O ṣeun fun lilo si Nature.com.Ẹya ẹrọ aṣawakiri ti o nlo ni atilẹyin CSS lopin.Fun iriri ti o dara julọ, a ṣeduro pe ki o lo ẹrọ aṣawakiri imudojuiwọn kan (tabi mu Ipo Ibamu ṣiṣẹ ni Internet Explorer).Lakoko, lati rii daju pe atilẹyin tẹsiwaju, a yoo ṣe aaye naa laisi awọn aza ati JavaScript.
Biopsy Liquid (LB) jẹ imọran ti o nyara gbaye-gbale ni aaye biomedical.Agbekale naa da lori wiwa awọn ajẹkù ti DNA extracellular ti n kaakiri (ccfDNA), eyiti o jẹ itusilẹ nipataki bi awọn ajẹkù kekere lẹhin iku sẹẹli ni ọpọlọpọ awọn ara.Ipin kekere ti awọn ajẹkù wọnyi wa lati ajeji (ajeji) tissues tabi oganisimu.Ninu iṣẹ lọwọlọwọ, a ti lo ero yii si awọn mussels, eya sentinel ti a mọ fun agbara isọ omi okun giga wọn.A lo agbara awọn ẹran-ọsin lati ṣe bi awọn asẹ adayeba lati gba awọn ajẹkù DNA ayika lati oriṣiriṣi awọn orisun lati pese alaye nipa ipinsiyeleyele ti awọn ilolupo eda abemi omi okun.Awọn abajade wa fihan pe hemolymph mussel ni awọn ajẹkù DNA ti o yatọ pupọ ni iwọn, lati 1 si 5 kb.Itẹsẹ ibọn ibọn fihan pe nọmba nla ti awọn ajẹkù DNA jẹ ti ipilẹṣẹ makirobia ajeji.Lara wọn, a ri awọn ajẹkù DNA lati awọn kokoro arun, archaea, ati awọn ọlọjẹ, pẹlu awọn ọlọjẹ ti a mọ lati ṣe akoran ọpọlọpọ awọn ogun ti o wọpọ ti a rii ni awọn ilolupo eda abemi omi okun.Ni ipari, iwadi wa ṣe afihan pe ero ti LB ti a lo si awọn ẹran-ọsin duro fun ọlọrọ ṣugbọn bi orisun ti a ko ti ṣawari ti imọ nipa oniruuru microbial ni awọn ilolupo eda abemi omi okun.
Ipa ti iyipada oju-ọjọ (CC) lori ipinsiyeleyele ti awọn ilolupo eda abemi omi okun jẹ agbegbe ti o dagba ni kiakia ti iwadi.Imorusi agbaye ko fa awọn aapọn ti ẹkọ-ara pataki nikan, ṣugbọn tun titari awọn opin itiranya ti iduroṣinṣin igbona ti awọn oganisimu omi, ni ipa lori ibugbe ti awọn nọmba ti awọn eya, ti nfa wọn lati wa awọn ipo ti o dara diẹ sii [1, 2].Ni afikun si ni ipa lori ipinsiyeleyele ti awọn metazoans, CC ṣe idiwọ iwọntunwọnsi elege ti awọn ibaraenisepo ogun-makirobia.Dysbacteriosis microbial yii jẹ ewu nla si awọn ilolupo eda abemi omi bi o ṣe jẹ ki awọn ohun-ara inu omi ni ifaragba si awọn aarun ajakalẹ-arun [3, 4].A gbagbọ pe SS ṣe ipa pataki ninu awọn iku pupọ, eyiti o jẹ iṣoro pataki fun iṣakoso awọn ilolupo eda abemi omi okun agbaye [5, 6].Eyi jẹ ọrọ pataki ti a fun ni eto-ọrọ aje, ilolupo ati awọn ipa ijẹẹmu ti ọpọlọpọ awọn eya omi okun.Eyi jẹ otitọ paapaa fun awọn bivalves ti ngbe ni awọn agbegbe pola, nibiti awọn ipa ti CK jẹ diẹ sii lẹsẹkẹsẹ ati lile [6, 7].Ni otitọ, awọn bivalves gẹgẹbi Mytilus spp.ti wa ni lilo pupọ lati ṣe atẹle awọn ipa ti CC lori awọn ilolupo eda abemi okun.Kii ṣe iyanilẹnu, nọmba ti o tobi pupọ ti awọn ami-ara biomarkers ti ni idagbasoke lati ṣe atẹle ilera wọn, nigbagbogbo ni lilo ọna meji-ipele ti o kan pẹlu awọn alamọdaju iṣẹ ṣiṣe ti o da lori iṣẹ enzymatic tabi awọn iṣẹ cellular gẹgẹbi ṣiṣeeṣe sẹẹli ati iṣẹ phagocytic [8].Awọn ọna wọnyi tun pẹlu wiwọn ifọkansi ti awọn itọkasi titẹ kan pato ti o ṣajọpọ ni awọn ohun elo rirọ lẹhin gbigba awọn oye nla ti omi okun.Bibẹẹkọ, agbara sisẹ giga ati eto iṣan-ẹjẹ ologbele-ṣii ti awọn bivalves n pese aye lati ṣe agbekalẹ awọn ami-ara hemolymph