O ṣeun fun lilo si Nature.com. O nlo ẹya ẹrọ aṣawakiri kan pẹlu atilẹyin CSS lopin. Fun iriri ti o dara julọ, a ṣeduro pe ki o lo ẹrọ aṣawakiri imudojuiwọn kan (tabi mu Ipo Ibamu ṣiṣẹ ni Internet Explorer). Ni afikun, lati rii daju atilẹyin ti nlọ lọwọ, a fihan aaye naa laisi awọn aza ati JavaScript.
Ṣe afihan carousel ti awọn kikọja mẹta ni ẹẹkan. Lo awọn ti tẹlẹ ati awọn bọtini atẹle lati gbe nipasẹ awọn ifaworanhan mẹta ni akoko kan, tabi lo awọn bọtini ifaworanhan ni ipari lati gbe nipasẹ awọn ifaworanhan mẹta ni akoko kan.
Awọn ara-ara-ara-ara-ara ẹni ti ara ẹni ṣe aṣoju iru ẹrọ in vitro ti o ni ileri fun idagbasoke eniyan ati arun. Sibẹsibẹ, awọn organoids ko ni Asopọmọra ti o wa ni vivo, eyiti o ṣe idiwọ idagbasoke ati idilọwọ iṣọpọ pẹlu awọn iyika miiran ti o ṣakoso ihuwasi. Nibi ti a fihan pe eda eniyan stem cell-ti ari cortical organoids gbigbe sinu somatosensory kotesi ti awọn ọmọ ikoko ihoho eku se agbekale ogbo cell orisi ti o ṣepọ sinu ifarako ati imoriya-jẹmọ iyika. MRI ṣe afihan idagbasoke organoid lẹhin-asopo ni ọpọlọpọ awọn laini sẹẹli ati awọn ẹranko, lakoko ti itupalẹ ọkan-mojuto ṣe afihan ilọsiwaju ti corticogenesis ati ifarahan ti eto transcription ti o gbẹkẹle iṣẹ-ṣiṣe. Nitootọ, awọn neurons cortical ti a gbin ṣe afihan ara-ara ti o nipọn diẹ sii, synapti, ati awọn ohun-ini awo inu ara ju awọn ẹlẹgbẹ in vitro wọn, gbigba wiwa awọn abawọn neuronal ninu awọn alaisan ti o ni iṣọn-ẹjẹ Timoteu. Ṣiṣayẹwo anatomical ati iṣẹ ṣiṣe ti fihan pe awọn ẹya ara ti a gbin gba thalamocortical ati awọn igbewọle corticocortical, ati ni vivo awọn gbigbasilẹ ti iṣẹ ṣiṣe ti ara daba pe awọn igbewọle wọnyi le ṣe agbekalẹ awọn idahun ifarako ninu awọn sẹẹli eniyan. Lakotan, awọn ohun alumọni cortical fa awọn axons jakejado ọpọlọ eku, ati imuṣiṣẹ optogenetic wọn yori si ihuwasi wiwa ẹsan. Nitorinaa, awọn neuronu kotesi eniyan ti o dagba ati kopa ninu awọn iyika agbalejo ti o ṣakoso ihuwasi. A nireti pe ọna yii lati dẹrọ wiwa ti awọn ipele phenotypes strand ninu awọn sẹẹli ti a mu alaisan ti a ko le rii nipasẹ awọn ọna miiran.
Ọpọlọ eniyan ti o ndagbasoke jẹ ilana isọdọkan ti ara ẹni iyalẹnu ninu eyiti awọn sẹẹli ti n pọ si, iyatọ, ṣiwakiri, ati sopọ lati ṣe awọn iyika neuronal ti iṣẹ ṣiṣe ti o tun tun ṣe nipasẹ iriri ifarako. Iṣoro bọtini ni agbọye idagbasoke ọpọlọ eniyan, paapaa ni aaye ti arun, ni aini iraye si iṣan ọpọlọ. Awọn ẹya ara ẹni ti n ṣeto ara ẹni, pẹlu awọn organoids cortex eniyan (hCO; ti a tun mọ ni agbegbe kotesi eniyan), le ṣe ipilẹṣẹ 2,3,4,5,6. Sibẹsibẹ, ọpọlọpọ awọn idiwọn ṣe opin ohun elo wọn gbooro si agbọye idagbasoke ati iṣẹ ṣiṣe ti awọn iyika nkankikan. Ni pataki, ko ṣe akiyesi boya idagbasoke hCO ni opin nipasẹ isansa ti awọn microenvironmental kan ati awọn igbewọle ifarako ti o wa ninu vivo. Ni afikun, nitori awọn hCO ko ni irẹpọ si awọn iyika ti o le ṣe awọn abajade ihuwasi, iwulo wọn ni ṣiṣe apẹẹrẹ eka-jiini ati awọn rudurudu neuropsychiatric ihuwasi ti ni opin lọwọlọwọ.
Iṣipopada ti hCO sinu ọpọlọ ti o wa laaye le bori awọn idiwọn wọnyi. Awọn ijinlẹ iṣaaju ti fihan pe awọn neuronu eniyan ti a gbe sinu kotesi rodent ni anfani lati ye, ṣe akanṣe, ati ibaraẹnisọrọ pẹlu awọn sẹẹli rodent7,8,9,10,11,12. Bibẹẹkọ, awọn adanwo wọnyi ni a maa n ṣe lori awọn ẹranko agba, eyiti o le ṣe idinku isọdọkan synapti ati axonal. Nibi, a ṣapejuwe ilana isọdọmọ ninu eyiti a ti gbin 3D hCO ti o wa lati awọn sẹẹli hiPS sinu kotesi somatosensory akọkọ (S1) ti awọn eku ajẹsara ni ipele ibẹrẹ ti idagbasoke ṣiṣu. Awọn neuronu hCO (t-hCO) ti a gbin gba idagbasoke nla, gba awọn igbewọle thalamocortical ati cortical-cortical ti o fa awọn idahun ifarako han, ati fa awọn asọtẹlẹ axonal sinu ọpọlọ eku lati wakọ ihuwasi wiwa ẹsan. Ti o gbooro sii maturation ti t-hCO ti ṣafihan awọn abawọn neuronal ni awọn alaisan ti o ni iṣọn-ẹjẹ Timoteu (TS), rudurudu jiini ti o lagbara ti o fa nipasẹ awọn iyipada ninu ikanni kalisiomu L-iru CaV1.2 foliteji (ti a fi sinu koodu nipasẹ CACNA1C).
Lati ṣe iwadi awọn neurons cortical eniyan ni awọn iyika ni vivo, a stereotactically transplanted mule 3D hCO sinu S1 ti tete postnatal eku athymic (ọjọ 3-7 postnatally) (Fig. 1a ati ki o gbooro data ti Ọpọtọ. 1a-c). Ni aaye yii, awọn asọtẹlẹ axonal thalamocortical ati corticocortical ko tii ti pari innervation S1 wọn (ref. 13). Nitorinaa, ọna yii jẹ apẹrẹ lati mu isọpọ t-hCO pọ si lakoko ti o dinku ipa lori awọn iyika endogenous. Lati wo ipo ti t-hCO ni awọn ẹranko laaye, a ṣe awọn atunṣe ọpọlọ MRI ti T2 ti awọn eku 2-3 osu lẹhin gbigbe (Fig. 1b ati data ti o gbooro sii, Fig. 1d). t-hCO ni a ṣe akiyesi ni imurasilẹ ati awọn wiwọn iwọn didun ti t-hCO jẹ iru awọn ti a ṣe iṣiro lati awọn ege ti o wa titi (Aworan Data gbooro. 1d,e; P> 0.05). t-hCO ni a ṣe akiyesi ni imurasilẹ ati awọn wiwọn iwọn didun ti t-hCO jẹ iru awọn ti a ṣe iṣiro lati awọn ege ti o wa titi (Aworan Data gbooro. 1d,e; P> 0.05). t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны danu, 1d, e; t-hCO ni a ṣe akiyesi ni irọrun, ati awọn wiwọn t-hCO volumetric jẹ iru awọn ti a ṣe iṣiro fun awọn apakan ti o wa titi (data ti o gbooro, Fig. 1d, e; P> 0.05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P > 0.05）。很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны danu, 1d, e; t-hCO ni a ṣe akiyesi ni irọrun, ati awọn wiwọn t-hCO volumetric jẹ iru awọn ti a ṣe iṣiro fun awọn apakan ti o wa titi (data ti o gbooro, Fig. 1d, e; P> 0.05).A pinnu t-hCO ni 81% ti awọn ẹranko gbigbe ni isunmọ awọn oṣu 2 lẹhin isọdọmọ (n = awọn ẹranko 72; hCO lati awọn laini sẹẹli hiPS 10; awọn laini sẹẹli hiPS ni Tabili Imudara 1). Ninu awọn wọnyi, 87% wa ni kotesi cerebral (Fig. 1c). Nipa ṣiṣe awọn iwoye MRI ni tẹlentẹle ni awọn aaye akoko pupọ ni eku gbigbe kanna, a rii ilọpo mẹsan ni iwọn t-hCO laarin awọn oṣu 3 (Fig. 1d ati data gbooro, Fig. 1f). Awọn ẹranko ti a gbin ni oṣuwọn iwalaaye giga (74%) ni awọn oṣu 12 lẹhin isọdọmọ (data ti o gbooro, Fig. 1g ati Tabili Iyọnda 2), ko si si mọto tabi awọn ailagbara iranti, gliosis, tabi electroencephalogram (EEG) ni a rii. Ọpọtọ data 1g ati tabili afikun 2). 1h-m ati 3e).
a, Sikematiki ti esiperimenta design. hCO ti o wa lati awọn sẹẹli hiPS ni a gbin sinu S1 ti awọn eku ihoho ọmọ tuntun ni awọn ọjọ 30-60 ti iyatọ. b, T2 ti o ni iwuwo iṣọn-ara ati awọn aworan MRI petele ti o nfihan t-hCO ni awọn osu S1 2 lẹhin gbigbe. Pẹpẹ iwọn, 2 mm. c, Didiwọn awọn oṣuwọn aṣeyọri engraftment ti o han fun laini sẹẹli hiPS kọọkan (n = 108, awọn nọmba laarin awọn ifi tọka iye t-hCO fun laini sẹẹli hIPS) ati cortical tabi ipo subcortical (n = 88). d, Aworan MRI ti iṣọn-ẹjẹ iṣọn-alọ ọkan (osi; igi iwọn, 3 mm) ati 3D atunṣe iwọn didun ti o ni ibamu (ọpa iwọn, 3 mm) ti o nfihan ilosoke ninu t-hCO lori awọn osu 3. e, Atunwo awọn ilana t-hCO ni kotesi cerebral eku. Pẹpẹ iwọn, 1 mm. f, Awọn aworan immunocytochemical asoju ti t-hCO ti o han lati oke apa osi si ọtun (lakoko iyatọ): PPP1R17 (4 osu atijọ), NeuN (8 osu atijọ), SOX9 ati GFAP (8 osu atijọ), PDGFRα; (osu 8), MAP2 (osu 8) ati IBA1 (osu 8). Pẹpẹ iwọn, 20 µm. Àjọsọpọ ti HNA tọkasi awọn sẹẹli ti ipilẹṣẹ eniyan. g, snRNA-seq: Ijọpọ ti iṣọkan ati iṣiro (UMAP) aworan idinku iwọn ti gbogbo awọn ekuro t-hCO ti o ga julọ lẹhin iṣọpọ Seurat (n = 3 t-hCO awọn ayẹwo, n = 2 awọn laini sẹẹli hiPS). Astrocytes, awọn sẹẹli ti laini astrocyte; cyc prog, awọn progenitors kaakiri; GluN DL, awọn iṣan glutamatergic ti o jinlẹ; GluN DL/SP, jin ati sublamellar glutamatergic awọn iṣan; GluN UL, awọn neuronu glutamatergic Layer oke; oligodendrocytes, oligodendrocytes; OPC, awọn sẹẹli progenitor oligodendrocyte; RELN, awọn iṣan reelin. h, Gene Ontology (GO) igbekale imudara ọrọ ti awọn Jiini ni ilọsiwaju pataki (atunṣe P <0.05, iyipada agbo> 2, ti a fihan ni o kere ju 10% ti awọn ekuro) ni t-hCO glutamatergic neurons ni akawe pẹlu hCO glutamatergic neurons. h, Gene Ontology (GO) igbekale imudara ọrọ ti awọn Jiini ni ilọsiwaju pataki (atunṣe P <0.05, iyipada agbo> 2, ti a fihan ni o kere ju 10% ti awọn ekuro) ni t-hCO glutamatergic neurons ni akawe pẹlu hCO glutamatergic neurons. h, Анализ обогащения терминов Gene Ontology (GO) для генов со значительной 2. hCO. h, Gene Ontology (GO) itupalẹ imudara ọrọ fun awọn jiini pẹlu imuṣiṣẹ pataki (ti a ṣe atunṣe P<0.05, iyipada agbo> 2, ikosile ni o kere ju 10% awọn ekuro) ni t-hCO glutamatergic neurons ni akawe si awọn neurons glutamatergic hCO. h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调相比，t-hCO 2,在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富集分析。 h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因变化> 2术语富集分析. h. ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению сравнению обогащения. h.Laini aami tọkasi iye aq ti 0.05. i, aworan UMAP ti awọn iru sẹẹli GluN ni t-hCO ni lilo aami gbigbe lati itọkasi 22 snRNA-seq agba moto kotesi dataset. CT - awọn sẹẹli corticothalamic, ET - awọn sẹẹli extracerebral, IT - awọn sẹẹli telencephalic ti inu, NP - nitosi asọtẹlẹ.
