọn ere ibeji ti a fa jade lati CSF lati awọn iyipo meji ti o kẹhin ti yiyan ni a ṣe ilana pẹlu ọwọ.Gbogbo awọn ipele ẹjẹ lati iyipo akọkọ ti yiyan ni a tun tẹriba si 454/Roche pyrosequencing.Fun abẹrẹ ti awọn ere ibeji phage, awọn phages ti a yan ni a pọ si ni E. coli (BL5615) lori awọn apẹrẹ 500 cm2 ni 37 ° C fun awọn wakati 4.Ti yan ni ẹyọkan ati awọn ere ibeji ti o tẹle pẹlu ọwọ ni a tan kaakiri ni alabọde TB.Lẹhin isediwon phage, ìwẹnumọ ati yiyọ kuro ti endotoxin (gẹgẹbi a ti salaye loke), 2 × 1010 phages / eranko ni 300 μl ni a fun ni itọsi sinu iṣọn iru kan.
Preprocessing ati didara sisẹ ti data ọkọọkan.Aise 454/Roche data ti a iyipada lati kan alakomeji boṣewa san map kika (sff) to a kika eniyan Pearson kika (fasta) lilo software ataja.Sisọ siwaju sii ti ilana nucleotide ni a ṣe ni lilo awọn eto C ti ara ẹni ati awọn iwe afọwọkọ (papọ sọfitiwia ti a ko tu silẹ) bi a ti ṣalaye ni isalẹ.Iṣiro ti data akọkọ pẹlu awọn ilana sisẹ ọpọlọpọ-ipele ti o muna.Lati ṣe àlẹmọ awọn kika ti ko ni itọsi 12mer ifibọ DNA ọkọọkan, awọn kika ti wa ni ibamu lẹsẹsẹ lati bẹrẹ aami (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), aami iduro (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGTA) ati ifibọ lẹhin (CCCTGCAGGATATCCCGeedGGCTCGTCGAC) ni lilo agbayetitete gbigba to 2 aiṣedeede fun alignment31.Nitorinaa, awọn kika laisi ibẹrẹ ati da awọn afi duro ati awọn kika ti o ni awọn ifibọ abẹlẹ, ie, awọn isọdi ti o kọja nọmba ti a gba laaye ti awọn ibaamu, ni a yọkuro lati ile-ikawe naa.Niti awọn kika ti o ku, ọna DNA N-mer ti o gbooro lati ami ibẹrẹ ati ipari ṣaaju ki ami iduro naa ti yọkuro lati ọna kika atilẹba ati ilọsiwaju siwaju (lẹhinna tọka si bi “fi sii”).Lẹhin itumọ ti ifibọ, apakan lẹhin codon iduro akọkọ ni ipari 5′ ti alakoko ni a yọkuro lati fi sii.Ni afikun, awọn nucleotides ti o yori si awọn codons ti ko pe ni 3′ opin alakoko ni a tun yọ kuro.Lati yọkuro awọn ifibọ ti o ni awọn ilana isale nikan, awọn ifibọ ti a tumọ ti o bẹrẹ pẹlu ilana amino acid “PAG” ni a tun yọkuro.Awọn peptides pẹlu ipari-itumọ-lẹhin ti o kere ju awọn amino acids 3 ni a yọkuro lati ile-ikawe naa.Nikẹhin, yọ apọju kuro ninu adagun ti a fi sii ki o pinnu igbohunsafẹfẹ ti ifibọ alailẹgbẹ kọọkan.Awọn abajade ti itupalẹ yii pẹlu atokọ ti awọn ilana ti nucleotide (awọn ifibọ) ati awọn igbohunsafẹfẹ wọn (ka) wọn (Awọn eeya afikun 1c ati 2).