tuntun nipa lilo imọran ti biopsy olomi (LB), ọna ti o rọrun ati ipasẹ kekere si iṣakoso alaisan.awọn ayẹwo ẹjẹ [9, 10].Botilẹjẹpe ọpọlọpọ awọn iru awọn ohun elo kaakiri ni a le rii ni LB eniyan, imọran yii da lori ipilẹṣẹ DNA ti awọn ajẹkù DNA extracellular (ccfDNA) ti n kaakiri ni pilasima.Ni otitọ, wiwa DNA ti n kaakiri ni pilasima eniyan ni a ti mọ lati aarin-ọdun 20th [11], ṣugbọn o jẹ ni awọn ọdun aipẹ nikan ti dide ti awọn ọna ṣiṣe atẹle-giga ti yori si iwadii ile-iwosan ti o da lori ccfDNA.Iwaju awọn ajẹkù DNA ti n kaakiri wọnyi jẹ nitori ni apakan si itusilẹ palolo ti DNA genomic (iparun ati mitochondrial) lẹhin iku sẹẹli. Ni awọn eniyan ti o ni ilera, ifọkansi ti ccfDNA jẹ kekere deede (<10 ng/mL) ṣugbọn o le pọsi nipasẹ awọn akoko 5-10 ni awọn alaisan ti o jiya lati oriṣiriṣi awọn pathologies tabi ti a tẹriba si aapọn, ti o ja si ibajẹ ara. Ni awọn eniyan ti o ni ilera, ifọkansi ti ccfDNA jẹ kekere deede (<10 ng/mL) ṣugbọn o le pọsi nipasẹ awọn akoko 5-10 ni awọn alaisan ti o jiya lati oriṣiriṣi awọn pathologies tabi ti a tẹriba si aapọn, ti o ja si ibajẹ ara. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5–10 разил ологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. Ni awọn eniyan ti o ni ilera, ifọkansi ti cccDNA jẹ deede kekere (<10 ng/mL), ṣugbọn o le pọ si nipasẹ awọn akoko 5-10 ni awọn alaisan ti o ni awọn ọna ti o yatọ tabi labẹ aapọn ti o yori si ibajẹ ara.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或度通常较低（<10 ng/mL）。从而导致组织损伤。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 低 （<10 ng/ml） 但 在5-10 ， 从而 组织。 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у тологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. Awọn ifọkansi ccfDNA nigbagbogbo jẹ kekere (<10 ng/ml) ni awọn eniyan ti o ni ilera, ṣugbọn o le pọsi ni 5-10-agbo ni awọn alaisan ti o ni ọpọlọpọ awọn aarun tabi aapọn, ti o fa ibajẹ tissu.Iwọn awọn ajẹkù ccfDNA yatọ lọpọlọpọ, ṣugbọn nigbagbogbo awọn sakani lati 150 si 200 bp.[12].Onínọmbà ti ccfDNA ti ara ẹni, ie, ccfDNA lati deede tabi awọn sẹẹli agbalejo ti o yipada, le ṣee lo lati ṣe awari jiini ati awọn iyipada epigenetic ti o wa ninu iparun ati / tabi jiini mitochondrial, nitorinaa ṣe iranlọwọ fun awọn oniwosan lati yan awọn itọju ti o ni idojukọ molikula kan pato [13].Sibẹsibẹ, ccfDNA ni a le gba lati awọn orisun ajeji gẹgẹbi ccfDNA lati inu awọn sẹẹli oyun lakoko oyun tabi lati awọn ara ti a gbin [14,15,16,17].ccfDNA tun jẹ orisun pataki ti alaye fun wiwa wiwa awọn acids nucleic ti oluranlowo àkóràn (ajeji), eyiti o fun laaye wiwa ti ko ni ipanilara ti awọn akoran kaakiri ti a ko damọ nipasẹ awọn aṣa ẹjẹ, yago fun biopsy invasive ti àsopọ ti o ni arun [18].Awọn ijinlẹ aipẹ ti fihan nitootọ pe ẹjẹ eniyan ni orisun ọlọrọ ti alaye ti a le lo lati ṣe idanimọ gbogun ti ati kokoro arun, ati pe nipa 1% ti ccfDNA ti a rii ni pilasima eniyan jẹ ti ipilẹṣẹ ajeji [19].Awọn ijinlẹ wọnyi ṣe afihan pe ipinsiyeleyele ti microbiome ti n pin kaakiri ni a le ṣe ayẹwo nipa lilo itupalẹ ccfDNA.Sibẹsibẹ, titi di aipẹ, ero yii ni a lo ni iyasọtọ ninu eniyan ati, si iwọn diẹ, ni awọn vertebrates miiran [20, 21].