Lẹhinna a ṣe ayẹwo cytoarchitecture ati akopọ cellular lapapọ ti t-hCO. Antibody idoti ti eku endothelial ẹyin fi han vascularization pẹlu t-hCO, nigba ti IBA1 idoti fi han niwaju eku microglia jakejado alọmọ (Fig. 1f ati gbooro data, Fig. 3c, d). Imunostaining ṣe afihan antijeni iparun eniyan (HNA) awọn sẹẹli rere ti n ṣafihan PPP1R17 (awọn progenitors cortical), NeuN (awọn neuronu), SOX9 ati GFAP (awọn sẹẹli ti ari glial) tabi PDGFRα (oligodendrocyte progenitors) (Figure 1f). Lati ṣe iwadi akojọpọ cellular ti t-hCO ni ipinnu sẹẹli ẹyọkan, a ṣe ilana ilana RNA kan-mojuto (snRNA-seq) lẹhin isunmọ awọn oṣu 8 ti iyatọ. Sisẹ olopobobo ati yiyọkuro awọn eku eku mu awọn maapu mononuclear eniyan ti o ga julọ 21,500 (Fig. 1g ati data ti o gbooro, Fig. 4a,b). Awọn ilana ikosile ti awọn asami iru sẹẹli ti o ṣe idanimọ awọn iṣupọ ti awọn kilasi sẹẹli cortical pataki, pẹlu awọn neuronu glutamatergic ti o jinlẹ ati ti aipe, awọn progenitors ti n kaakiri, oligodendrocytes, ati iran astrocyte (Fig. 1g, data ti o gbooro, Fig. 4c, ati Table 3 Afikun). Immunostaining fun SATB2 ati CTIP2 fihan pe pelu wiwa awọn subtypes cortical, t-hCO ko ṣe afihan iyasọtọ anatomical ti o han gbangba (data ti o gbooro, Fig. 3a). snRNA-seq hCO ti ipele-ibaramu ṣe agbejade awọn kilasi sẹẹli ti o jọra pupọ, pẹlu awọn imukuro diẹ, pẹlu isansa ti oligodendrocytes ati wiwa ti awọn neuronu GABAergic, eyiti o le ṣe afihan ọjo ti a ti sọ tẹlẹ ninu awọn ipo vitro fun awọn sẹẹli progenitor ti ita15 (data ti o gbooro, Fig. 4f - i ati tabili Afikun 4). Onínọmbà ikosile jiini iyatọ ṣe afihan awọn iyatọ pataki ninu awọn neurons glutamatergic laarin t-hCO ati hCO (Afikun Tabili 5), pẹlu imuṣiṣẹ ti awọn ipilẹ ti awọn jiini ti o ni nkan ṣe pẹlu idagbasoke neuronal gẹgẹbi ami ifihan synapti, agbegbe dendritic, ati iṣẹ-ṣiṣe ikanni foliteji-gated (Nọmba 1h ati tabili Afikun 5). tabili 6). Nitorinaa, awọn neurons cortical glutamatergic t-hCO ṣe afihan isare transcriptional maturation.
Lati ṣe alaye boya awọn iyipada transcriptional wọnyi ni t-hCO ni ibatan si awọn iyatọ morphological laarin hCO in vitro ati t-hCO ni vivo, a tun ṣe ipele-ipele ti o baamu biocytin-filled hCO ati hCO ni awọn apakan nla lẹhin awọn oṣu 7-8 ti iyatọ. hCO awọn iṣan (aworan 2a). t-hCO neurons ni o tobi pupọ, ni awọn akoko 1.5 ni iwọn ila opin soma, lẹẹmeji bi ọpọlọpọ awọn dendrites, ati pe o pọ si ilọpo mẹfa ni apapọ ipari dendritic ni akawe si in vitro hCO (Fig. 2b). Ni afikun, a ṣe akiyesi iwuwo giga ti o ga julọ ti awọn ọpa ẹhin dendritic ni awọn iṣan t-hCO ju awọn neuronu hCO (Fig. 2c). Eyi ni imọran pe awọn t-hCO awọn neurons gba gigun dendritic elongation ati ẹka, eyi ti, ni apapo pẹlu ilọsiwaju sẹẹli ti o tẹsiwaju, le ṣe alabapin si idagbasoke ti o lagbara ti t-hCO lẹhin gbigbe (Fig. 1d ati Extended Data Fig. 1f). Eyi jẹ ki a ṣe iwadii awọn ohun-ini electrophysiological. Agbara Membrane jẹ igba mẹjọ ti o ga julọ (data ti o gbooro sii, Fig. 8d), agbara membrane-isinmi jẹ hyperpolarized diẹ sii (isunmọ 20 mV), ati pe abẹrẹ lọwọlọwọ nfa iwọn itusilẹ ti o ga julọ ni awọn iṣan t-hCO ju ni awọn neuronu hCO. in vitro (Fig. 2d), e), eyi ti o ni ibamu pẹlu awọn ẹya ara ẹrọ ti o tobi ati ti o pọju ti t-hCO. Ni afikun, awọn igbohunsafẹfẹ ti awọn iṣẹlẹ iṣẹlẹ postsynaptic ti o wa lẹẹkọkan (EPSC) jẹ pataki ti o ga julọ ni awọn neurons t-hCO (Fig. 2f), ni iyanju pe iwuwo ti o pọ si ti awọn ẹhin dendritic ti a ṣe akiyesi ni t-hCO neurons ni o ni nkan ṣe pẹlu excitability iṣẹ. ibalopo synapse. A jẹrisi iwa ti ko dagba ti awọn neuronu hCO in vitro nipasẹ gbigbasilẹ aami awọn neurons glutamatergic (data ti o gbooro, Fig. 6a-c).
a, 3D atunkọ ti biocytin-filled hCO ati t-hCO neurons lẹhin awọn osu 8 ti iyatọ. b, Iwọn ti awọn ẹya ara ẹrọ ti iṣan (n = 8 hCO neurons, n = 6 t-hCO neurons; ** P = 0.0084, * P = 0.0179 ati *** P <0.0001). b, Iwọn ti awọn ẹya ara ẹrọ ti iṣan (n = 8 hCO neurons, n = 6 t-hCO neurons; ** P = 0.0084, * P = 0.0179 ati *** P <0.0001). б. b, titobi ti awọn ẹya ara ẹni (n = 8 hCO neurons, n = 6 t-hCO neurons; ** P = 0.0084, * P = 0.0179, ati *** P <0.0001). b，形态学特征的量化（n = 8 b，形态学特征的量化（n = 8 б. b, titobi ti awọn ẹya ara ẹni (n = 8 hCO neurons, n = 6 t-hCO neurons; ** P = 0.0084, * P = 0.0179, ati *** P <0.0001).c, 3D atunkọ ti hCO ati t-hCO dendritic awọn ẹka lẹhin awọn osu 8 ti iyatọ. Awọn ami akiyesi pupa tọkasi awọn ọpa ẹhin dendritic putative. Iwọn iwuwo iwuwo ẹhin Dendritic (n = 8 hCO neurons, n = 6 t-hCO neurons; ** P = 0.0092). d, Isọdi ti agbara awọ ara isinmi (n = 25 hCO neurons, n = 16 t-hCO neurons; *** P <0.0001). d, Isọdi ti agbara awọ ara isinmi (n = 25 hCO neurons, n = 16 t-hCO neurons; *** P <0.0001). d. d, ijẹẹmu ti o pọju awo ilu ti o ni isimi (n = 25 hCO neurons, n = 16 t-hCO neurons; *** P <0.0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P <0.0001）. d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P <0.0001）. d. d, ijẹẹmu ti o pọju awo ilu ti o ni isimi (n = 25 hCO neurons, n = 16 t-hCO neurons; *** P <0.0001). e, Iṣe atunwi ti o pọju ibọn ni hCO ati t-hCO ti o fa nipasẹ jijẹ awọn abẹrẹ lọwọlọwọ, ati iwọn ti oṣuwọn ibọn ti o pọju (n = 25 hCO neurons, n = 16 t-hCO neurons; *** P <0.0001). e, Iṣe atunwi ti o pọju ibọn ni hCO ati t-hCO ti o fa nipasẹ jijẹ awọn abẹrẹ lọwọlọwọ, ati iwọn ti oṣuwọn ibọn ti o pọju (n = 25 hCO neurons, n = 16 t-hCO neurons; *** P <0.0001). e, повторное возбуждение потенциала действия в hCO и t-hCO. скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, agbara atunbere iṣẹ ni hCO ati t-hCO ti o fa nipasẹ ilosoke lọwọlọwọ ati iwọn ti oṣuwọn ibọn ti o pọju (n = 25 hCO neurons, n = 16 t-hCO neurons; *** P <0.0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P <0.0001）。 E 通过 增加 电流 注入 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及, n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0.0001） . e, повторяющеся возбуждение потенциала действия hCO и t-hCO. максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, titu atunwi ti hCO ati awọn agbara iṣe t-hCO ti o fa nipasẹ ipese lọwọlọwọ ti o pọ si ati iwọn ti oṣuwọn ibọn ti o pọju (n = 25 hCO neurons, n = 16 t-hCO neurons; *** P <0.0001). f, Awọn EPSCs lẹẹkọkan (sEPSCs) ni hCO ati t-hCO awọn iṣan ni awọn osu 8 ti iyatọ, ati iṣiro ti igbohunsafẹfẹ ti awọn iṣẹlẹ synaptic (n = 25 hCO neurons, n = 17 t-hCO neurons; *** P <0.0001). f, Awọn EPSCs lẹẹkọkan (sEPSCs) ni hCO ati t-hCO awọn iṣan ni awọn osu 8 ti iyatọ, ati iṣiro ti igbohunsafẹfẹ ti awọn iṣẹlẹ synaptic (n = 25 hCO neurons, n = 17 t-hCO neurons; *** P <0.0001) . f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев. событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001) . f, Awọn EPSC lẹẹkọkan (sEPSCs) ni hCO ati t-hCO awọn iṣan ni awọn osu 8 ti iyatọ ati titobi awọn oṣuwọn iṣẹlẹ synaptic (n = 25 hCO neurons, n = 17 t-hCO neurons; *** P <0.0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs) 17 t-hCO 神经元； *** P <0.0001）. f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P <0.0001）. f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев. событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). f, Awọn EPSC lẹẹkọkan (sEPSCs) ni awọn iṣan hCO ati t-hCO ni awọn osu 8 ti iyatọ ati iṣiro ti awọn oṣuwọn iṣẹlẹ synaptic (n = 25 hCO neurons, n = 17 t-hCO neurons; *** P <0.0001).Fun bf, hCO ati t-hCO ni laini 1208-2 ni a mu lati inu ipele iyatọ kanna ti a tọju ni afiwe. G, Gene ṣeto itupalẹ imudara (idanwo gangan ti ẹgbẹ kan) ti awọn Jiini ti ṣe atunṣe pupọ (ti a ṣe atunṣe P <0.05, iyipada agbo> 2, ti a fihan ni o kere ju 10% ti awọn ekuro) ni t-hCO glutamatergic neurons ni akawe pẹlu hCO glutamatergic neurons pẹlu awọn eto jiini ti awọn iṣẹ-ṣiṣe-pẹlẹpẹlẹ ti awọn mejeeji ERG ati idahun-jiini. ṣe idanimọ lati inu iwadii Asin in vivo16 ati awọn LRGs pato-eniyan lati awọn neurons in vitro17. G, Gene ṣeto itupalẹ imudara (idanwo gangan ti ẹgbẹ kan) ti awọn Jiini ti ṣe atunṣe pupọ (ti a ṣe atunṣe P <0.05, iyipada agbo> 2, ti a fihan ni o kere ju 10% ti awọn ekuro) ni t-hCO glutamatergic neurons ni akawe pẹlu hCO glutamatergic neurons pẹlu awọn eto jiini ti awọn iṣẹ-ṣiṣe-pẹlẹpẹlẹ ti awọn mejeeji ERG ati idahun-jiini. ṣe idanimọ lati inu iwadii Asin in vivo16 ati awọn LRGs pato-eniyan lati awọn neurons in vitro17. g, анализ обогащения набора генов. P <0,05, kratnosti изменя> 2, awọn ẹya ara ẹrọ diẹ ẹ sii ju 10% awọn ọdun sẹyin) глутаматергическими нейронами hCO наборы генов как раннего (ERG), так и позднего (LRG) генов, зависящитх идентифицированных в исследовании на мыshах in vivo16, и специфических для человека LRG из нейронов in vitro17. g, igbekale ti imudara eto ipilẹ-jiini (idanwo deede Fisher kan-tailed) ti awọn Jiini pẹlu imuṣiṣẹ pataki (ti a ṣe atunṣe P<0.05, iyipada agbo>2, ikosile ni o kere ju 10% ti awọn ekuro) ni t-hCO glutamatergic neurons ni akawe si awọn eto neurons hCO glutamatergic ti a mọ ti awọn mejeeji ni kutukutu (ERG) ati iṣẹ-igbẹkẹle 6 ni kutukutu (ERG) Awọn LRG ti eniyan kan pato lati awọn neuronu ni vitro17. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0.05，倍数变化>2,在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特异性LRG。 g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 神经 元 上舰：倍数> 2 ， 至少 至少 10%研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 1神经元 17 中 中 17 中 17的人类特异性LRG。 g, глутаматергические нейроны t-hCO были значительно ( скоррректированный P<0,05, кратность изменения> 2, не менее 10% Анализ обогащения набора генов Фишера) раннего ответа (ERG) и позднего гены, зависящие от активности ответа (LRG), awọn ẹya ara ẹrọ мыshах in vivo16 ati нейронах in vitro17. g, t-hCO glutamatergic neurons ni a ṣe atunṣe ni pataki ni akawe si awọn neurons hCO glutamatergic (ti a ṣe atunṣe P<0.05, iyipada agbo>2, o kere ju 10% Esi ni kutukutu (ERG) ati itupalẹ imudara jiini idahun ti o pẹ (idanwo gangan ti Fisher ti o ni ibatan kan) awọn jiini ti o gbẹkẹle iṣẹ ṣiṣe idahun (LRGs) ti a damọ ni pato ninu vitro1 eniyan. Awọn LRGs.Laini ti o ni aami tọkasi iye P ti atunse Bonferroni ti 0.05. h, GluN jiini ikosile (pseudo-package ati igbelosoke ti jiini kọọkan) jẹ iṣagbega ni pataki ni awọn ẹda snRNA-seq ti awọn jiini LRG ni awọn iṣan t-hCO glutamatergic. i, ajẹsara ti nfihan ikosile SCG2 ni t-hCO (oke) ati hCO (isalẹ) awọn iṣan. Awọn ọfa funfun tọka si awọn sẹẹli SCG2+. Pẹpẹ iwọn, 25 µm. Data ti wa ni kosile bi itumo ± boṣewa iyapa.
Da lori iṣẹ ṣiṣe ti o pọ si ti t-hCO ti a ṣe akiyesi ni awọn ege ex vivo, snRNA-seq ṣe afihan iṣagbega ti o gbẹkẹle iṣẹ ṣiṣe ti awọn iwe afọwọkọ jiini ni t-hCO ni akawe si hCO in vitro. Awọn neurons Glutamatergic t-hCO ṣe afihan awọn ipele ti o ga julọ ti awọn Jiini ti n ṣakoso iṣẹ ṣiṣe idahun pẹ (Fig. 2g, h), eyiti a rii ni awọn iwadii iṣaaju ni Asin ati awọn neurons eniyan16,17. Fun apẹẹrẹ, BDNF18, SCG2, ati OSTN, apilẹṣẹ-pipe-pato iṣẹ-iṣakoso-jiini, ṣe afihan ikosile ti o pọ si ni t-hCO neurons ti a fiwe si awọn neurons hCO (Fig. 2g-i). Nitorinaa, awọn iṣan t-hCO ṣe afihan awọn abuda idagbasoke ti imudara ni akawe si awọn iṣan hCO nipasẹ transcriptional, morphological, ati awọn itupalẹ iṣẹ.