Ẹgbẹ N-mer DNA awọn ifibọ nipa ibajọra ọkọọkan: Lati se imukuro 454/Roche-pato asise lesese (gẹgẹ bi awọn iṣoro pẹlu atele homopolymer amugbooro) ki o si yọ kere pataki redundancies, tẹlẹ filtered N-mer DNA lesese ifibọ (ifibọ) ti wa ni lẹsẹsẹ nipasẹ ibajọra.awọn ifibọ (ti o to awọn ipilẹ 2 ti kii ṣe ibamu ti a gba laaye) nipa lilo algorithm aṣetunṣe ti a ṣalaye bi atẹle: awọn ifibọ ti wa ni lẹsẹsẹ ni akọkọ nipasẹ igbohunsafẹfẹ wọn (ti o ga julọ si asuwon ti), ati pe ti wọn ba jẹ kanna, nipasẹ iru keji wọn nipasẹ gigun ( gunjulo si kuru) ).Nitorinaa, awọn ifibọ loorekoore ati gigun julọ n ṣalaye “ẹgbẹ” akọkọ.Igbohunsafẹfẹ ẹgbẹ ti ṣeto si igbohunsafẹfẹ bọtini.Lẹhinna, ifibọ kọọkan ti o ku ninu atokọ lẹsẹsẹ ni a gbiyanju lati ṣafikun si ẹgbẹ nipasẹ titete Needleman-Wunsch ni ọna meji.Ti nọmba awọn aiṣedeede, awọn ifibọ, tabi awọn piparẹ ninu titete ko kọja iloro ti 2, ifibọ ti wa ni afikun si ẹgbẹ naa, ati pe igbohunsafẹfẹ ẹgbẹ gbogbogbo jẹ alekun nipasẹ iye igba ti ifibọ naa ti ṣafikun.Awọn ifibọ ti a ṣafikun si ẹgbẹ kan jẹ samisi bi lilo ati yọkuro lati sisẹ siwaju.Ti ọna ifibọ ko ba le fi kun si ẹgbẹ ti o ti wa tẹlẹ, ọna ifibọ naa ni a lo lati ṣẹda ẹgbẹ tuntun pẹlu igbohunsafẹfẹ ifibọ ti o yẹ ati samisi bi lilo.Aṣetunṣe dopin nigbati ọna ifibọ kọọkan ti jẹ boya a ti lo lati ṣẹda ẹgbẹ tuntun tabi o le wa ninu ẹgbẹ ti o ti wa tẹlẹ.Lẹhinna, awọn ifibọ akojọpọ ti o ni awọn nucleotides ni a tumọ nikẹhin si awọn ilana peptide (awọn ile-ikawe peptide).Abajade ti itupalẹ yii jẹ eto ti awọn ifibọ ati awọn igbohunsafẹfẹ ibaramu wọn ti o jẹ nọmba awọn kika itẹlera (Afikun Fig. 2).
Iran Motif: Da lori atokọ ti awọn peptides alailẹgbẹ, a ṣẹda ile-ikawe kan ti o ni gbogbo awọn ilana amino acid ti o ṣeeṣe (aa) bi a ṣe han ni isalẹ.Ilana kọọkan ti o ṣeeṣe ti ipari 3 ni a yọ jade lati peptide ati pe a ṣe afikun apẹrẹ onidakeji rẹ pẹlu ile-ikawe motif ti o wọpọ ti o ni gbogbo awọn ilana (tripeptides).Awọn ile-ikawe ti awọn ero atunwi giga ni a ṣe lẹsẹsẹ ati yiyọkuro apọju.Lẹhinna, fun tripeptide kọọkan ninu ile-ikawe motif, a ṣayẹwo fun wiwa rẹ ninu ile-ikawe nipa lilo awọn irinṣẹ iṣiro.Ni idi eyi, awọn igbohunsafẹfẹ ti peptide ti o ni awọn ri motif tripeptide ti wa ni afikun ati ki o sọtọ si motif ni motif ìkàwé ("nọmba ti motifs").Abajade ti iran motif jẹ apẹrẹ onisẹpo meji ti o ni gbogbo awọn iṣẹlẹ ti tripeptides (awọn idii) ati awọn iye wọn, eyiti o jẹ nọmba awọn kika ti o tẹle ti o ja si idi ti o baamu nigbati awọn kika ti wa ni filtered, akojọpọ, ati itumọ.Metiriki bi apejuwe ninu awọn apejuwe loke.
Deede ti awọn nọmba ti motifs ati awọn ti o baamu sitplots: Nọmba ti motifs fun kọọkan ayẹwo ti a deede lilo
nibo ni nọmba awọn kika ti o ni koko i.Nitorinaa, vi ṣe aṣoju igbohunsafẹfẹ ogorun ti kika (tabi peptides) ti o ni agbaso ero i ninu apẹẹrẹ.Awọn iye P fun nọmba ti kii ṣe deede ti awọn idii ni a ṣe iṣiro nipa lilo idanwo gangan Fisher.Nipa awọn correlograms ti nọmba awọn idi, awọn ibamu ti Spearman ni a ṣe iṣiro nipa lilo nọmba deede ti awọn idi pẹlu R.