Ninu iwe ti o wa lọwọlọwọ, a lo agbara LB lati ṣe itupalẹ ccfDNA ti Aulacomya atra, eya gusu ti o wọpọ julọ ni awọn erekusu subantarctic Kerguelen, ẹgbẹ kan ti awọn erekuṣu ti o wa ni oke pẹtẹlẹ nla kan ti o ṣẹda ni ọdun 35 ọdun sẹyin.folkano eruption.Lilo eto idanwo in vitro, a rii pe awọn ajẹkù DNA ti o wa ninu omi okun ni a yara mu soke nipasẹ awọn ẹfọ ati wọ inu yara hemolymph.Itọpasẹ Shotgun ti fihan pe mussel hemolymph ccfDNA ni awọn ajẹkù DNA ti tirẹ ati ti ipilẹṣẹ ti kii ṣe ti ararẹ, pẹlu awọn kokoro arun symbiotic ati awọn ajẹkù DNA lati awọn ohun alumọni ti o jẹ aṣoju ti awọn ilolupo eda abemi omi okun folkano tutu.Hemolymph ccfDNA tun ni awọn ilana ọlọjẹ ti o jade lati awọn ọlọjẹ pẹlu awọn sakani ogun oriṣiriṣi.A tun ri awọn ajẹkù DNA lati awọn ẹranko multicellular gẹgẹbi awọn ẹja egungun, awọn anemones okun, ewe ati awọn kokoro.Ni ipari, iwadi wa ṣe afihan pe ero LB le ni aṣeyọri ni aṣeyọri si awọn invertebrates omi okun lati ṣe agbejade ẹda-ara ti o dara ni awọn ilolupo eda abemi omi okun.
Awọn agbalagba (55-70 mm gigun) Mytilus platensis (M. platensis) ati Aulacomya atra (A. atra) ni a gba lati awọn eti okun apata intertidal ti Port-au-France (049 ° 21.235 S, 070 ° 13.490 E .).Awọn erekusu Kerguelen ni Oṣu Kejila ọdun 2018. Awọn mussels bulu agbalagba miiran (Mytilus spp.) Ni a gba lati ọdọ olupese iṣowo (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Canada) ati gbe sinu iwọn otutu iṣakoso (4 ° C) ojò ti o ni afẹfẹ ti o ni 10-20 L ti 32‰ brine artificial.( iyo Oríkĕ okun Reef Crystal, Lẹsẹkẹsẹ Òkun, Virginia, USA).Fun idanwo kọọkan, ipari ati iwuwo ti awọn ikarahun kọọkan ni a wọn.
Ilana iwọle ṣiṣi ọfẹ fun eto yii wa lori ayelujara (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).Ni ṣoki, LB hemolymph ni a gba lati awọn iṣan ifasilẹ gẹgẹbi a ti ṣe apejuwe [22].Hemolymph ti ṣe alaye nipasẹ centrifugation ni 1200 × g fun awọn iṣẹju 3, supernatant ti di didi (-20°C) titi o fi lo.Fun ipinya ati isọdi mimọ ti cfDNA, awọn ayẹwo (1.5-2.0 milimita) jẹ thawed ati ṣiṣẹ ni lilo ohun elo NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel, Betlehen, PA) ni ibamu si awọn itọnisọna olupese.ccfDNA ti wa ni ipamọ ni -80°C titi ti itupalẹ siwaju.Ni diẹ ninu awọn idanwo, ccfDNA ti ya sọtọ ati di mimọ nipa lilo Apo Oluwadi DNA QIAamp (QIAGEN, Toronto, Ontario, Canada).DNA ti a sọ di mimọ jẹ iwọn nipa lilo idanwo PicoGreen boṣewa kan.Pipin ajẹkù ti ccfDNA ti o ya sọtọ ni a ṣe atupale nipasẹ capillary electrophoresis ni lilo Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) ni lilo Apo DNA Sensitivity giga kan.Ayẹwo naa ni a ṣe ni lilo 1µl ti ayẹwo ccfDNA ni ibamu si awọn ilana olupese.