Lati ṣe ayẹwo siwaju sii idapọ ti t-hCO maturation pẹlu idagbasoke ọpọlọ eniyan, a ṣe awọn afiwera transcriptomic ti awọn ọmọ inu oyun ati awọn iru sẹẹli cortical agbalagba19,20 ati agbalagba21,22 bii data ti o gbooro lori ikosile jiini cortical23 lakoko idagbasoke (awọn alaye gbooro, Fig. 5). ). pẹlu iṣẹ iṣaaju 24, agbaye hCO ati t-hCO transcriptome maturation ipo ni awọn oṣu 7-8 ti iyatọ ti o gbooro ni ibamu pẹlu akoko idagbasoke vivo ati pe o jẹ deede julọ si igbesi aye ọmọ inu oyun (Extended Data Fig. 5a). Paapaa, a ṣe akiyesi idagbasoke idagbasoke transcriptome ti o pọ si ni t-hCO ni akawe si hCO ti o baamu ọjọ-ori, bakanna bi imuṣiṣẹ transcriptome ti o ni nkan ṣe pẹlu synaptogenesis, astrogenesis, ati myelination (data ti o gbooro, Fig. 5b-d). Ni ipele cellular, a ri ẹri ti subtype cortex tinrin ni t-hCO, pẹlu awọn iṣupọ ti awọn neuronu glutamatergic ti o ni agbekọja pẹlu agbalagba L2/3, L5, ati L6 neuron subtypes (Figure 1i). Ni idakeji, iṣupọ iṣupọ laarin awọn iṣan t-hCO glutamatergic ati awọn neurons cortical oyun ti ni opin diẹ sii ni aarin-oyun (data ti o gbooro, Nọmba 5e-j). Lati pinnu boya awọn t-hCO neurons jẹ iṣẹ-ṣiṣe ti o jọra si awọn neurons neocortical postnatal eniyan, a ṣe awọn gbigbasilẹ electrophysiological ati awọn atunkọ anatomical ti eniyan L2/3 pyramidal neurons ni awọn apakan didasilẹ ti kotesi postnatal eniyan (data ti o gbooro, Fig. 7a). Awọn ohun-ini elero-ara ti L2 / 3 pyramidal neurons jẹ iru awọn ti t-hCO pyramidal neurons (data ti o gbooro, Fig. 7e). Morphologically, L2 / 3 neurons lati awọn ayẹwo eniyan postnatal jẹ diẹ sii si t-hCO ju hCO lọ, biotilejepe awọn sẹẹli L2 / 3 gun gun, ti o ni awọn ẹka diẹ sii ni apapọ, ati pe o ni iwuwo ọpa ẹhin ti o ga julọ (Fig. 3g ati data ti o gbooro, Fig. 7b-). G).
a, asopo ti hCO ti a ṣe nipasẹ iṣakoso ati awọn laini sẹẹli TS hiPS sinu awọn eku ọmọ tuntun. b, 3D atunkọ ti awọn iṣan t-hCO ti o kún fun biocytin lẹhin awọn osu 8 ti iyatọ. c, titobi ti ipari dendritic tumosi (n = 19 iṣakoso awọn iṣan, n = 21 TS neurons; ** P = 0.0041). d, Awọn ẹka dendritic ti 3D ti a tun ṣe lati iṣakoso ati TS t-hCO ni awọn osu 8 ti iyatọ, ati iṣiro ti density spine dendritic (n = 16 iṣakoso awọn iṣan, n = 21 TS neurons, *** P <0.0001). d, Awọn ẹka dendritic ti 3D ti a tun ṣe lati iṣakoso ati TS t-hCO ni awọn osu 8 ti iyatọ, ati iṣiro ti density spine dendritic (n = 16 iṣakoso awọn iṣan, n = 21 TS neurons, *** P <0.0001). d, 3D-реконструкция дендритных ветвей из котроля и TS t-hCO через плотности дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, 3D atunkọ ti awọn ẹka dendritic lati iṣakoso ati t-hCO TS ni awọn osu 8 ti iyatọ ati dendritic spine density quantification (n = 16 iṣakoso awọn iṣan, n = 21 TS neurons, *** P <0.0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化（n = 16 21 个TS 神经元，***P <0.0001）。 d 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p <0.0001 ）. d, 3D-реконструкция дендритных ветвей контроля и TS t-hCO через 8 плотности дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, 3D atunṣe ti awọn ẹka dendritic iṣakoso ati TS t-hCO ni awọn osu 8 ti iyatọ ati dendritic spine density quantification (n = 16 iṣakoso awọn iṣan, n = 21 TS neurons, *** P <0.0001).Awọn ami akiyesi pupa tọkasi awọn ọpa ẹhin dendritic putative. e, awọn EPSC lẹẹkọkan ni iṣakoso ati awọn neuronu TS t-hCO lẹhin awọn oṣu 8 ti iyatọ. f, Idite igbohunsafẹfẹ akojo ati iwọn igbohunsafẹfẹ ati titobi ti awọn iṣẹlẹ synapti (n = 32 awọn iṣan iṣakoso, n = 26 TS neurons; ** P = 0.0076 ati P = 0.8102). g, Ayẹwo Scholl ti TS ati awọn iṣan iṣakoso ni hCO ati t-hCO. Awọn ila ti o da silẹ fihan eniyan L2/3 awọn iṣan pyramidal postnatal fun lafiwe (n = 24 iṣakoso t-hCO neurons, n = 21 TS t-hCO neurons, n = 8 iṣakoso hCO neurons, ati n = 7 TS hCO neurons). Data ti wa ni kosile bi aropin ± boṣewa iyapa
Agbara t-hCO lati ṣe atunṣe awọn ẹya ara ẹrọ ti iṣan ati iṣẹ-ṣiṣe ti awọn neurons cortex eniyan ni ipele ti o ga julọ jẹ ki a ṣawari boya t-hCO le ṣee lo lati ṣawari awọn phenotypes arun. A dojukọ TS, rudurudu idagbasoke neurodevelopment ti o lagbara ti o fa nipasẹ awọn iyipada ere-ti-iṣẹ ninu jiini fifi koodu CaV1.2, eyiti o bẹrẹ transcription jiini ti o gbẹkẹle iṣẹ ni awọn neuronu. A gba hCO lati ọdọ awọn alaisan TS mẹta ti o gbe iyipada ti o wọpọ julọ (p.G406R) ati awọn iṣakoso mẹta (Fig. 3a). Lẹhin gbigbejade, a rii pe a ti yipada morphology dendritic ni awọn neurons TS ti a fiwe si awọn iṣakoso (Fig. 3b ati data ti o gbooro, Fig. 8a,b), pẹlu ilosoke meji ni nọmba ti awọn dendrites akọkọ ati ilosoke apapọ ni apapọ ati idinku apapọ ni ipari dendritic (Fig. 3c ati data ti o gbooro, Fig. 8c). Eyi ni nkan ṣe pẹlu iwuwo ti o pọ si ti awọn ọpa ẹhin ati igbohunsafẹfẹ ti o pọ si ti EPSCs lẹẹkọkan ni TS ni akawe si awọn neuronu iṣakoso (Fig. 3d-f ati data gbooro, Fig. 8g). Itupalẹ siwaju sii ṣafihan awọn ilana ti eka dendritic ajeji ni t-hCO TS ni akawe si awọn iṣakoso, ṣugbọn kii ṣe in vitro TS hCO ni ipele ti o jọra ti iyatọ (Fig. 3g). Eyi ni ibamu pẹlu awọn ijabọ iṣaaju wa ti iṣẹ-igbẹkẹle dendritic shrinkage ni TS ati ṣe afihan agbara ti iru ẹrọ asopo yii lati ṣe awari awọn phenotypes arun ni vivo.
Lẹhinna a beere si iwọn wo ni awọn sẹẹli t-hCO ṣe ni iṣẹ ṣiṣe sinu eku S1. S1 ninu awọn rodents gba awọn igbewọle synapti ti o lagbara lati basal ventral ventral ipsilateral ati awọn ekuro thalamic ti ẹhin, bakanna bi ọkọ ayọkẹlẹ ipsilateral ati awọn cortices somatosensory keji, ati S1 ti o lodi si (Fig. 4a). Lati mu ilana innervation pada sipo, a ni akoran hCO pẹlu virus rabies-dG-GFP/AAV-G ati gbigbe hCO sinu eku S1 ni ọjọ mẹta lẹhinna. A ṣe akiyesi ikosile GFP ipon ni awọn neuronu ti S1 ipsilateral ati ventral basal ganglia 7-14 ọjọ lẹhin gbigbe (Fig. 4b, c). Ni afikun, abawọn antibody ti ami ami thalamic netrin G1 ṣafihan wiwa awọn opin thalamic ni t-hCO (Fig. 4d, e). Lati ṣe iṣiro boya awọn asọtẹlẹ afferent wọnyi le gbejade awọn idahun synapti ni awọn sẹẹli t-hCO, a ṣe gbogbo awọn gbigbasilẹ sẹẹli lati awọn sẹẹli eniyan ni awọn apakan didasilẹ ti Layer thalamocortical. Imudara itanna ti eku S1, capsule inu, ọrọ funfun, awọn okun ti o sunmọ t-hCO tabi imuṣiṣẹ optogenetic ti opsin-fifihan awọn ipari thalamic ni t-hCO ti o fa awọn EPSC kukuru-latency ni t-hCO neurons ti o farahan si antagonist olugba AMPA NBQX. (Fig. 4f, g ati data ti o gbooro sii, aworan 9a-g). Awọn data wọnyi ṣe afihan pe t-hCO ti ṣepọ ni anatomically sinu ọpọlọ eku ati pe o ni anfani lati muu ṣiṣẹ nipasẹ àsopọ agbalejo eku.
a, Sikematiki aworan atọka ti a rabies ipasẹ ṣàdánwò. b, GFP ati eniyan-pato STEM121 ikosile laarin t-hCO ati eku cerebral kotesi (pane oke). Paapaa ti a fihan ni ikosile GFP ninu eku ventral basal nucleus (VB) (isalẹ apa osi) ati ipsilateral S1 (isalẹ ọtun). Pẹpẹ iwọn, 50 µm. Awọn onigun mẹrin pupa jẹ aṣoju awọn agbegbe ti ọpọlọ nibiti a ti ya awọn aworan. c, titobi awọn sẹẹli ti n ṣalaye GFP (n = 4 eku). d, e - Netrin G1 + thalamic ebute ni t-hCO. d ṣe afihan apakan iṣọn-ọrọ ti o ni t-hCO ati awọn ekuro VB. Pẹpẹ iwọn, 2 mm. e fihan Netrin G1 ati STEM121 ikosile ni t-hCO (osi) ati VB (ọtun) awọn iṣan. Pẹpẹ iwọn, 50 µm. Laini aami osan tọkasi aala t-hCO. f, g, Awọn itọpa lọwọlọwọ ti t-hCO neurons lẹhin imudara itanna ni S1 rat (f) tabi capsule inu (g), pẹlu (eleyi ti) tabi laisi (dudu) NBQX (osi). Awọn titobi EPSC pẹlu ati laisi NBQX (n = 6 S1 neurons, * P = 0.0119; ati n = 6 awọn iṣan inu capsule inu, ** P = 0.0022) (aarin). Ogorun ti t-hCO neurons ti o nfihan EPSC ni idahun si imudara itanna ti eku S1 (f) tabi capsule inu (g) ​​(ọtun). aCSF, ito cerebrospinal atọwọda. h, aworan atọka ti idanwo aworan 2P (osi). Ikosile ti GCaMP6s ni t-hCO (arin). Pẹpẹ iwọn, 100 µm. Ilọkuro akoko Fuluorescence ti GCaMP6s (ọtun). i, Z-Dimegilio ti lẹẹkọkan iṣẹ-ṣiṣe fluorescence. j, apejuwe sikematiki ti imumi mustache. k, z-saami 2P fluorescence trajectories ninu idanwo kan, ti o ni ibamu pẹlu iyapa whisker ni akoko odo (laini fifọ) ni apẹẹrẹ awọn sẹẹli. l, awọn idahun z-score ti iye olugbe ti gbogbo awọn sẹẹli ti o ni ibamu pẹlu iyapa whisker ni odo akoko (ila ti a ya) (pupa) tabi awọn akoko ti ipilẹṣẹ laileto (grẹy). m. Aworan atọka ti adanwo lori isamisi opitika. n, Aise foliteji ekoro lati ẹya apẹẹrẹ t-hCO cell nigba bulu lesa fọwọkan tabi whisker deflection. Awọn itọka pupa tọkasi awọn spikes akọkọ ti o ṣẹlẹ nipasẹ ina (oke) tabi ti o ṣẹlẹ nipasẹ itusilẹ whisker (isalẹ). Iboji grẹy tọkasi awọn akoko iyipada whisker. o, Awọn ọna igbi ina ti o ga julọ ati awọn idahun iyipada whisker. p, awọn spikes ti igbiyanju ẹyọkan, ni ibamu pẹlu iyapa ti awọn whiskers ninu awọn sẹẹli ti apẹẹrẹ. 0 tọkasi iyapa whisker (ila ti a fi silẹ). q, oṣuwọn fifin ni aropin olugbe-z-score fun gbogbo awọn sẹẹli ti o ni itara, ti o ni ibamu pẹlu iyapa whisker ni akoko odo (ila ti a ya) (pupa) tabi laileto ti ipilẹṣẹ timestamps (grẹy). r, Ipin ti awọn ẹya ara fọto ti o ṣe pataki nipasẹ iyapa whisker (n = 3 eku) (osi). Peak z-score lairi (n = 3 eku; n = 5 (awọ ewe ina), n = 4 (alawọ ewe dudu), ati n = 4 (cyan) awọn iwọn iyipada iyipada whisker fun eku) (ọtun). Data ti wa ni kosile bi itumo ± boṣewa iyapa
Lẹhinna a beere boya t-hCO le mu ṣiṣẹ nipasẹ awọn itara ifarako ni vivo. A gbin hCO ti n ṣalaye awọn itọka kalisiomu ti a fiweranṣẹ ti Jiini sinu awọn eku S1. Lẹhin awọn ọjọ 150, a ṣe photometry fiber tabi aworan kalisiomu meji-photon (Fig. 4h ati data ti o gbooro, Fig. 10a). A rii pe awọn sẹẹli t-hCO ṣe afihan iṣẹ ṣiṣe rhythmic amuṣiṣẹpọ (Nọmba 4i, Data ti o gbooro, Nọmba 10b ati Fidio Afikun 1). Lati ṣe afihan iṣẹ-ṣiṣe t-hCO tente oke, a ṣe awọn igbasilẹ elekitirosiolojiki elekitirosi ni awọn eku asopo ti anesthetized (data ti o gbooro, Fig. 10c-f). A ti ipilẹṣẹ awọn ipoidojuko stereotaxic lati awọn aworan MRI; bayi, awọn wọnyi ti o ti gbasilẹ sipo soju putative eda eniyan iṣan, biotilejepe electrophysiology nikan ko ni gba a eya ti Oti lati wa ni pinnu. A ṣe akiyesi awọn ikọlu amuṣiṣẹpọ ti iṣẹ-ṣiṣe (data ti o gbooro, eeya. 10d). Awọn ti nwaye fi opin si nipa 460 ms ati pe a yapa nipasẹ awọn akoko ipalọlọ ti iwọn 2 s (data ti o gbooro, Fig. 10d, e). Olukuluku sipo lenu ise ni aropin ti nipa meta iyipo fun nwaye, eyi ti o jẹ to 73% ti aami-sipo fun nwaye. Awọn iṣẹ-ṣiṣe ti awọn ẹya ara ẹni kọọkan ni o ni ibamu pupọ, ati pe awọn atunṣe wọnyi ga ju awọn ti awọn ẹya ti a mọ ni awọn ẹranko ti ko ni ajẹsara ti o gbasilẹ labẹ awọn ipo kanna (data ti o gbooro, Fig. 10f). Lati ṣe afihan siwaju sii awọn idahun iwasoke ti awọn neuronu ti o jẹ ti eniyan ti a ṣe idanimọ, a ṣe awọn idanwo fifi aami si ina lori awọn eku ti a ti gbin pẹlu hCO ti n ṣalaye ikanni cation rhodopsin 2 (hChR2) ti o ni imọra-imọlẹ, nipasẹ eyiti t-hCO neurons ti idanimọ igba kukuru (kere ju 10 ms) ni idahun si ina buluu). t-hCO neurons ṣe afihan awọn iṣẹ-ṣiṣe lẹẹkọkan ni awọn igbohunsafẹfẹ ti o jọra si awọn ti a ṣe akiyesi ni aworan kalisiomu, bakanna bi awọn gbigbasilẹ elekitirojioloji ti a ṣe ni t-hCO ni aini ti isamisi ina (data ti o gbooro, Fig. 10c-g). Ko si iṣẹ-ṣiṣe lẹẹkọkan ti a ṣe akiyesi ni awọn ipele ti o baamu ti hCO ti o gbasilẹ ni vitro. Lati ṣe ayẹwo boya t-hCO le muu ṣiṣẹ nipasẹ awọn itara ifarako, a ni ṣoki ni ṣoki awọn whiskers eku kuro lati t-hCO (Fig. 4j, m ati data gbooro, Fig. 10h,k). Gẹgẹbi awọn ẹkọ ti tẹlẹ8,10, ipin kan ti awọn sẹẹli t-hCO ṣe afihan iṣẹ ṣiṣe ti o pọ si ni idahun si iṣipopada whisker, eyiti a ko ṣe akiyesi nigbati data ti a ṣe afiwe pẹlu awọn ontẹ akoko laileto (Fig. 4k-q ati data gbooro, Fig. 10h-q). Nitootọ, nipa 54% ti awọn ẹya ẹyọkan ti opto-aami ṣe afihan iwọn arousal ti o pọ si ni pataki lẹhin imudara whisker, ti o ga ni iwọn 650 ms (Fig. 4r). Papọ, awọn data wọnyi daba pe t-hCO gba awọn igbewọle iṣẹ ṣiṣe ti o yẹ ati pe o le muu ṣiṣẹ nipasẹ awọn iwuri ayika.