Lati wo akoonu ti amino acids ni ipo kọọkan ninu ile-ikawe peptide, awọn aami oju opo wẹẹbu 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) ni a ṣẹda.Ni akọkọ, akoonu ti amino acids ni ipo kọọkan ti peptide 12-mer ti wa ni ipamọ sinu matrix 20 × 12 kan.Lẹhinna, ṣeto ti awọn peptides 1000 ti o ni awọn akoonu amino acid ibatan kanna ni ipo kọọkan jẹ ipilẹṣẹ ni ọna kika ọna-ọna fasta ati pese bi titẹ sii si aami wẹẹbu 3, eyiti o ṣe agbekalẹ aṣoju ayaworan ti akoonu amino acid ibatan ni ipo kọọkan.fun a fi fun peptide ìkàwé.Lati foju inu wo awọn ipilẹ data onisẹpo, awọn maapu ooru ni a ṣẹda pẹlu lilo ohun elo ti o dagbasoke ni inu ni R (biosHeatmap, package R ti a ti tu silẹ sibẹsibẹ).Awọn dendrograms ti a gbekalẹ ninu awọn maapu ooru ni a ṣe iṣiro nipa lilo ọna ikojọpọ akosoagbasomode Ward pẹlu metric ijinna Euclidean.Fun itupalẹ iṣiro ti data igbelewọn motif, awọn iye P fun igbelewọn ti ko ṣe deede jẹ iṣiro ni lilo idanwo gangan Fisher.Awọn iye P-fun awọn ipilẹ data miiran ni a ṣe iṣiro ni R ni lilo t-idanwo ọmọ ile-iwe tabi ANOVA.
Awọn ere ibeji phage ti a ti yan ati awọn phages laisi awọn ifibọ ni a fun ni itọsi iṣan nipasẹ iṣọn iru (2 × 1010 phages / eranko ni 300 μl PBS).Iṣẹju mẹwa ṣaaju iṣaju perfusion ati imuduro atẹle, awọn ẹranko kanna ni a fun ni itọsi iṣọn-ẹjẹ pẹlu 100 μl ti DyLight594-aami lectin (Vector Laboratories Inc., DL-1177).Awọn iṣẹju 60 lẹhin abẹrẹ phage, awọn eku ni a fun ni inu ọkan pẹlu 50 milimita PBS ti o tẹle 50 milimita 4% PFA/PBS.Awọn ayẹwo ọpọlọ ni a tun ṣe ni afikun ni alẹ ni 4% PFA/PBS ati ki o wọ sinu 30% sucrose ni alẹ ni 4°C.Awọn ayẹwo ti wa ni didi filasi ni adalu OCT.Ayẹwo ajẹsara ajẹsara ti awọn ayẹwo tio tutunini ni a ṣe ni iwọn otutu yara lori 30 µm cryosections ti dina pẹlu 1% BSA ati idawọle pẹlu polyclonal FITC awọn aporo-ara ti o ni aami si T7 phage (Novus NB 600-376A) ni 4 °C.Incubate moju.Nikẹhin, awọn apakan naa ni a fọ ​​ni igba mẹta pẹlu PBS ati ṣe ayẹwo pẹlu microscope laser confocal (Leica TCS SP5).
Gbogbo awọn peptides pẹlu mimọ ti o kere ju ti 98% ni a ṣepọ nipasẹ GenScript USA, biotinylated ati lyophilized.Biotin wa ni owun nipasẹ afikun aaye glycine meteta ni N-terminus.Ṣayẹwo gbogbo awọn peptides nipa lilo spectrometry pupọ.
Streptavidin (Sigma S0677) ti dapọ pẹlu 5-fold equimolar excess of biotinylated peptide, biotinylated BACE1 inhibitory peptide, tabi apapo (3: 1 ratio) ti biotinylated BACE1 peptide inhibitory ati BACE1 inhibitory peptide ni 5-10% DMSO / incu.Wakati 1 ni iwọn otutu yara ṣaaju abẹrẹ.Streptavidin-conjugated peptides ti wa ni itasi ni iṣọn-ẹjẹ ni iwọn lilo 10 mg / kg sinu ọkan ninu awọn iṣọn iru ti awọn eku pẹlu iho cerebral.
Idojukọ ti awọn eka streptavidin-peptide jẹ iṣiro nipasẹ ELISA.Nunc Maxisorp microtiter plates (Sigma) ni a bo ni alẹ ni 4°C pẹlu 1.5 μg/ml mouse anti-streptavidin antibody (Thermo, MA1-20011).Lẹhin ti dina (idinaduro ifipamọ: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% gelatin, 1% BSA) ni iwọn otutu yara fun wakati 2, fọ awo pẹlu 0.05% Tween-20 / PBS (fifiwe fifọ) fun 3 keji, CSF ati awọn ayẹwo pilasima 0 ti a fi kun si 0 daradara, 0 ti a fi kun si 1 keji SF 1:115 ).Awo awo naa lẹhinna ni idawọle ni alẹ kan ni 4°C pẹlu antibody iwari (1 μg/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239).Lẹhin awọn igbesẹ fifọ mẹta, a rii streptavidin nipasẹ isubu ninu ojutu sobusitireti TMB (Roche) fun iṣẹju 20.Lẹhin didaduro idagbasoke awọ pẹlu 1M H2SO4, wiwọn gbigba ni 450 nm.