Fun tito lẹsẹsẹ ti awọn ajẹkù hemolymph ccfDNA, Génome Québec (Montreal, Quebec, Canada) pese awọn ile ikawe ibọn kekere ni lilo ohun elo Illumina DNA Mix ti ohun elo Illumina MiSeq PE75.Ohun ti nmu badọgba boṣewa (BioO) ti lo.Awọn faili data aise wa lati NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 ati SRR8924809).Didara kika ipilẹ ni a ṣe ayẹwo ni lilo FastQC [23].Trimmomatic [24] ti jẹ lilo fun awọn ohun ti nmu badọgba gige ati awọn kika didara ko dara.Ibọn ka pẹlu awọn ipari ti a so pọ ni FLASH dapọ si awọn kika ẹyọkan to gun pẹlu iwọn apọju ti o kere ju 20 bp lati yago fun awọn ibaamu [25]. Awọn kika kika ti a dapọ ni a ṣe alaye pẹlu BLASTN ni lilo ibi ipamọ data bivalve NCBI Taxonomy (e iye <1e-3 ati 90% homology), ati boju-boju ti awọn atẹle eka-kekere ni a ṣe ni lilo DUST [26]. Awọn kika kika ti a dapọ ni a ṣe alaye pẹlu BLASTN ni lilo ibi ipamọ data bivalve NCBI Taxonomy (e iye <1e-3 ati 90% homology), ati boju-boju ti awọn atẹle eka-kekere ni a ṣe ni lilo DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN скачать начение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей. Awọn iwe kika ti a ti dapọ ni a ṣe alaye pẹlu BLASTN ni lilo ibi ipamọ data bivalve taxonomy NCBI (e iye <1e-3 ati 90% homology), ati boju-boju ọkọọkan idiju kekere ni a ṣe ni lilo DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90%复杂度序列的掩蔽.使用 双 壳类 ncbi 分类 （（<1e-3 和 90% 同源）复杂度 序列 的。。。。。蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием NCBI (значение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование Awọn iwe kika ti a ti dapọ ni a ṣe alaye pẹlu BLASTN ni lilo ibi ipamọ data bivalve taxonomic NCBI (e iye <1e-3 ati 90% homology), ati boju-boju ọkọọkan idiju kekere ni a ṣe ni lilo DUST [26].Awọn kika ti pin si awọn ẹgbẹ meji: ti o ni ibatan si awọn ilana bivalve (nibi ti a pe ni kika-ara) ati ti ko ni ibatan (kii ṣe kika-ara).Awọn ẹgbẹ meji ni a pejọ lọtọ ni lilo MEGAHIT lati ṣe agbekalẹ awọn contigs [27].Nibayi, pinpin taxonomic ti awọn kika microbiome ajeji jẹ tito lẹtọ ni lilo Kraken2 [28] ati aworan aworan ti o jẹ aṣoju nipasẹ iwe apẹrẹ Krona kan lori Agbaaiye [29, 30].Awọn kmers ti o dara julọ ni ipinnu lati jẹ kmers-59 lati awọn adanwo alakoko wa. Awọn contigs ti ara ẹni lẹhinna ni idanimọ nipasẹ titete pẹlu BLASTN (bivalve NCBI database, e value <1e-10 ati 60% homology) fun asọye ipari kan. Awọn contigs ti ara ẹni lẹhinna ni idanimọ nipasẹ titete pẹlu BLASTN (bivalve NCBI database, e value <1e-10 ati 60% homology) fun asọye ipari kan. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN 1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. Awọn contigs ti ara ẹni lẹhinna jẹ idanimọ nipasẹ ibaramu lodi si BLASTN (database bivalve NCBI, e iye <1e-10 ati 60% homology) fun asọye ipari.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для. вустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). Awọn contigs ti ara ẹni lẹhinna ni idanimọ fun asọye ikẹhin nipasẹ ibaramu lodi si BLASTN (data data bivalve NCBI, e iye <1e-10 ati 60% homology). Ni afiwe, awọn contigs ẹgbẹ ti kii ṣe ti ara ẹni ni a ṣe alaye pẹlu BLASTN (nt NCBI database, e iye <1e-10 ati 60% homology). Ni afiwe, awọn contigs ẹgbẹ ti kii ṣe ti ara ẹni ni a ṣe alaye pẹlu BLASTN (nt NCBI database, e iye <1e-10 ati 60% homology). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных NT NCBI, e) . Ni afiwe, awọn contigs ẹgbẹ ajeji ni a ṣe alaye pẹlu BLASTN (data data NT NCBI, e iye <1e-10 ati 60% homology).