Lẹhinna a ṣe iwadii boya t-hCO le mu awọn iyika ṣiṣẹ ni awọn eku lati ṣakoso ihuwasi. A kọkọ ṣe iwadii boya awọn axon ti t-hCO neurons ṣe iṣẹ akanṣe sinu awọn iṣan agbegbe ti eku. A ko arun hCO pẹlu lentivirus fifi koodu hChR2 dapọ si EYFP (hChR2-EYFP). Lẹhin awọn ọjọ 110, a ṣe akiyesi ikosile EYFP ni awọn agbegbe cortical ipsilateral, pẹlu igbọran, motor, ati awọn cortices somatosensory, bakannaa ni awọn agbegbe subcortical, pẹlu striatum, hippocampus, ati thalamus (Fig. 5a). Lati ṣe ayẹwo boya awọn asọtẹlẹ efferent wọnyi le gbejade awọn idahun synapti ni awọn sẹẹli eku, a mu ṣiṣẹ optically t-hCO awọn sẹẹli ti n ṣalaye hChR2-EYFP nipa gbigbasilẹ awọn sẹẹli kotesi cerebral eku ni awọn apakan ọpọlọ didasilẹ. Imuṣiṣẹ ti awọn axons t-hCO pẹlu ina buluu ti o fa awọn EPSCs kukuru kukuru ni awọn neurons cortex eku pyramidal, eyiti a dina nipasẹ NBQX (Figs. 5b-g). Ni afikun, awọn idahun wọnyi le dina nipasẹ tetrodotoxin (TTX) ati mu pada nipasẹ 4-aminopyridine (4-AP), ni iyanju pe wọn ṣẹlẹ nipasẹ awọn asopọ monosynaptic (Fig. 5e).
a, Aworan atọka ti ipasẹ axon (osi). t-hCO EYFP ikosile (ọtun). Pẹpẹ iwọn, 100 µm. A1, kotesi igbọran, ACC, kotesi cingulate iwaju, d. striatum, dorsal striatum, HPC, hippocampus; Diaphragm, septum ita, mPFC, kotesi prefrontal aarin, piri, piriform cortex, v. striatum, ventral striatum, VPM, ventropostomedial nucleus of the thalamus, VTA, ventral tegmental region. Awọn onigun mẹrin pupa jẹ aṣoju awọn agbegbe ti ọpọlọ nibiti a ti ya awọn aworan. b, Aworan atọka ti idanwo iwuri. c, d, Awọn apẹẹrẹ ti esi ti bulu ina-induced photocurrent (oke) ati foliteji (isalẹ) ninu eda eniyan (c) EYFP + t-hCO tabi eku (d) EYFP- ẹyin. e, f, Awọn itọpa lọwọlọwọ ti awọn neuronu eku lẹhin imudara ina bulu ti t-hCO axons pẹlu TTX ati 4-AR (alawọ ewe), TTX (grẹy) tabi aCSF (dudu) (e), pẹlu (violet) tabi laisi (dudu) )) NBQX (e). g, lairi awọn idahun ti o fa nipasẹ ina bulu ninu awọn sẹẹli eku (n = awọn sẹẹli 16); petele ifi tọkasi apapọ lairi (7.13 ms) (osi). Iwọn ti awọn EPSC ti o ni ina ti o gbasilẹ pẹlu tabi laisi NBQX (n = awọn sẹẹli 7; *** P <0.0001) (arin). Iwọn ti awọn EPSC ti o ni ina ti o gbasilẹ pẹlu tabi laisi NBQX (n = awọn sẹẹli 7; *** P <0.0001) (arin). Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; *** P <0,0001) (в центре). Iwọn ti awọn EPSC ti o ni ina ti o gbasilẹ pẹlu tabi laisi NBQX (n = awọn sẹẹli 7; *** P <0.0001) (aarin).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P <0.0001）（中）。使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P <0.0001）（中）。 Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; *** P <0,0001) (в центре). Iwọn ti awọn EPSC ti o ni ina ti o gbasilẹ pẹlu tabi laisi NBQX (n = awọn sẹẹli 7; *** P <0.0001) (aarin).Ogorun awọn sẹẹli eku ti n ṣafihan awọn EPSC ti o dahun si ina bulu (ọtun). h, Aworan atọka ti iṣẹ iṣe ihuwasi. d0, ojo 0. i. Ṣiṣe awọn ẹranko apẹẹrẹ ni ọjọ 1 (osi) tabi ọjọ 15 (ọtun) ti ikẹkọ. Nọmba apapọ awọn licks ti a ṣe ni ọjọ 1 (osi) tabi ọjọ 15 (aarin ọtun) (n = 150 awọn idanwo ina buluu, n = 150 awọn idanwo ina pupa; *** P <0.0001). Nọmba apapọ awọn licks ti a ṣe ni ọjọ 1 (osi) tabi ọjọ 15 (aarin ọtun) (n = 150 awọn idanwo ina buluu, n = 150 awọn idanwo ina pupa; *** P <0.0001). Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) tabi день 15 (в центре справа) n = 150 испытаний с красным светом; *** P <0,0001). Nọmba apapọ awọn licks ti a ṣe ni ọjọ 1 (osi) tabi ọjọ 15 (apa ọtun aarin) (n = 150 awọn idanwo ina bulu, n = 150 awọn idanwo ina pupa; *** P <0.0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；***P <0.0001）。第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；***P <0.001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) tabi день 15 (в центре справа) n = 150 испытаний с красным светом; *** P <0,0001). Nọmba apapọ awọn licks ti a ṣe ni ọjọ 1 (osi) tabi ọjọ 15 (apa ọtun aarin) (n = 150 awọn idanwo ina bulu, n = 150 awọn idanwo ina pupa; *** P <0.0001).Akopọ licks fun pupa ati awọn idanwo ina bulu ni ọjọ 1 (aarin osi) tabi ọjọ 15 (ọtun). NS, kii ṣe pataki. j,k, Awọn abuda ihuwasi ti gbogbo awọn ẹranko ti a gbe pẹlu t-hCO ti n ṣalaye hChR2-EYFP (j) tabi iṣakoso fluorophore (k) ni ọjọ 1 tabi 15 (hChR2-EYFP: n = 9 eku, ** P = 0.0049; iṣakoso: n = 9, P = 0.1497). l, Itankalẹ ti Dimegilio ayanfẹ (n = 9 hChR2, n = 9 iṣakoso; ** P <0.001, *** P <0.0001). l, Itankalẹ ti Dimegilio ayanfẹ (n = 9 hChR2, n = 9 iṣakoso; ** P <0.001, *** P <0.0001). l, Эvolyutsyya awọn ohun elo ti o pọju (n = 9 hChR2, n = 9 kontrolnыh; ** P <0,001, *** P <0,0001). l, Itankalẹ ti Dimegilio ayanfẹ (n = 9 hChR2, n = awọn idari 9; ** P <0.001, *** P <0.0001). l. l. l, Эvolюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 kontroley; ** P <0,001, *** P <0,0001). l, Itankalẹ ti awọn ikun ayanfẹ (n = 9 hChR2, n = awọn idari 9; ** P <0.001, *** P <0.0001).m, FOS ikosile ni idahun si imuṣiṣẹ optogenetic ti t-hCO ni S1. Awọn aworan ti ikosile FOS (osi), ati titobi (n = 3 fun ẹgbẹ kan; * P <0.05, ** P <0.01 ati *** P <0.001) (ọtun) ti han. Awọn aworan ti ikosile FOS (osi), ati titobi (n = 3 fun ẹgbẹ kan; * P <0.05, ** P <0.01 ati *** P <0.001) (ọtun) ti han. Показаны изображения эkspressi FOS (sleva) ati awọn ohun elo ti o pọju (n = 3 на групу); * P <0,05, ** P <0,01 , P <0,01 Awọn aworan ti ikosile FOS (osi) ati titobi (n = 3 fun ẹgbẹ kan; * P <0.05, ** P <0.01, ati *** P <0.001) ti han (ọtun).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P <0.05、**P <0.01 和***P <0.001））右）显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P <0.05、**P <0.01 和***P <0.001））右） Показаны изображения эkspressi FOS (sleva) ati awọn ohun elo ti o pọju (n = 3 на групу); * P <0,05, ** P <0,01 , P <0,01 Awọn aworan ti ikosile FOS (osi) ati titobi (n = 3 fun ẹgbẹ kan; * P <0.05, ** P <0.01, ati *** P <0.001) ti han (ọtun).Pẹpẹ iwọn, 100 µm. Awọn data jẹ afihan bi itumọ ± aṣiṣe boṣewa ti BLA, tonsil basolateral, MDT, dorsomedial thalamic nucleus, PAG, grẹy periaqueductal.
Lakotan, a beere boya t-hCO le ṣatunṣe ihuwasi eku. Lati ṣe idanwo eyi, a ti gbe hChR2-EYFP-ṣafihan hCO sinu S1, ati awọn ọjọ 90 lẹhinna, a fi awọn okun opiti sinu t-hCO fun ifijiṣẹ ina. Lẹhinna a ṣe ikẹkọ awọn eku pẹlu ilana imudani ẹrọ ti a ṣe atunṣe (Fig. 5h). A gbe awọn ẹranko sinu iyẹwu idanwo ihuwasi ati lo laileto 5 buluu keji (473 nm) ati pupa (635 nm) awọn iyanju laser. Awọn ẹranko gba ẹsan omi ti wọn ba la lakoko imudara ina bulu ṣugbọn ko la lakoko imudara ina pupa. Ni ọjọ akọkọ ti ikẹkọ, awọn ẹranko ko ṣe afihan iyatọ ninu fipa nigbati o ba ni itara pẹlu bulu tabi ina pupa. Bibẹẹkọ, ni ọjọ 15, awọn ẹranko ti a gbin pẹlu hCO ti n ṣalaye hChR2-EYFP ṣe afihan finnifinni ti nṣiṣe lọwọ diẹ sii nigbati o ba ni itara pẹlu ina bulu ni akawe si imudara ina pupa. Awọn iyipada wọnyi ni ihuwasi fifenula ni a ko ṣe akiyesi ni awọn ẹranko iṣakoso ti a gbin pẹlu hCO ti n ṣalaye fluorophore iṣakoso (oṣuwọn aṣeyọri ẹkọ: hChR2 89%, EYFP 0%, Nọmba 5i-1 ati Fidio Afikun 2). Awọn data wọnyi daba pe awọn sẹẹli t-hCO le mu awọn neuronu eku ṣiṣẹ lati mu ihuwasi wiwa ẹsan ṣiṣẹ. Lati wa iru awọn iyika iṣan t-hCO eku le ni ipa ninu awọn iyipada ihuwasi wọnyi, a mu ṣiṣẹ optogenetically t-hCO ni awọn ẹranko ti o ti kọ ati awọn tissu ikore ni iṣẹju 90 lẹhinna. Immunohistochemistry ṣe afihan ikosile ti amuaradagba FOS ti o gbẹkẹle iṣẹ-ṣiṣe ni ọpọlọpọ awọn agbegbe ọpọlọ ti o ni ipa ninu ihuwasi iwuri, pẹlu aarin prefrontal kotesi, medial thalamus, ati ọrọ grẹy periaqueductal, eyiti o ṣafihan boya ni awọn ẹranko iṣakoso ailagbara tabi ninu awọn ẹranko. iresi. 5m). Papọ, data wọnyi daba pe t-hCO le ṣe atunṣe iṣẹ ṣiṣe neuronal eku lati wakọ ihuwasi.
Awọn organoids Neural ṣe aṣoju eto ti o ni ileri fun kikọ idagbasoke eniyan ati arun in vitro, ṣugbọn wọn ni opin nipasẹ aini awọn asopọ laarin awọn iyika ti o wa ni vivo. A ti ṣe agbekalẹ pẹpẹ aramada kan ninu eyiti a ti gbe hCO sinu S1 ti ajẹsara ajẹsara awọn eku tete lẹhin ibimọ lati ṣe iwadi idagbasoke sẹẹli eniyan ati iṣẹ ni vivo. A ti fihan pe t-hCO ndagba awọn iru sẹẹli ti o dagba ko ṣe akiyesi ni vitro28 ati pe t-hCO jẹ anatomically ati iṣẹ ṣiṣe sinu ọpọlọ rodent. Ijọpọ ti t-hCO sinu awọn iyika neural rodent gba wa laaye lati fi idi ọna asopọ kan mulẹ laarin iṣẹ ṣiṣe cellular eniyan ati ihuwasi ẹranko, ti n fihan pe awọn iṣan t-hCO le ṣe atunṣe iṣẹ ṣiṣe neuronal eku lati wakọ awọn idahun ihuwasi.