Iṣẹ ti eka inhibitor streptavidin-peptide-BACE1 jẹ iṣiro nipasẹ Aβ (1-40) ELISA ni ibamu si ilana ti olupese (Wako, 294-64701).Ni ṣoki, awọn ayẹwo CSF ​​ni a fomi ni diluent boṣewa (1:23) ati pe a fi sii ni alẹ kan ni 4°C ni awọn awo-daradara 96 ​​ti a bo pẹlu BNT77 apaniyan imudani.Lẹhin awọn igbesẹ fifọ marun, HRP-conjugated BA27 antibody ti wa ni afikun ati idabo fun wakati 2 ni 4° C., atẹle nipa awọn igbesẹ fifọ marun.Aβ (1-40) ni a rii nipasẹ isunmọ ni ojutu TMB fun awọn iṣẹju 30 ni iwọn otutu yara.Lẹhin ti idagbasoke awọ ti duro pẹlu ojutu iduro, wiwọn ifasilẹ ni 450 nm.Awọn ayẹwo pilasima ni a tẹriba si isediwon alakoso to lagbara ṣaaju si Aβ (1-40) ELISA.Plasma ti wa ni afikun si 0.2% DEA (Sigma) ni awọn apẹrẹ 96-daradara ati pe a fi sii ni iwọn otutu yara fun ọgbọn išẹju 30.Lẹhin ti o ti fọ awọn awo SPE (Oasis, 186000679) pẹlu omi ati 100% methanol, awọn ayẹwo pilasima ti wa ni afikun si awọn awo SPE ati gbogbo omi ti yọ kuro.Awọn ayẹwo ni a fọ ​​(akọkọ pẹlu 5% kẹmika kẹmika 30% kẹmika kẹmika 30) ati pe o ti gbe jade pẹlu 2% NH4OH/90% kẹmika.Lẹhin gbigbe eluate ni 55 ° C fun 99 min ni igbagbogbo N2 lọwọlọwọ, awọn ayẹwo ti dinku ni awọn diluents boṣewa ati Aβ (1-40) ni iwọn bi a ti salaye loke.
Bii o ṣe le tọka nkan yii: Urich, E. et al.Ifijiṣẹ ẹru si ọpọlọ nipa lilo awọn peptides irekọja ti a mọ ni vivo.ijinle sayensi.5, 14104;doi: 10.1038 / srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB ati Moos T. Ifijiṣẹ ti macromolecular oloro si ọpọlọ nipa lilo ìfọkànsí ailera.Iwe akosile ti Neurochemistry 113, 1-13, 10.1111 / j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., ati Martinez-Martinez, P. Ifijiṣẹ ti peptide ati awọn oogun amuaradagba kọja idena-ọpọlọ ẹjẹ.Prog Neurobiol 87, 212-251, 10.1016 / j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Idena ọpọlọ-ẹjẹ: igo ni idagbasoke oogun ọpọlọ.NeuroRx 2, 3-14, 10.1602 / neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, ati Byrd, A. Awọn ifojusọna fun iṣeduro oogun ti o ni ilọsiwaju ati ifojusi si ọpọlọ nipasẹ ọna-ọna choroid plexus-CSF.Iwadi elegbogi 22, 1011-1037, 10.1007 / s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Olaju ti biopharmaceuticals pẹlu molikula Tirojanu ẹṣin fun ọpọlọ ifijiṣẹ.Bioconjug Chem 19, 1327-1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM olugba-ilaja peptide gbigbe kọja idena-ọpọlọ ẹjẹ.Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al.Ṣe alekun ilaluja ọpọlọ ati imunadoko ti awọn aporo-ara ti itọju ni lilo awọn ohun-ọṣọ molikula monovalent.Neuron 81, 49-60, 10.1016 / j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al.Gbigbe olugba Transferrin (TfR) ṣe ipinnu gbigbemi ọpọlọ ti awọn iyatọ isunmọ ti awọn ọlọjẹ TfR.J Exp Med 211, 233-244, 10.1084 / jem.20131660 (2014).