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN. 0 ati гомология 60%). Ni afiwe, awọn contigs ẹgbẹ ti kii ṣe ti ara ẹni ni a ṣe alaye pẹlu BLASTN (nt NCBI database, e value <1e-10 ati 60% homology). BLASTX tun ṣe lori awọn contigs ti kii ṣe ti ara ẹni ni lilo awọn data data NCBI amuaradagba nr ati RefSeq (e iye <1e-10 ati 60% homology). BLASTX tun ṣe lori awọn contigs ti kii ṣe ti ara ẹni ni lilo awọn data data NCBI amuaradagba nr ati RefSeq (e iye <1e-10 ati 60% homology). BLASTX был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI0 60%). BLASTX tun ṣe lori awọn contigs ti kii ṣe ti ara ẹni nipa lilo awọn data data amuaradagba nr ati RefSeq NCBI (e iye <1e-10 ati 60% homology).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60）吧）还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60）吧） BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белкя nr и RefSeq NCBI ( e . BLASTX tun ṣe lori awọn contigs ti kii ṣe ti ara ẹni nipa lilo awọn data data amuaradagba nr ati RefSeq NCBI (e iye <1e-10 ati 60% homology).Awọn adagun adagun BLASTN ati BLASTX ti awọn kontigi-ara-ẹni duro fun awọn idii ipari (wo Faili Afikun).
Awọn alakoko ti a lo fun PCR ti wa ni atokọ ni Tabili S1.Taq DNA polymerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) ni a lo lati ṣe alekun awọn jiini ibi-afẹde ccfDNA.Awọn ipo ifasilẹ wọnyi ni a lo: denaturation ni 95°C fun iṣẹju 3, 95°C fun iṣẹju kan, ṣeto iwọn otutu annealing fun iṣẹju 1, elongation ni 72°C fun iṣẹju 1, awọn iyipo 35, ati nikẹhin 72°C laarin iṣẹju mẹwa 10..Awọn ọja PCR ti yapa nipasẹ electrophoresis ni awọn gels agarose (1.5%) ti o ni SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) ni 95 V.
Mussels (Mytilus spp.) ni acclimatized ni 500 milimita oxygenated omi okun (32 PSU) fun wakati 24 ni 4 ° C.DNA Plasmid ti o ni ifibọ ti o nfi koodu galectin-7 cDNA eniyan (nọmba NCBI wọle L07769) ni a ṣafikun si vial ni ifọkansi ikẹhin ti 190 μg/μl.Awọn iṣan ti o wa labẹ awọn ipo kanna laisi afikun DNA ni iṣakoso.Ojò iṣakoso kẹta ti o wa ninu DNA laisi mussels.Lati ṣe atẹle didara DNA ni omi okun, awọn ayẹwo omi okun (20 μl; awọn atunwi mẹta) ni a mu lati inu ojò kọọkan ni akoko itọkasi.Fun wiwa kakiri DNA plasmid, awọn mussels LB jẹ ikore ni awọn akoko itọkasi ati ṣe atupale nipasẹ qPCR ati ddPCR.Nitori akoonu iyọ ti o ga julọ ti omi okun, awọn aliquots ti fomi ni omi didara PCR (1: 10) ṣaaju gbogbo awọn ayẹwo PCR.
PCR droplet oni nọmba (ddPCR) ni a ṣe ni lilo ilana BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Canada).Lo profaili iwọn otutu lati pinnu iwọn otutu to dara julọ (Table S1).Silė won ti ipilẹṣẹ nipa lilo a QX200 monomono ju (BioRad).ddPCR ti ṣe bi atẹle: 95°C fun iṣẹju 5, awọn akoko 50 ti 95°C fun awọn iṣẹju 30 ati iwọn otutu annealing ti a fun fun iṣẹju 1 ati 72°C fun awọn iṣẹju 30, 4°C fun iṣẹju 5 ati 90°C laarin iṣẹju marun.Nọmba awọn silẹ ati awọn aati rere (nọmba awọn adakọ/µl) ni a wọn ni lilo oluka silẹ QX200 (BioRad).Awọn ayẹwo pẹlu kere ju 10,000 droplets ni a kọ.Iṣakoso apẹrẹ ko ṣe ni gbogbo igba ti ddPCR ti ṣiṣẹ.
qPCR ṣe ni lilo Rotor-Gene® 3000 (Iwadi Corbett, Sydney, Australia) ati LGALS7 awọn alakoko pato.Gbogbo awọn PCR pipo ni a ṣe ni 20 µl ni lilo QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN).qPCR ti bẹrẹ pẹlu idawọle iṣẹju 15 ni 95 ° C ti o tẹle nipasẹ awọn iyipo 40 ni 95°C fun awọn aaya 10 ati ni 60°C fun awọn aaya 60 pẹlu ikojọpọ data kan.Iyipada yo ti ipilẹṣẹ nipa lilo awọn wiwọn itẹlera ni 95°C fun 5 s, 65°C fun 60 s, ati 97°C ni opin qPCR.QPCR kọọkan ni a ṣe ni ilọpo mẹta, ayafi fun awọn ayẹwo iṣakoso.