Syeed ti a ṣapejuwe ni ọpọlọpọ awọn anfani lori iwadii iṣaaju lori gbigbe awọn sẹẹli eniyan sinu awọn opolo rodent. Ni akọkọ, a gbin hCO sinu kotesi to sese ndagbasoke ti awọn eku ọmọ lẹhin ibimọ ni kutukutu, eyiti o le dẹrọ anatomical ati isọpọ iṣẹ. Ni ẹẹkeji, t-hCO MRI ibojuwo gba wa laaye lati ṣe iwadi ipo alọmọ ati idagbasoke ninu awọn ẹranko laaye, gbigba wa laaye lati ṣe awọn iwadii ẹranko-pupọ igba pipẹ ati fi idi igbẹkẹle ti awọn laini sẹẹli hiPS pupọ. Nikẹhin, a ṣe gbigbe awọn ohun alumọni ti ko tọ, dipo awọn idaduro sẹẹli kan ti o ya sọtọ, eyiti ko ni iparun si awọn sẹẹli eniyan ati pe o le ṣe igbelaruge iṣọpọ ati iran ti awọn neuronu kotesi eniyan ni ọpọlọ eku.
A jẹwọ pe laibikita awọn ilọsiwaju ninu pẹpẹ yii, akoko, aye, ati awọn idiwọ awọn ẹya ara-agbelebu ṣe idiwọ dida awọn iyika nkankikan eniyan pẹlu ifaramọ giga, paapaa lẹhin gbigbe ni ipele ibẹrẹ ti idagbasoke. Fun apẹẹrẹ, ko ṣe afihan boya iṣẹ-ṣiṣe lẹẹkọkan ti a ṣe akiyesi ni t-hCO duro fun phenotype idagbasoke kan ti o jọra si iṣẹ rhythmic ti a ṣe akiyesi lakoko idagbasoke cortical, tabi boya o jẹ nitori isansa ti awọn iru sẹẹli ti o dinku ti o wa ni t-hCO. Bakanna, ko ṣe kedere si kini iye isansa ti lamination ni t-hCO ni ipa lori asopọ pq30. Iṣẹ iwaju yoo dojukọ lori sisọpọ awọn iru sẹẹli miiran bii microglia eniyan, awọn sẹẹli endothelial eniyan, ati awọn ipin ti o yatọ ti awọn interneurons GABAergic bi a ṣe han nipa lilo apejọ 6 in vitro, bakanna bi agbọye bii isọpọ ati iṣelọpọ le waye ni t-hCO ti o yipada. transcriptional, synaptic ati awọn ipele ihuwasi ninu awọn sẹẹli ti a gba lati ọdọ awọn alaisan.
Lapapọ, eyi ni ipilẹ vivo ṣe aṣoju awọn orisun ti o lagbara ti o le ṣe ibamu si idagbasoke ọpọlọ eniyan ni fitiro ati iwadii arun. A nireti pe iru ẹrọ yii yoo gba wa laaye lati ṣe iwari aramada-ipele phenotypes ni bibẹẹkọ awọn sẹẹli ti o ni itọsi alaisan ati idanwo awọn ilana itọju ailera tuntun.
A ṣe ipilẹṣẹ hCO2.5 lati awọn sẹẹli HiPS gẹgẹbi a ti ṣalaye tẹlẹ. Lati pilẹṣẹ iṣelọpọ hCO lati awọn sẹẹli hiPS ti a gbin lori awọn fẹlẹfẹlẹ atokan, awọn ileto ti o wa ni mimu ti awọn sẹẹli hiPS ni a yọkuro kuro ninu awọn ounjẹ aṣa ni lilo isọnu (0.35 mg/mL) ati gbe lọ si awọn aṣa ṣiṣu asomọ ultra-kekere ti o ni awọn ounjẹ pẹlu alabọde aṣa sẹẹli hiPS. (Corning) ṣe afikun pẹlu awọn inhibitors SMAD meji dorsomorphine (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) ati SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) ati inhibitor ROCK Y-27632 (10 μM; S1049), Selleckchem. Lakoko awọn ọjọ 5 akọkọ, alabọde sẹẹli hiPS ti yipada lojoojumọ ati dorsomorphine ati SB-431542 ni a ṣafikun. Ni ọjọ kẹfa ni idaduro, awọn spheroids neural ni a gbe lọ si alabọde neural ti o ni neurobasal-A (10888, Life Technologies), afikun B-27 laisi Vitamin A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1: 100, Awọn Imọ-ẹrọ Igbesi aye), penicillin ati streptomycin (1: 100, Awọn imọ-ẹrọ Life) ati afikun 2 pẹlu EGF. R & D Systems) ati fibroblast idagba ifosiwewe 2 (FGF2; 20 ng ml-1; R & D Systems) titi di ọjọ 24. Lati ọjọ 25 si ọjọ 42, alabọde ti wa ni afikun pẹlu ọpọlọ-ọpọlọ neurotrophic ifosiwewe (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) ati awọn neurotrophin 3 (NT3); - 20 milimita ni gbogbo ọjọ miiran neurotrophin. Ni ọjọ kẹfa ni idaduro, awọn spheroids neural ni a gbe lọ si alabọde neural ti o ni neurobasal-A (10888, Life Technologies), afikun B-27 laisi Vitamin A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1: 100, Awọn Imọ-ẹrọ Igbesi aye), penicillin ati streptomycin (1: 100, Awọn imọ-ẹrọ Life) ati afikun 2 pẹlu EGF. R & D Systems) ati fibroblast idagba ifosiwewe 2 (FGF2; 20 ng ml-1; R & D Systems) titi di ọjọ 24. Lati ọjọ 25 si ọjọ 42, alabọde ti wa ni afikun pẹlu ọpọlọ-ọpọlọ neurotrophic ifosiwewe (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) ati awọn neurotrophin 3 (NT3); - 20 milimita ni gbogbo ọjọ miiran neurotrophin.Ni ọjọ kẹfa ni idaduro, awọn spheroids neural ni a gbe lọ si alabọde ti iṣan ti o ni Neurobasal-A (10888, Life Technologies), afikun B-27 laisi Vitamin A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1: 100, Life Technologies), penicillin.ati streptomycin (1: 100, Life Technologies) ati dopolnenы эpydermalnыm phaktorom rosta (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) ati awọn ẹya ara ẹrọ 20. (FGF2; 20 нг/мл; R&D Systems) lati 24-го дня. ati streptomycin (1: 100, Awọn Imọ-ẹrọ Igbesi aye) ati afikun pẹlu ifosiwewe idagba epidermal (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) ati ifosiwewe idagba fibroblast 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) titi di ọjọ 24.Lati awọn ọjọ 25 si 42, ifosiwewe neurotrophic ti ọpọlọ (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) ati neurotrophin 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) ni a ṣafikun si alabọde, yiyipada alabọde ni gbogbo ọjọ miiran.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888፣Life Technologies）、不含维生素A 的 B-27，剡剡8剡8 Awọn ọna ẹrọ), GlutaMax (1:100, Awọn Imọ-ẹrọ Igbesi aye) Imọ ọna ẹrọ）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；R&D Systems）和成纤维细胞生长因子2（FGF2； Awọn ọna ṣiṣe) 直至第24在 浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 ， Imọ-ẹrọ Aye４补充剂 (12587 ， Life Technologies）) Glutamax （1: 100生长 因子 (； 20 ng ml-1 ； r & d Systems） 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 На 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейробазазал-А (10888), дузены 7 Life Technologies витамина А (12587, Awọn Imọ-ẹrọ Igbesi aye), GlutaMax (1: 100, Awọn Imọ-ẹrọ Igbesi aye), awọn ohun elo imọ-ẹrọ ti o niiṣe pẹlu awọn ohun elo ti o ni imọran (1: 100, Awọn Imọ-ẹrọ Igbesi aye) le ṣe pataki фактора роста (EGF; 20 нг мл-1; R&D Systems) ati фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг мл-1) 1; Ni ọjọ 6, awọn idaduro neurosphere ni a yipada si afikun ti o ni neurobasal-A (10888, Life Technologies), afikun B-27 laisi Vitamin A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1: 100, Life Technologies), penicillin-neutralized streptomycin (1: 100; Life Technologies) ti o ni afikun pẹlu epider R&MlD. Awọn ọna ṣiṣe) ati ifosiwewe idagba fibroblast 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1; R&D Systems) lati 24-го дня. Awọn ọna R&D) titi di ọjọ 24.Lati awọn ọjọ 25 si 42, ifosiwewe neurotrophic ti ọpọlọ (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) ati neurotrophic ifosiwewe 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) ni a ṣafikun si alabọde aṣa ni gbogbo ọjọ miiran. Alabọde yipada lẹẹkan.Bibẹrẹ lati ọjọ 43, hCO ni itọju ni aipe neurobasal-A alabọde (NM; 1088022, Thermo Fisher) pẹlu iyipada alabọde ni gbogbo ọjọ 4-6. Lati gba hCO lati awọn sẹẹli hiPS ti a gbin labẹ awọn ipo ti ko ni ifunni, awọn sẹẹli hiPS ni a fi sii pẹlu Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) ni 37 ° C fun awọn iṣẹju 7, ti a pin si awọn sẹẹli ẹyọkan, ati ti a fi sii lori awọn awopọ AggreWell 800 (34815, STEMCELL Technologies) ni iwuwo ti awọn sẹẹli 3 × 18 ti o ni afikun si awọn sẹẹli 3 × 18. ROCK inhibitor Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Lẹhin awọn wakati 24, awọn media ti o wa ninu awọn kanga ti wa ni pipe si oke ati isalẹ sinu media ti o ni Awọn ibaraẹnisọrọ 6 media (A1516401, Life Technologies) ti o ni afikun pẹlu dorsomorphine (2.5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) ati SB-431542 (10 μM; 1614). , Tocrida). Lati awọn ọjọ 2 si 6, alabọde pataki 6 ti rọpo lojoojumọ pẹlu dorsomorphine ati afikun SB-431542. Lati ọjọ kẹfa, awọn idadoro neurosphere ni a gbe lọ si alabọde neurobasal ati ṣetọju bi a ti salaye loke.
Gbogbo awọn ilana ẹranko ni a ṣe ni ibamu pẹlu awọn ilana itọju ẹranko ti a fọwọsi nipasẹ Igbimọ Isakoso Itọju Ẹranko ti Ile-ẹkọ giga ti Stanford University (APAC). Awọn eku euthymic RNU (rnu/+) ti o loyun ni wọn ra (Charles River Laboratories) tabi gbele. Awọn ẹranko ni a tọju lori iwọn ina-okunkun wakati 12 pẹlu ounjẹ ati ipolowo libitum omi. Ìhoho (FOXN1–/-) awọn ọmọ aja eku ti ọjọ-ori mẹta si ọjọ meje ni a damọ nipasẹ idagba ti awọn whiskers ti ko dagba ṣaaju ki o to ge. Awọn ọmọ aja (ọkunrin ati obinrin) jẹ anesthetized pẹlu 2-3% isoflurane ati gbe sori fireemu stereotaxic kan. Atẹgun ti agbárí pẹlu iwọn ila opin ti isunmọ 2-3 mm loke S1 ni a ṣe lakoko mimu iduroṣinṣin ti dura mater. Lẹhinna lo abẹrẹ 30-G (isunmọ 0.3 mm) ni ita ti craniotomy lati gun dura naa. Lẹhinna lo HCO si parafilm 3 × 3 cm tinrin ki o yọ alabọde apọju kuro. Lilo syringe Hamilton ti a so mọ abẹrẹ 23 G, 45°, rọra fa hCO sinu opin ti o jinna julọ ti abẹrẹ naa. Lẹhinna fi syringe sori ẹrọ fifa syringe ti a ti sopọ si ẹrọ stereotaxic. Lẹhinna gbe ori abẹrẹ naa sori iho 0.3 mm fife puncture ti a ti ṣe tẹlẹ ninu dura (z = 0 mm) ki o dín syringe 1–2 mm (z = to –1.5 mm) titi ti abẹrẹ yoo fi wa laarin dura mater A. Ti ṣẹda edidi ipon. Lẹhinna gbe syringe naa si aarin dada cortical ni z = -0.5 mm ki o fun hCO ni oṣuwọn 1-2 µl fun iṣẹju kan. Lẹhin ipari ti abẹrẹ hCO, abẹrẹ naa yoo fa pada ni iwọn 0.2-0.5 mm fun iṣẹju kan, awọ ara ti wa ni sutured, ati pe puppy ti wa ni lẹsẹkẹsẹ gbe sori paadi alapapo gbona titi ti imularada pipe. Diẹ ninu awọn ẹranko ni a gbin ni ọna meji.
Gbogbo awọn ilana eranko ni a ṣe ni ibamu pẹlu Stanford University APLAC-fọwọsi awọn ilana itọju ẹranko. Awọn eku (ti o tobi ju awọn ọjọ 60 lẹhin gbigbe) ni a fa pẹlu 5% akuniloorun isoflurane ati anesthetized pẹlu 1-3% isoflurane lakoko aworan. Fun iworan, 7 Tesla kan ti nṣiṣe lọwọ ti o ni aabo petele borehole scanner Bruker (Bruker Corp.) pẹlu wakọ gradient Ile-iṣẹ Itanna International (IECO), ifibọ mimu idabobo pẹlu iwọn ila opin inu ti 120 mm (600 mT/m, 1000 T/m/s) ni lilo AVANCE. III, RF olona-ikanni oni-ikanni mẹjọ ati awọn agbara-ọpọ-mojuto, ati ipilẹ Paravision 6.0.1 ti o tẹle. Gbigbasilẹ ni a ṣe pẹlu lilo okun RF volumetric ti o ni itara ni itara pẹlu iwọn ila opin inu ti 86 mm ati ikanni RF okun cryo-tutu-ikanni mẹrin fun gbigba nikan. Axial 2D Turbo-RARE (akoko atunwi = 2500 ms, akoko iwoyi = 33 ms, awọn iwọn 2) pẹlu awọn iyaworan bibẹ 16, sisanra bibẹ 0.6-0.8 mm, ti o ni awọn ayẹwo 256 × 256. Awọn ifihan agbara naa ni a gba nipa lilo okun RF transceiver quadrature volumetric pẹlu iwọn ila opin inu ti 2 cm (Rapid MR International, LLC). Lakotan, lo awọn iṣẹ iṣiro dada Imaris (BitPlane) ti a ṣe sinu fun ṣiṣe 3D ati itupalẹ iwọn didun. Aṣeyọri asopo ni a ti ṣalaye bi ọkan ninu eyiti awọn agbegbe ti ifihan T2-iwọn MRI ti nlọsiwaju ni a ṣe agbekalẹ ni agbegbe gbigbe. Ijusile alọmọ jẹ asọye bi alọmọ ti ko gbejade awọn agbegbe ti ifihan T2-iwọn MRI ti nlọsiwaju ni agbegbe gbigbe. Subcortical t-hCO ni a yọkuro lati inu itupalẹ ti o tẹle.
Lati ṣe afihan awọn GCaMP6 ni iduroṣinṣin ni hCO fun aworan kalisiomu fọto meji, awọn sẹẹli hiPS ti ni akoran pẹlu pLV[Exp] -EF1a :: GcaMP6s-WPRE-Puro atẹle nipa yiyan awọn oogun aporo. Ni ṣoki, awọn sẹẹli ti yapa pẹlu EDTA ati daduro ni 1 milimita ti alabọde pataki 8 ni iwuwo ti o to awọn sẹẹli 300,000 ni iwaju polybrene (5 μg/ml) ati 15 μl ti ọlọjẹ. Awọn sẹẹli naa lẹhinna ni itusilẹ ni idaduro fun awọn iṣẹju 60 ati irugbin ni iwuwo ti awọn sẹẹli 50,000 fun kanga kan. Lẹhin iṣọpọ, awọn sẹẹli ti wa ni itọju pẹlu 5-10 μg ml-1 puromycin fun awọn ọjọ 5-10 tabi titi awọn ileto iduroṣinṣin yoo han. Ikolu hCO nla ni a ṣe bi a ti ṣalaye tẹlẹ5 pẹlu diẹ ninu awọn iyipada. Ni soki, gbigbe ọjọ 30-45 hCO sinu 1.5 milimita Eppendorf microcentrifuge tubes ti o ni 100 µl ti alabọde nafu ara. Lẹhinna a yọkuro 90 µl ti alabọde, 3-6 µl ti lentivirus titer giga (lati 0.5 x 108 si 1.2 x 109) ti wa ni afikun si tube, ati pe a gbe hCO si incubator fun ọgbọn išẹju 30. Lẹhinna fi 90-100 µl ti alabọde si tube kọọkan ki o da awọn tubes pada si incubator ni alẹ. Ni ọjọ keji, gbe hCO si alabọde nafu ara tuntun ni awọn awo asomọ kekere. Lẹhin awọn ọjọ 7, hCO ti gbe lọ si awọn apẹrẹ gilasi 24-daradara fun iworan ati igbelewọn didara ikolu. pLV[Exp] -SYN1 :: EYFP-WPRE ati pLV[Exp] -SYN1 :: hChR2-EYFP-WPRE ni a ṣe nipasẹ VectorBuilder. Lentivirus ni a lo ninu ọpọlọpọ awọn adanwo nitori pe o ti ṣepọ sinu jiometirika agbalejo, gbigba ikosile jiini oniroyin ni awọn laini sẹẹli ti o ni arun. Fun atẹle awọn rabies, ọjọ 30-45 hCO ti ni akoran pẹlu rabies-ΔG-eGFP ati AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (plasmid #67528, Addgene), ti wẹ daradara fun awọn ọjọ 3, ati gbigbe sinu awọn eku ni S1 ati ṣetọju ni vivo fun awọn ọjọ 7-1.
Fun immunocytochemistry, awọn ẹranko jẹ anesthetized ati transcardially perfused pẹlu PBS atẹle nipa 4% paraformaldehyde (PFA ni PBS; Electron Microscope Sciences). Awọn ọpọlọ wa titi ni 4% PFA fun awọn wakati 2 tabi ni alẹ ni 4 ° C, cryopreserved ni 30% sucrose ni PBS fun awọn wakati 48-72, ati ti a fi sii ni 1: 1, 30% sucrose: OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek) ni a ṣe ni coronal 30. (Leica). Fun imunohistochemistry ti awọn apakan ti o nipọn, awọn ẹranko ti ni itunra pẹlu PBS, ati pe ọpọlọ ti pin ati pin si iṣọn-alọ ọkan ni 300-400 µm nipa lilo vibratome (Leica) ati awọn apakan ti o wa titi pẹlu 4% PFA fun awọn iṣẹju 30. Lẹhinna a ti fọ awọn cryosections tabi awọn apakan ti o nipọn pẹlu PBS, ti dina fun wakati 1 ni iwọn otutu yara (10% serum kẹtẹkẹtẹ deede (NDS) ati 0.3% Triton X-100 ti a fomi ni PBS) ati dina pẹlu ojutu didi ni 4 ° C. – Incubation Cryosections won abeabo moju ati ki o nipọn ruju won abeabo fun 5 ọjọ. Awọn egboogi akọkọ ti a lo ni: anti-NeuN (eku, 1: 500; ab104224, abcam) egboogi-CTIP2 (eku, 1:300; ab18465, abcam), egboogi-GFAP (ehoro, 1: 1,000; Z0334, Dako), anti-GFP: 1, GTX 09 (adie, GTX 0), anti-HNA (eku, 1:200; ab191181, abcam), egboogi-NeuN (ehoro, 1:500; ABN78, Millipore), egboogi-PDGFRA (ehoro, 1:200; sc-338, Santa Cruz), egboogi-PPP1R17 (ehoro, 1:0478; HPAdies, 19:2008). anti-RECA-1 (Asin, 1:50; ab9774, abcam), egboogi-SCG2 (ehoro, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (ewurẹ, 1:500; AF3075, R & D Systems), Netrin G1a (ewúrẹ0, 6 & 11D Systems), anti-STEM121 (eku, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (eku, 1:50; ab51502, abcam), egboogi-GAD65/67 (ehoro, 1:400; ABN904, Millipore) ati egboogi-IBA1 (ewurẹ, ab51500). Awọn egboogi akọkọ ti a lo ni: anti-NeuN (eku, 1: 500; ab104224, abcam) egboogi-CTIP2 (eku, 1:300; ab18465, abcam), egboogi-GFAP (ehoro, 1: 1,000; Z0334, Dako), anti-GFP: 1, GTX 0 (adie, GTX 0), anti-HNA (eku, 1:200; ab191181, abcam), egboogi-NeuN (ehoro, 1:500; ABN78, Millipore), egboogi-PDGFRA (ehoro, 1:200; sc-338, Santa Cruz), egboogi-PPP1R17 (ehoro, 1:0478; HPAdies, 19:2008). anti-RECA-1 (Asin, 1:50; ab9774, abcam), egboogi-SCG2 (ehoro, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), egboogi-SOX9 (ewurẹ, 1:500; AF3075, R & D Systems), Netrin G1a (ewúrẹ, 6: 10R Systems), AF & 10 Systems. anti-STEM121 (eku, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (eku, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (ehoro, 1:400; ABN904, Millipore) ati egboogi-IBA1 (abwúrẹ, 1760, 1 cam). Использовались следующие первичные антитела: анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2:3кыры0 ab18465, abcam), анти-GFAP (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), анти- -GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA ( ab1900, 8; ab1901, ab1901), анти-NeuN (кролик, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кролик, 1:200; sc-338, Санта-Круз), анти-PPP1R17 (kр1040, HPAt, 1900, 1900, HPAt, 1900, 1900, 1990, HP. Antibodies), анти-RECA-1 (мышь, 1:50; ab9774, abcam), анти-SCG2 (кролик , 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9), (кози0, R&AF Systems, 1:507), нетрин G1a (козий, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти-STEM121 (мышиный , 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, ab51):502; ab51:50; анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) ati анти-IBA1 (коза, 1:100; аб5076, абкам). Awọn egboogi akọkọ ti a lo ni: anti-NeuN (eku, 1: 500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (eku, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (ehoro, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP (adiye, 103070; GTX 10T), Gene anti-HNA (eku, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (ehoro, 1:500; ABN78, Millipore), egboogi-PDGFRA (ehoro, 1:200; sc-338, Santa Cruz), egboogi-PPP1R17 (ehoro, 1:0478), HPAdies anti-RECA-1 (Asin, 1:50; ab9774, abcam), egboogi- SCG2 (ehoro, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), egboogi-SOX9 (ewúrẹ, 1:500; AF3075, R & D Systems), netrin G1a (ewúrẹ, 6: 10) R. STEM121 (eku, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (eku, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (ehoro, 1:400; ABN904, Milipore) ati egboogi-IBA1 (ewurẹ, ab51502, 15m).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:3 00;ab18465,abcam)，抗GFAP（兔,1:1,000;Z0334,Dako），抗-GF P (鸡, 1:1,000;GTX13970, GeneTex) 81, abcam) 1: 200;sc-338, Santa Cruz), 抗PPP1R17 (兔, 1:200; HPA047819, Atlas抗体） 抗RECA-1（小鼠：1:50；ab9774،abcam））抗SCG2（兔） , 1: 100; 20357-1-AP, Proteintech, 抗SOX9 (山羊, 1:500; AF3075, R&D Systems) Netrin G1a (100) AF1166, R&D Awọn ọna ṣiṣe) 抗STEM121 (小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1 : 300; ab18465, abcam), 抗GFAP (兔, 1: 1,000; Z0334, Dako) -GFP (鸡, 1:1,000;GTX13970, GeneTex) 200;sc-338, Santa Cruz) 抗PPP1R17（兔，1:200：HPA047819， Atlas 100;20357-1-AP, Proteintech, 抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems）Netrin G1aY40410, Takara Bio), egboogi-SATB2 (Asin, 1:50; ab51502, abcam), egboogi-GAD65/67 (ehoro, 1:400; ABN904, Millipore) ati egboogi-IBA1 (ewurẹ, 1:100; ab5076, abcam).Awọn egboogi akọkọ ti a lo ni: anti-NeuN (eku, 1: 500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (rat, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (ehoro, 1:1000; Z0334, Dako) . , egboogi-GFP (adie, 1: 1000; GTX13970, GeneTex), egboogi-HNA (eku, 1: 200; ab191181, abcam), egboogi-NeuN (ehoro, 1: 500; ABN78, Millipore), egboogi-PDGFRA (ehoro, 1-330R), Centro-Ehoro, 1: 3300, C-anti-Ehoro. (ehoro, 1:200; HPA047819, Atlas antibody), anti-RECA-1 (eku, 1:50; ab9774, abcam), anti- SCG2 (ehoro), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R & D Systems), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, R & D Systems), ati -STEM1201 Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) ati анти-IBA1 (коза0); àbá). 20357-1-AP, Proteintech), egboogi-SOX9 (ewurẹ, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (ewúrẹ, 1:100; AF1166, R & D Systems), egboogi-STEM121 (Asin, 1:200; Y40410; TB anti-SA, Takara Bio), 500, Asin, Takara 1. ab51502, abcam), egboogi-GAD65/67 (ehoro, 1:400; ABN904, Millipore), ati egboogi-IBA1 (ewurẹ, 1:100; ab5076, abkam).Lẹhinna a fọ ​​awọn apakan pẹlu PBS ati pe a fi omi ṣan pẹlu apakokoro keji fun wakati 1 ni iwọn otutu yara (awọn apakan didi) tabi ni alẹ ni 4°C (awọn apakan nipọn). Alexa Fluor secondary antibody (Life Technologies) ti fomi po 1:1000 ni idinamọ ojutu ti a lo. Lẹhin fifọ pẹlu PBS, awọn ekuro ti wa ni wiwo pẹlu Hoechst 33258 (Awọn Imọ-ẹrọ Igbesi aye). Nikẹhin, awọn ifaworanhan ni a gbe sori maikirosikopu pẹlu awọn ideri (Fisher Scientific) nipa lilo Aquamount (Polysciences) ati atupale lori Keyence fluorescent microscope (BZ-X analyzer) tabi Leica TCS SP8 confocal microscope (Las-X) lori aworan naa. Awọn aworan ti ni ilọsiwaju nipa lilo eto ImageJ (Fiji). Lati ṣe iwọn ipin ti awọn neuronu eniyan ni t-hCO ati kotesi eku, awọn aworan onigun 387.5 μm jakejado ni a ya ni aarin t-hCO, ni tabi nitosi eti ti kotesi eku. Awọn ala alọmọ ni a pinnu nipasẹ ṣiṣe ayẹwo awọn ayipada ninu akoyawo tissu, HNA + awọn ekuro, ati/tabi wiwa ti ara autofluorescence tissu. Ni aworan kọọkan, nọmba apapọ ti NeuN + ati awọn sẹẹli HNA+ ti pin nipasẹ apapọ nọmba ti NeuN + awọn sẹẹli ni agbegbe kanna. Lati rii daju pe awọn sẹẹli nikan pẹlu awọn ekuro ninu ọkọ ofurufu aworan ni a ka, awọn sẹẹli nikan ti o tun jẹ Hoechst + wa ninu iṣiro naa. Awọn aworan meji ti o yapa nipasẹ o kere ju 1 mm ni aropin lati dinku aṣiṣe iṣiro.
Ni ọsẹ kan ṣaaju gbigba ayẹwo, gbe awọn ẹranko gbigbe hCO (iwọn bi oṣu 8 ti iyatọ) ni yara dudu kan pẹlu awọn whiskers gige lati dinku ifarako ifarako. Iyasọtọ ti awọn ekuro ni a ṣe bi a ti ṣalaye tẹlẹ, pẹlu diẹ ninu awọn iyipada. Ni ṣoki, t-hCO ati hCO ni a parun nipa lilo lysis sẹẹli-iṣan-ẹrọ ati 2 milimita gilasi kan grinder (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE). Lẹhinna a yọ awọn ekuro robi kuro ni lilo àlẹmọ 40 µm kan ati ki o fi centrifuged ni 320 g fun iṣẹju mẹwa 10 ni 4 °C ṣaaju ṣiṣe isọdi iwuwo sucrose kan. Lẹhin igbesẹ centrifugation (320 g fun 20 min ni 4 ° C), awọn ayẹwo ti tun daduro ni 0.04% BSA/PBS pẹlu afikun ti awọn ẹya 0.2 ti inhibitor µl-1 RNase (40 u µl-1, AM2682, Ambion) ati kọja nipasẹ àlẹmọ ṣiṣan 40.µ Awọn ekuro ti o yapa lẹhinna tun daduro ni PBS ti o ni 0.02% BSA ati ti kojọpọ sori chirún Chromium Single Cell 3′ (imupadabọ ti awọn sẹẹli 8,000 fun ọna kan). Awọn ile-ikawe snRNA-seq ti pese pẹlu Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Awọn ile-ikawe snRNA-seq ti pese pẹlu Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Awọn ile ikawe snRNA-seq ti pese sile ni lilo Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM,Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM,Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 Библиотеку snRNA-seq готовили с использованием Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Ile-ikawe snRNA-seq ti pese sile ni lilo Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics).Awọn ile-ikawe lati oriṣiriṣi awọn ayẹwo ni a ṣajọpọ ati tito lẹsẹsẹ nipasẹ Admera Health lori NovaSeq S4 (Illumina).
Awọn ipele ikosile Gene fun koodu koodu iparun putative kọọkan ni a ṣe iwọn ni lilo package sọfitiwia itupalẹ 10x Genomics CellRanger (ẹya 6.1.2). Ni pataki, awọn kika ni ibamu pẹlu apapọ eniyan (GRCh38, Ẹgbẹ, ẹya 98) ati eku (Rnor_6.0, Ensemble, version 100) awọn genomes itọkasi ti a ṣẹda pẹlu aṣẹ mkref ati lilo kika pẹlu –include-introns=Ofin TÒÓTỌ si titobi pẹlu awọn kika ti a yaworan si awọn agbegbe intron. Fun awọn ayẹwo t-hCO, awọn ekuro eniyan ni idanimọ ti o da lori ibeere Konsafetifu pe o kere ju 95% ti gbogbo awọn kika ti ya aworan ni ibamu pẹlu jiini eniyan. Gbogbo awọn itupale ti o tẹle ni a ṣe lori abajade eto koodu koodu ti a ti yo lati CellRanger nipa lilo package R (ẹya 4.1.2) Seurat (ẹya 4.1.1) 32.