Níwọ̀n bí wọ́n ti mọ àwọn ewéko fún ìwọ̀n ìsẹ̀lẹ̀ gíga wọn, a kọ́kọ́ ṣe ìwádìí bóyá wọ́n lè ṣe àlẹ̀mọ́ kí wọ́n sì dá àwọn àjákù DNA tí ó wà nínú omi òkun dúró.A tún nífẹ̀ẹ́ sí bóyá àwọn àjákù wọ̀nyí ń kóra jọ sínú ẹ̀rọ ọ̀nà ọ̀rọ̀-ẹ̀jẹ̀ tí ó ṣí sílẹ̀.A yanju ọran yii ni idanwo nipa wiwa kapa ti awọn ajẹkù DNA tiotuka ti a ṣafikun si awọn tanki mussel buluu.Lati dẹrọ ipasẹ awọn ajẹkù DNA, a lo ajeji (kii ṣe ara) DNA plasmid ti o ni apilẹṣẹ galectin-7 ninu.ddPCR tọpasẹ awọn ajẹkù DNA plasmid ninu omi okun ati awọn ẹran.Awọn abajade wa fihan pe ti iye awọn ajẹkù DNA ti o wa ninu omi okun duro ni igbagbogbo ni akoko pupọ (to awọn ọjọ 7) ni isansa ti mussels, lẹhinna ni iwaju awọn mussels ipele yii fẹrẹ parẹ patapata laarin awọn wakati 8 (Fig. 1a,b).Awọn ajẹkù ti DNA exogenous ni a rii ni irọrun laarin awọn iṣẹju 15 ni omi inu inu ati hemolymph (Fig. 1c).Awọn ajẹkù wọnyi tun le rii titi di wakati mẹrin lẹhin ifihan.Iṣẹ ṣiṣe sisẹ yii pẹlu ọwọ si awọn ajẹkù DNA jẹ afiwera si iṣẹ sisẹ ti kokoro arun ati ewe [31].Awọn abajade wọnyi daba pe awọn ẹran le ṣe àlẹmọ ati kojọpọ DNA ajeji ni awọn yara ito wọn.
Awọn ifọkansi ibatan ti DNA plasmid ninu omi okun ni wiwa (A) tabi isansa (B) ti awọn ẹran, ti wọn nipasẹ ddPCR.Ni A, awọn abajade jẹ afihan bi awọn ipin ogorun, pẹlu awọn aala ti awọn apoti ti o nsoju awọn ipin 75th ati 25th.Iwọn logarithmic ti o ni ibamu jẹ afihan ni pupa, ati agbegbe ti iboji ni grẹy duro fun aarin igbẹkẹle 95%.Ni B, laini pupa duro fun itumọ ati laini buluu duro fun aarin igbẹkẹle 95% fun ifọkansi.C ikojọpọ ti DNA plasmid ninu hemolymph ati valvular ito ti mussels ni orisirisi awọn akoko lẹhin ti awọn afikun ti plasmid DNA.Awọn abajade jẹ afihan bi awọn ẹda pipe ti a rii/ml (± SE).
Nigbamii ti, a ṣe iwadii ipilẹṣẹ ti ccfDNA ni awọn ẹfọ ti a gba lati awọn ibusun mussel lori Awọn erekusu Kerguelen, ẹgbẹ latọna jijin ti awọn erekuṣu ti o ni ipa anthropogenic lopin.Fun idi eyi, cccDNA lati awọn hemolymphs mussel ti ya sọtọ ati ti sọ di mimọ nipasẹ awọn ọna ti o wọpọ lati sọ cccDNA eniyan di mimọ [32, 33].A rii pe apapọ awọn ifọkansi hemolymph ccfDNA ninu awọn mussels wa ni awọn micrograms kekere fun iwọn hemolymph milimita (wo Tabili S2, Alaye Afikun).Iwọn ifọkansi yii tobi pupọ ju awọn eniyan ti o ni ilera lọ (awọn nanograms kekere fun milimita), ṣugbọn ni awọn iṣẹlẹ to ṣọwọn, ninu awọn alaisan alakan, ipele ccfDNA le de ọdọ awọn microgram pupọ fun milimita [34, 35].Atupalẹ ti pinpin iwọn ti hemolymph ccfDNA fihan pe awọn ajẹkù wọnyi yatọ pupọ ni iwọn, ti o wa lati 1000 bp si 1000 bp.to 5000 bp (aworan 2).Awọn abajade ti o jọra ni a gba ni lilo Apo oluṣewadii QIAamp ti o da lori silica, ọna ti a lo nigbagbogbo ninu imọ-jinlẹ oniwadi lati ya sọtọ ni iyara ati sọ DNA genomic di mimọ lati awọn ayẹwo DNA ifọkansi kekere, pẹlu ccfDNA [36].