Lati rii daju pe awọn ekuro ti o ni agbara giga nikan ni o wa ninu itupalẹ atẹle, ilana sisẹ aṣepe fun apẹẹrẹ kọọkan. Ni akọkọ, awọn ekuro didara kekere ti o kere ju 1000 awọn jiini alailẹgbẹ ti a rii ati diẹ sii ju 20% ti lapapọ mitochondria ni idanimọ ati yọkuro. Lẹhinna, matrix nọmba jiini aise jẹ deede nipasẹ isọdọtun binomial odi deede ni lilo iṣẹ sctransform(vst.flavor=”v2″), eyiti o tun ṣe idanimọ awọn jiini oniyipada 3000 pupọ julọ nipa lilo awọn paramita aiyipada. Idinku iwọn ni a ṣe lori awọn jiini oniyipada oke ni lilo Analysis Principal Component Analysis (PCA) = pẹlu awọn aye aiyipada nipa lilo iwọn data ti a yan ti iwọn 3 ti a yan lori orokun 3. Awọn aaye ati ti a lo fun gbogbo awọn ayẹwo ati awọn itupale akojọpọ). Apo DoubletFinder33 (tumọ si Dimegilio DoubletFinder loke ipin ogorun 95).
Lẹhin yiyọkuro awọn kernel didara kekere, a ṣe akojọpọ data isọpọ (ipinnu = 0.5) ati ti a fi sii fun awọn idi wiwo UMAP34. Awọn Jiini asami fun iṣupọ kọọkan ni a pinnu nipa lilo iṣẹ FindMarkers pẹlu awọn aye aiyipada ti a ṣe iṣiro lati data ikosile apilẹṣẹ deede. A ṣe idanimọ ati ṣe iyasọtọ awọn kilasi sẹẹli pataki nipasẹ apapọ awọn data itọka ọmọ inu oyun ati agba agba pẹlu ikosile jiini ami ami 19,20,21,35 ati asọye. Ni pataki, awọn iṣaju kaakiri ni a damọ nipasẹ ikosile ti MKI67 ati TOP2A. Awọn iṣupọ progenitor ni asọye nipasẹ isansa ti awọn iwe afọwọkọ mitotic, agbekọja giga pẹlu awọn iṣupọ progenitor glial multipotent ti a ṣapejuwe ninu kotesi ọmọ inu oyun metaphase pẹ, ati EGFR ati OLIG1 ikosile. A lo ọrọ astrocyte lati yika ọpọlọpọ awọn ipinlẹ ti iyatọ astrocyte, lati pẹ radial glia si maturation ti astrocytes. Awọn iṣupọ Astrocyte ṣe afihan awọn ipele giga ti SLC1A3 ati AQP4 ati pe wọn ti han lati ṣe maapu pẹlu awọn iru-ilẹ ti glia radial oyun ati/tabi awọn astrocytes agbalagba. Awọn OPC ṣe afihan PDGFRA ati SOX10 lakoko ti oligodendrocytes ṣe afihan awọn ami ami miyelination (MOG ati MYRF). Awọn neurons Glutamatergic ni idanimọ nipasẹ wiwa ti awọn iwe afọwọkọ neuronal (SYT1 ati SNAP25), isansa ti awọn ami GABAergic (GAD2), ati ikosile ti NEUROD6, SLC17A7, BCL11B, tabi SATB2. Awọn neuronu GluN tun pin si oke (SATB2 ikosile ati isonu ti BCL11B) ati jin (BCL11B ikosile) awọn ipin-kekere. Awọn neurons putative (SP) ṣe afihan awọn ami SP18 ti a mọ gẹgẹbi ST18 ati SORCS1 ni afikun si awọn ami GluN ti o jinlẹ. Awọn sẹẹli ti o dabi Choroid plexus ni idanimọ nipasẹ ikosile TTR, ati awọn sẹẹli meningeal-like ti ṣe afihan awọn jiini ti o ni ibatan fibroblast ati awọn sẹẹli pial / iṣan ti a ṣeto ti ṣeto data itọkasi.
Onínọmbà iyatọ ti ikosile pupọ laarin t-hCO ati hCO subclasses ni a ṣe ni lilo ọna tuntun ti o ni idagbasoke pseudo-batch ti a tun ṣe ni awọn apẹẹrẹ ti a ṣe imuse nipa lilo package Libra R (ẹya 1.0.0). Ni pataki, awọn idanwo-iṣapejuwe ti EdgeR (ẹya 3.36.0, package R) ni a ṣe fun awọn ẹgbẹ nipasẹ pipọ nọmba awọn jiini ninu awọn sẹẹli fun kilasi sẹẹli ti a fun fun ẹda ayẹwo kọọkan. Fun iwoye maapu ooru, awọn iye deede fun miliọnu (CPM) jẹ iṣiro nipa lilo iṣẹ EdgeR (cpm () ati iwọn (lati ṣaṣeyọri tumọ = 0, iyapa boṣewa = 1). Gene Ontology (GO) itupalẹ imudara ti awọn jiini t-hCO GluN ti o ṣe pataki ni a ṣe (Benjamini-Hochberg ṣe atunṣe iye P ti o kere ju 0.05 ti a fihan ni o kere ju 10% ti awọn sẹẹli t-hCO GluN ati ilọpo agbo ni iyipada ti o kere ju awọn akoko 2). ṣe nipa lilo ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37. A lo ohun elo ToppFun pẹlu awọn aye aifọwọyi ati ijabọ Benjamini-Hochberg-titunse awọn iye P ti a ṣe iṣiro lati awọn idanwo hypergeometric ti GO.
Lati baramu awọn iṣupọ snRNA-seq wa pẹlu awọn iṣupọ sẹẹli ti alaye lati awọn iwadii itọkasi ti sẹẹli ẹyọkan RNA-seq akọkọ tabi agbalagba snRNA-seq19,20,21,22, a lo ọna isọpọ data isọdọkan. A lo SCTransform (v2) iṣan-iṣẹ deede ni Seurat lati ṣepọ ati ṣe afiwe awọn iṣupọ iṣupọ laarin awọn datasets (lilo awọn aye kanna bi loke). Awọn ipilẹ data ẹni kọọkan ni a ṣe ipilẹ laileto to awọn sẹẹli 500 tabi awọn ohun kohun fun iṣupọ atilẹba fun ṣiṣe iṣiro. Lilo ọna ti o jọra gẹgẹbi a ti ṣalaye tẹlẹ, iṣupọ iṣupọ ni asọye bi ipin ti awọn sẹẹli tabi awọn ekuro ninu iṣupọ akojọpọ kọọkan ti o bori pẹlu aami ti iṣupọ itọkasi. Lati ṣe iyasọtọ awọn GluNs siwaju sii, a lo iṣan-iṣẹ GbigbeData ti Seurat fun data ipinpin GluN lati fi awọn aami atokọ data itọkasi si awọn sẹẹli GluN wa.
Lati ṣe ayẹwo ipo maturation ti transcriptome agbaye ti t-hCO ati awọn ayẹwo hCO, a ṣe afiwe awọn apẹẹrẹ pseudo-bulk wa pẹlu BrainSpan/psychENCODE23, eyiti o ni ilana RNA nla kan ti o ni idagbasoke ọpọlọ eniyan. A ṣe PCA lori apapọ apẹrẹ-normalized gene ikosile matrix lati awọn ayẹwo cortical 10 ọsẹ lẹhin ti oyun ati nigbamii, ni 5567 Jiini (paapọ pẹlu data wa) ti a ti mọ tẹlẹ bi lọwọ ninu awọn ayẹwo cortical BrainSpan (ti a ṣalaye bi o tobi ju 50% ni iyatọ idagbasoke ti a ṣe alaye nipasẹ ọjọ ori nipa lilo awoṣe onigun)38. Ni afikun, a ni awọn jiini ti o ni nkan ṣe pẹlu awọn ibuwọlu transcriptome pataki ti idagbasoke neurodevelopment nipa lilo isọdi matrix ti kii ṣe odi bi a ti ṣalaye tẹlẹ. Awọn iwọn ayẹwo ti a ṣe iṣiro nipa lilo ilana isọdi matrix ti kii ṣe odi ti wa ni igbero ni Awọn Ọpọtọ. 5b pẹlu data ti o gbooro fun ọkọọkan awọn ibuwọlu marun ti a ṣalaye nipasẹ Zhu et al.38. Lẹẹkansi, awọn asami transcription ti o gbẹkẹle iṣẹ ṣiṣe ni a gba lati awọn ẹkọ ti a tẹjade tẹlẹ. Ni pataki, ERG ati LRG jẹ atunṣe ni pataki ni awọn neurons glutamatergic ti a ṣe idanimọ nipasẹ ikojọpọ kotesi wiwo snRNA-seq Asin lẹhin imudara wiwo lati Tabili Afikun 3 Hrvatin et al.16. Awọn LRGs ti eniyan ti ni imudara ni a gba lati awọn aṣa ọpọlọ ọmọ inu oyun ti eniyan ti mu ṣiṣẹ KCl ati ikore awọn wakati 6 lẹhin igbati o, ati awọn jiini ti a ti yo ni a ṣe atunṣe ni pataki ninu eniyan ṣugbọn kii ṣe ni awọn rodents (Tabili Imudara 4). Itupalẹ imudara eto apilẹṣẹ nipa lilo awọn eto apilẹṣẹ wọnyi ni a ṣe ni lilo idanwo gangan Fisher ọna kan.
Anesthetize eku pẹlu isoflurane, yọ awọn opolo ati ki o gbe ni tutu (isunmọ 4 ° C) oxygenated (95% O2 ati 5% CO2) ojutu sucrose fun awọn apakan ti o ni: 234 mM sucrose, 11 mM glucose, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM. NaH2PO4, 10 mM MgSO4 ati 0.5 mM CaCl2 (nipa 310 mOsm). Awọn apakan iṣọn-ẹjẹ ọpọlọ eku (300-400 µm) ti o ni t-hCO ni a ṣe ni lilo Leica VT1200 vibratome bi a ti ṣalaye tẹlẹ39. Lẹhinna a gbe awọn apakan lọ si iyẹwu ipin kan pẹlu atẹgun otutu otutu ti o tẹsiwaju ti o ni aCSF ti a pese sile lati: 10 mM glucose, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 ati 126 mM NaCl (298 mO). o kere ju iṣẹju 45 ṣaaju igbasilẹ. Awọn apakan ni a gbasilẹ ni iyẹwu immersed nibiti wọn ti fun ni igbagbogbo pẹlu aCSF (95% O2 ati 5% CO2 vial). Gbogbo data ti wa ni igbasilẹ ni iwọn otutu yara. t-hCO neurons ti pari pẹlu pipette gilasi borosilicate ti o kun pẹlu ojutu ti o ni 127 mM potasiomu gluconate, 8 mM NaCl, 4 mM magnẹsia ATP, 0.3 mM sodium GTP, 10 mM HEPES, ati 0.6 mM EGTA, pH 7.2, ojutu inu inu ti a ṣe atunṣe pẹlu KOHs2 m.9. Lati le gba pada, biocytin (0.2%) ni a ṣafikun si ojutu gbigbasilẹ.
A ti gba data nipa lilo ampilifaya MultiClamp 700B (Awọn ẹrọ Molecular) ati Digidata 1550B digitizer (Awọn ẹrọ Molecular), ti ṣe iyọda kekere-kekere ni 2 kHz, digitized ni 20 kHz, ati itupalẹ nipa lilo Clampfit (Awọn ẹrọ Molecular), Origin (OriginPro). 2021b, OriginLab). ati aṣa MATLAB awọn iṣẹ (Mathworks). Agbara isopopo jẹ iṣiro nipa lilo JPCalc ati awọn titẹ sii ti ni atunṣe si iye iṣiro ti -14 mV. Isẹ IV ni lẹsẹsẹ awọn igbesẹ lọwọlọwọ ni awọn igbesẹ 10-25 pA, lati -250 si 750 pA.
Awọn thalamus, ọrọ funfun, ati awọn afferents S1 ti ni itara nipa itanna ni awọn ege thalamocortical lakoko gbigbasilẹ patch-clamp ti awọn neuron hCO, bi a ti ṣalaye tẹlẹ. Ni ṣoki, a gbe ọpọlọ sori tabili titẹ sita 3D ti o tẹ si igun 10°, ati pe a ge iwaju ọpọlọ ni igun 35° kan. Ọpọlọ lẹhinna lẹ pọ si ilẹ ti a ge ati ti a pin si, ti o tọju awọn axons ti n jade thalamocortical. Awọn amọna tungsten bipolar (0.5 MΩ) ni a gbe sori micromanipulator keji ati ipo ilana lati mu awọn agbegbe mẹrin fun sẹẹli kan (capsule inu, ọrọ funfun, S1 ati hCO). Ṣe igbasilẹ awọn idahun synapti lẹhin 300 µA imudara ipasiki ni 0.03–0.1 Hz.
hChR2-ifihan hCO neurons ti mu ṣiṣẹ ni 480 nm ati awọn isun ina ti ipilẹṣẹ nipasẹ LED (Prizmatix) ni a lo nipasẹ ibi-afẹde ×40 (0.9 NA; Olympus) lati ṣe igbasilẹ ikosile hChR2 nitosi awọn sẹẹli naa. Iwọn ila opin aaye ti itanna jẹ isunmọ 0.5 mm ati pe gbogbo agbara jẹ 10-20 mW. Iwọn pulse ti ṣeto si 10 ms, eyiti o ni ibamu si pulse ti a fun lakoko idanwo ikẹkọ ihuwasi. Orisirisi awọn igbohunsafẹfẹ iwuri ni a lo, lati 1 si 20 Hz, ṣugbọn pulse akọkọ ti jara nikan ni a lo fun titobi. Awọn aaye arin laarin awọn ọkọ oju irin maa n gun ju ọgbọn iṣẹju 30 lati dinku ipa lori inhibitory synapti tabi awọn ipa ọna irọrun. Lati ṣe idanwo boya idahun hChR2 jẹ monosynaptic, a lo TTX (1 μM) si iwẹ titi ti iṣesi EPSC yoo parẹ, ati lẹhinna lo 4-aminopyridine (4-AP; 100 μM). Ni deede, idahun yoo pada laarin awọn iṣẹju diẹ, pẹlu idaduro diẹ diẹ laarin ibọn LED ati iran EPSC. NBQX (10 μM) ni a lo lati ṣe idanwo boya idahun naa jẹ idari nipasẹ awọn olugba AMPA.
Awọn apakan hCO didasilẹ ni a ṣẹda bi a ti ṣalaye tẹlẹ. Ni ṣoki, awọn apakan hCO ti wa ni ifibọ sinu 4% agarose ati gbigbe si awọn sẹẹli ti o ni 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 ati 10 mM dse (+ 0) ni a ge sinu apakan - 0 - 0% µm ni otutu yara ni lilo gbigbọn Leica VT1200 ati ti o fipamọ sinu ASF ni iwọn otutu yara. Lẹhinna, igbasilẹ patch-camp ti gbogbo awọn sẹẹli ni a ṣe lori awọn apakan hCO labẹ microscope SliceScope taara (Scientifica). Awọn apakan jẹ perfused pẹlu aCSF (95% O2 ati 5% CO2) ati awọn ifihan agbara sẹẹli ni a gbasilẹ ni iwọn otutu yara. Awọn iṣan hCO ni a lo nipa lilo pipette gilasi borosilicate ti o kun pẹlu ojutu ti o ni 127 mM potassium gluconate, 8 mM NaCl, 4 mM magnẹsia ATP, 0.3 mM sodium GTP, 10 mM HEPES, ati 0.6 mM EGTA, pH 7, 2, ti a ṣe atunṣe pẹlu KOH (osmolarity). Fun awọn idi imularada, ṣafikun 0.2% Biocytin si ojutu inu.
Awọn data ti a gba nipasẹ Clampex (Clampex 11.1, Awọn ẹrọ Molecular) ni lilo MultiClamp 700B ampilifaya (Awọn ẹrọ Molecular) ati Digidata 1550B digitizer (Awọn ẹrọ Molecular), ti a ṣe iyasọtọ kekere ni 2 kHz, digitized ni 20 kHz, ati itupalẹ nipa lilo awọn ẹrọ Clampfit. awọn iṣẹ (MATLAB 2019b, Mathworks). Agbara isopopo ni a ṣe iṣiro nipa lilo JPCalc ati awọn titẹ sii ti ni atunṣe si agbara iṣipopada iṣiro ti -14 mV. Isẹ IV ni lẹsẹsẹ awọn igbesẹ lọwọlọwọ ni awọn igbesẹ 5-10 pA lati -50 si 250 pA.
Fun atunkọ mofoloji ti awọn neuronu pinched, 0.2% biocytin (Sigma-Aldrich) ni a ṣafikun si ojutu inu. Awọn sẹẹli ti wa ni ipilẹṣẹ fun o kere ju iṣẹju 15 lẹhin gige sakasaka. Pipette naa yoo fa laiyara fun awọn iṣẹju 1–2 titi ti awo ilu ti a forukọsilẹ yoo di edidi patapata. Lẹhin ilana ilana ẹkọ ẹkọ-ara apakan, awọn apakan ni a ṣeto ni alẹ ni 4 ° C. ni 4% PFA, ti a wẹ pẹlu PBS X3, ati ti fomi 1: 1000 pẹlu streptavidin-conjugated DyLight 549 tabi DyLight 405 (Vector Labs). Awọn sẹẹli ti o kun fun biocytin (2%; Sigma-Aldrich) ni a samisi lakoko gbigbasilẹ patch dimole ni iwọn otutu yara fun wakati 2. Lẹhinna a gbe awọn apakan naa sori awọn ifaworanhan microscopy nipa lilo Aquamount (Thermo Scientific) ati wiwo ni ọjọ keji lori microscope confocal Leica TCS SP8 nipa lilo ibi-afẹde immersion epo kan pẹlu iho nọmba ×40 1.3, magnification ×0.9–1.0, xy. Oṣuwọn iṣapẹẹrẹ jẹ isunmọ awọn piksẹli 7 fun micron. Awọn akopọ Z ni awọn aaye arin 1µm ni a gba ni tẹlentẹle, ati awọn mosaics z-stack ati afọwọṣe-orisun Leica ni a ṣe lati bo gbogbo igi dendritic ti neuron kọọkan. Awọn Neurons lẹhinna tọpinpin ologbele-ọwọ nipa lilo wiwo neuTube 40 ati awọn faili SWC ti ipilẹṣẹ. Awọn faili lẹhinna ti gbejade si ohun itanna SimpleNeuriteTracer41 Fiji (ImageJ, version 2.1.0; NIH).
A ti gba àsopọ cortical eniyan pẹlu ifọwọsi alaye ni ibamu si ilana ti a fọwọsi nipasẹ Igbimọ Atunwo Ile-iṣẹ ti Ile-ẹkọ giga Stanford. Awọn ayẹwo meji ti ẹran ara lẹhin ibimọ eniyan (3 ati ọdun 18) ni a gba nipasẹ isọdọtun ti kotesi iwaju (gyrus iwaju aarin) gẹgẹbi apakan ti iṣẹ abẹ fun warapa refractory. Lẹhin ifasilẹ, awọn ohun elo ikore ninu yinyin-tutu NMDG-aCSF ti o ni: 92 mM NMDG, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM glucose, 2 mM thiourea, 5 mMpy 5 mMM, sodium ascorvate. CaCl2 4H2O ati 10 mM MgSO4 7H2O. Titrate si pH 7.3-7.4 pẹlu ogidi hydrochloric acid. Awọn sẹẹli ti a fi jiṣẹ si ile-iyẹwu laarin awọn iṣẹju 30 ati awọn apakan iṣọn-ara ni a mu ni ibamu si ilana ti a ṣalaye loke.
Gbogbo awọn ilana eranko ni a ṣe ni ibamu pẹlu Stanford University APLAC-fọwọsi awọn ilana itọju ẹranko. Awọn eku (ti o tobi ju awọn ọjọ 140 lẹhin gbigbe-gbigbe) ni a fa pẹlu 5% akuniloorun isoflurane ati anesthetized pẹlu 1-3% isoflurane intraoperatively. Awọn ẹranko ni a gbe sinu fireemu stereotaxic (Kopf) ati itusilẹ idaduro buprenorphine (SR) ni abẹrẹ abẹlẹ. Timole ti wa ni gbangba, ti mọtoto ati 3-5 egungun skru ti wa ni fi sii. Lati fojusi t-hCO, a ṣe ipilẹṣẹ awọn ipoidojuko stereotaxic lati awọn aworan MRI. A ti gbẹ iho burr kan ni aaye ti iwulo ati awọn okun (iwọn ila opin 400 µm, NA 0.48, Doric) ti lọ silẹ 100 µm ni isalẹ dada hCO ati ni ifipamo si timole pẹlu simenti ehín iwosan UV (Relyx).
Awọn gbigbasilẹ photometric Fiber ni a ṣe bi a ti ṣalaye tẹlẹ42. Lati ṣe igbasilẹ iṣẹ-ṣiṣe lẹẹkọkan, a gbe awọn eku sinu agọ ẹyẹ ti o mọ ati okun patch 400 µm iwọn ila opin okun opiti (Doric) ti o sopọ si eto imudara data photometric fiber optic kan ti sopọ mọ okun okun opitiki ti a gbin. Nigba igbasilẹ iṣẹju 10-iṣẹju ti iṣẹ-ṣiṣe motor, awọn ẹranko ni ominira lati ṣawari agọ ẹyẹ naa. Lati ṣe igbasilẹ iṣẹ-ṣiṣe ti o yọ kuro, awọn eku (diẹ sii ju awọn ọjọ 140 lẹhin gbigbe) jẹ anesthetized pẹlu 5% isoflurane fun induction ati 1-3% isoflurane fun itọju. Fi ẹranko naa sinu fireemu stereotactic (Kopf) ati awọn whiskers ti o wa ni apa idakeji ti t-hCO ti wa ni gige si iwọn 2 cm ati kọja nipasẹ apapo kan ti a ti sopọ si piezoelectric actuator (PI). Okun 400µm fiber optic patch USB (Doric) ni asopọ si okun ti a gbin ati sopọ si eto imudani data. Awọn whiskers ti o wa ni apa idakeji ti t-hCO lẹhinna yipada ni igba 50 (2 mm ni 20 Hz, 2 s fun igbejade) ni awọn akoko laileto nipasẹ awakọ piezoelectric lori akoko gbigbasilẹ iṣẹju 20 kan. Lo Package Atilẹyin Arduino MATLAB lati ṣakoso akoko iyipada pẹlu koodu MATLAB aṣa. Awọn iṣẹlẹ jẹ mimuuṣiṣẹpọ si sọfitiwia gbigba data nipa lilo awọn iṣọn transistor-transistor logic (TTL).
Awọn eku (ti o tobi ju awọn ọjọ 140 lẹhin gbigbe-gbigbe) ni a fa pẹlu 5% akuniloorun isoflurane ati anesthetized pẹlu 1-3% isoflurane intraoperatively. A gbe awọn ẹranko sinu fireemu stereotaxic (Kopf) ati buprenorphine SR ati dexamethasone ni abẹrẹ abẹlẹ. Timole ti wa ni gbangba, ti mọtoto ati 3-5 egungun skru ti wa ni fi sii. Lati fojusi t-hCO, a ṣe ipilẹṣẹ awọn ipoidojuko stereotaxic lati awọn aworan MRI. craniotomy ipin kan (isunmọ 1 cm ni iwọn ila opin) ni a ṣe pẹlu lilu iyara giga taara lori hCO ti a gbin. Ni kete ti egungun ba tinrin bi o ti ṣee ṣe, ṣugbọn ṣaaju liluho nipasẹ gbogbo egungun, lo awọn ipa lati yọ disiki pelvic ti o ku ti o ku lati fi han t-hCO labẹ. craniotomy ti kun fun iyọ ti ko ni ifo, ati pe ibori ati pin pataki kan ni a so mọ ori agbọn pẹlu simenti ehín ti UV-iwosan (Relyx).
Aworan aworan meji-meji ni a ṣe pẹlu lilo maikirosikopu multiphoton Bruker pẹlu ipinnu Nikon LWD (× 16, 0.8 NA). Aworan GCaMP6 ni a ṣe ni 920 nm pẹlu 1.4x ẹyọkan z-ofurufu giga ati aropin 8x ti 7.5fps. Awọn eku ni a fa pẹlu 5% akuniloorun isoflurane ati itọju pẹlu 1-3% isoflurane. Awọn eku ni a gbe sinu aṣa ti a ṣe ori imuduro ati ipo labẹ lẹnsi. Igbasilẹ isale 3-iṣẹju ti iṣẹ-ṣiṣe mọto ti gba. Ni akoko ti awọn iṣẹju 20 ti gbigbasilẹ, awọn puffs 50 (igbejade kọọkan 100 ms gigun) ni a firanṣẹ laileto si paadi whisker ni idakeji t-hCO nipa lilo picospricer kan. Lo Package Atilẹyin Arduino MATLAB lati ṣakoso akoko ti nwaye pẹlu koodu MATLAB aṣa. Mu awọn iṣẹlẹ ṣiṣẹpọ pẹlu sọfitiwia gbigba data (PrairieView 5.5) ni lilo awọn iṣọn TTL. Fun itupalẹ, a ṣe atunṣe awọn aworan fun išipopada xy nipa lilo atunse affine ninu eto MoCo ti a ṣe ifilọlẹ ni Fiji. Iyọkuro awọn itọpa Fuluorisenti lati awọn sẹẹli kọọkan nipa lilo CNMF-E43. Fluorescence ti fa jade fun agbegbe kọọkan ti iwulo, yipada si awọn iha dF/F, ati lẹhinna yipada si z-score.
Awọn eku (ti o tobi ju awọn ọjọ 140 lẹhin gbigbe-gbigbe) ni a fa pẹlu 5% akuniloorun isoflurane ati anesthetized pẹlu 1-3% isoflurane intraoperatively. A gbe awọn ẹranko sinu fireemu stereotaxic (Kopf) ati buprenorphine SR ati dexamethasone ni abẹrẹ abẹlẹ. Awọn whiskers ti o wa ni apa idakeji ti t-hCO ni a ge si iwọn 2 cm ati ti o tẹle ara nipasẹ apapo ti a ti sopọ si piezoelectric actuator. Awọn timole ti wa ni fara ati ti mọtoto. A alagbara, irin ilẹ dabaru ti wa ni so si awọn timole. Lati fojusi t-hCO, a ṣe ipilẹṣẹ awọn ipoidojuko stereotaxic lati awọn aworan MRI. Ṣe craniotomy ipin kan (isunmọ 1 cm ni iwọn ila opin) pẹlu adaṣe iyara giga kan loke t-hCO. Ni kete ti egungun ba tinrin bi o ti ṣee ṣe, ṣugbọn ṣaaju liluho nipasẹ gbogbo egungun, lo awọn ipa lati yọ disiki pelvic ti o ku ti o ku lati fi han t-hCO labẹ. Awọn sẹẹli kọọkan ni a gba silẹ nipa lilo ikanni 32-ikanni tabi 64-ikanni awọn ohun elo silikoni iwuwo giga-giga (Cambridge Neurotech) ti o wa ni ilẹ si awọn skru ilẹ ati iṣaju iṣaju pẹlu awọn amplifiers RHD (Intan). Lo afọwọyi lati dinku awọn amọna si aaye ibi-afẹde nipasẹ craniotomy, eyiti o kun fun iyọ ti ko tọ. Gbigba data ni a ṣe ni igbohunsafẹfẹ ti 30 kHz ni lilo eto imudani data Ṣii Ephys. Gbigbasilẹ naa tẹsiwaju nikan nigba ti a rii iṣẹ ṣiṣe lẹẹkọkan rhythmic ti o ni ibatan pupọ ni diẹ sii ju awọn ikanni mẹwa 10, ni iyanju pe awọn amọna wa ninu alọmọ (da lori data aworan aworan kalisiomu meji-photon). Gbigbasilẹ isale 10-iṣẹju ti iṣẹ-ṣiṣe mọto ni a gba. Awọn whiskers ti o wa ni apa idakeji ti t-hCO lẹhinna yipada ni igba 50 (2 mm ni 20 Hz, 2 s fun igbejade) ni awọn akoko laileto nipasẹ awakọ piezoelectric lori akoko gbigbasilẹ iṣẹju 20 kan. Lilo Package Atilẹyin MATLAB fun Arduino (MATLAB 2019b), akoko iyipada iṣakoso pẹlu koodu MATLAB aṣa. Lo awọn iṣọn TTL lati mu awọn iṣẹlẹ ṣiṣẹpọ pẹlu sọfitiwia gbigba data.
Fun awọn adanwo siṣamisi opiti, okun patch opiti 200 µm (Doric) kan ti o sopọ si laser 473 nm (Omicron) ni asopọ si okun opiti 200 µm ti a gbe sori craniotomy. Lẹsẹkẹsẹ ṣaaju eyi, ṣatunṣe agbara fo si 20 mW. Lo afọwọyi lati dinku awọn amọna si aaye ibi-afẹde nipasẹ craniotomy, eyiti o kun fun iyọ ti ko tọ. Ni ibẹrẹ ti gbigbasilẹ, mẹwa ti ina 473 nm (igbohunsafẹfẹ 2 Hz, pulse duration 10 ms) ti jade. Awọn sẹẹli ifarabalẹ jẹ asọye bi awọn sẹẹli ti o ṣe afihan esi iwasoke laarin 10 ms ti ina ni 70% tabi diẹ sii ti awọn idanwo naa.