Aṣoju ccfDNA electrophoregram ti hemolymph mussel.Ti yọ jade pẹlu NucleoSnap Plasma Kit (oke) ati Apo oniwadi DNA QIAamp.Idite violin B n ṣe afihan pinpin awọn ifọkansi hemolymph ccfDNA (± SE) ninu awọn ẹran.Awọn laini dudu ati pupa duro fun agbedemeji ati awọn ipele akọkọ ati kẹta, lẹsẹsẹ.
O fẹrẹ to 1% ti ccfDNA ninu eniyan ati awọn primates ni orisun ajeji [21, 37].Fi fun eto iṣan-ẹjẹ ologbele-ṣii ti awọn bivalves, omi okun ti o ni microbial, ati pinpin iwọn ti mussel ccfDNA, a pinnu pe mussel hemolymph ccfDNA le ni adagun nla ati oniruuru ti DNA microbial.Lati ṣe idanwo idawọle yii, a ṣe atẹle hemolymph ccfDNA lati awọn ayẹwo Aulacomya atra ti a gba lati awọn erekusu Kerguelen, ti o mu diẹ sii ju miliọnu 10 kika, 97.6% eyiti o kọja iṣakoso didara.Awọn kika naa lẹhinna ni ipin gẹgẹbi awọn orisun ti ara ẹni ati ti kii ṣe ti ara ẹni nipa lilo BLASTN ati awọn apoti isura data bivalve NCBI (Fig. S1, Alaye Afikun).
Ninu eniyan, mejeeji iparun ati DNA mitochondrial ni a le tu silẹ sinu ẹjẹ [38].Sibẹsibẹ, ninu iwadi ti o wa lọwọlọwọ, ko ṣee ṣe lati ṣe apejuwe ni apejuwe awọn DNA genomic iparun ti awọn mussels, fun pe a ko ti ṣe apejuwe A. atra genome tabi ṣe apejuwe.Sibẹsibẹ, a ni anfani lati ṣe idanimọ nọmba awọn ajẹkù ccfDNA ti ipilẹṣẹ tiwa ni lilo ile-ikawe bivalve (Fig. S2, Alaye Afikun).A tun jẹrisi wiwa awọn ajẹkù DNA ti ipilẹṣẹ tiwa nipasẹ didari PCR ti awọn jiini A. atra wọnyẹn ti o tẹle (Fig. 3).Bakanna, fun ni pe genome mitochondrial ti A. atra wa ni awọn ipamọ data ita gbangba, ọkan le wa ẹri fun wiwa awọn ajẹkù ccfDNA mitochondrial ni hemolymph ti A. atra.Iwaju awọn ajẹkù DNA mitochondrial ni a fọwọsi nipasẹ imudara PCR (Fig. 3).
Orisirisi awọn jiini mitochondrial wa ni hemolymph ti A. atra (awọn aami pupa - nọmba iṣura: SRX5705969) ati M. platensis (awọn aami buluu - nọmba iṣura: SRX5705968) ti o pọju nipasẹ PCR.Nọmba ti a ṣe atunṣe lati Breton et al., 2011 B Imudara ti hemolymph supernatant lati A. atra Ti fipamọ sori iwe FTA.Lo punch 3 mm kan lati ṣafikun taara si tube PCR ti o ni idapọ PCR ninu.
Fun akoonu makirobia lọpọlọpọ ti o wa ninu omi okun, a kọkọ dojukọ lori isọdisi awọn ilana DNA microbial ni hemolymph.Lati ṣe eyi, a lo awọn ọgbọn oriṣiriṣi meji.Ilana akọkọ ti a lo Kraken2, eto isọdi-ọna ti o da lori algoridimu ti o le ṣe idanimọ awọn itọsẹ makirobia pẹlu deede ti o ṣe afiwe si BLAST ati awọn irinṣẹ miiran [28].Diẹ ẹ sii ju awọn kika 6719 ni a pinnu lati jẹ ti orisun kokoro-arun, lakoko ti 124 ati 64 wa lati archaea ati awọn ọlọjẹ, lẹsẹsẹ (Fig. 4).Awọn ajẹkù DNA ti kokoro-arun ti o pọ julọ ni Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%), ati Bacteroidates (17%) (Fig. 4a).Pinpin yii wa ni ibamu pẹlu awọn iwadii iṣaaju ti microbiome buluu buluu buluu [39, 40].Gammaproteobacteria jẹ kilasi akọkọ ti Proteobacteria (44%), pẹlu ọpọlọpọ awọn Vibrionales (Fig. 4b).Ọna ddPCR jẹrisi wiwa Vibrio DNA ajẹkù ni ccfDNA ti A. atra hemolymph (Fig. 4c) [41].Lati gba alaye diẹ sii nipa ipilẹṣẹ kokoro-arun ti ccfDNA, ọna afikun ni a mu (Fig. S2, Alaye Afikun). Ni ọran yii, awọn kika ti o ṣopọpọ ni a pejọ bi awọn kika-ipari-ipari ati pe wọn jẹ ipin bi ti ara ẹni (bivalves) tabi ipilẹṣẹ ti ara ẹni ni lilo BLASTN ati iye e ti 1e−3 ati gige kan pẹlu>90% homology. Ni ọran yii, awọn kika ti o ṣopọpọ ni a pejọ bi awọn kika-ipari-ipari ati pe wọn jẹ ipin bi ti ara ẹni (bivalves) tabi ipilẹṣẹ ti ara ẹni ni lilo BLASTN ati iye e ti 1e−3 ati gige kan pẹlu>90% homology. В. ворчатые моллюски) или чужие по происхождению Ni ọran yii, awọn iwe kika agbekọja ni a gba bi awọn kika ti o pari-so pọ ati pe wọn jẹ ipin bi abinibi (bivalve) tabi ti kii ṣe atilẹba ni lilo BLASTN ati iye e ti 1e-3 ati gige pẹlu> 90% homology.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值和>90%为自身（双壳类）或非自身来源。在 这种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 使用源性 的 分类 自身（双 壳类） 非 自身。 В. тые моллюски) или несобственные по происхождению Ni ọran yii, awọn iwe kika agbekọja ni a gba bi awọn kika ti o pari-so pọ ati tito lẹtọ bi tirẹ (bivalves) tabi ti kii ṣe atilẹba ni lilo e BLASTN ati awọn iye 1e-3 ati iloro homology> 90%.Niwọn igba ti A. atra-genome ti ko tii ṣe lẹsẹsẹ, a lo ilana apejọ de novo ti olupejọ MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS).Apapọ 147,188 contigs ti jẹ idanimọ bi igbẹkẹle (bivalves) ti ipilẹṣẹ.Awọn contigs wọnyi lẹhinna gbamu pẹlu awọn iye e-1e-10 ni lilo BLASTN ati BLASTX.Ilana yii gba wa laaye lati ṣe idanimọ awọn ajẹkù 482 ti kii ṣe bivalve ti o wa ninu A. atra ccfDNA.Diẹ ẹ sii ju idaji (57%) ti awọn ajẹkù DNA wọnyi ni a gba lati awọn kokoro arun, nipataki lati awọn symbionts gill, pẹlu sulfotrophic symbionts, ati lati gill symbionts Solemya velum (Fig. 5).
Opo ibatan ni ipele iru.B oniruuru makirobia ti phyla akọkọ meji (Firmicutes ati Proteobacteria).Aṣoju titobi ti ddPCR C Vibrio spp.A. Awọn ajẹkù ti jiini 16S rRNA (bulu) ni awọn hemolymphs atra mẹta.
Apapọ 482 awọn contigs ti a gba ni a ṣe atupale.Profaili gbogbogbo ti pinpin taxonomic ti awọn alaye contig metagenomic (prokaryotes ati eukaryotes).B Pinpin alaye ti awọn ajẹku DNA kokoro ti a damọ nipasẹ BLASTN ati BLASTX.
Iwadi Kraken2 tun fihan pe mussel ccfDNA ni awọn ajẹkù DNA archaeal, pẹlu awọn ajẹkù DNA ti Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%), ati Thaurmarcheota (11%) (Fig. 6a).Iwaju awọn ajẹkù DNA ti o wa lati Euryarchaeota ati Crenarchaeota, ti a rii tẹlẹ ni agbegbe microbial ti awọn mussels Californian, ko yẹ ki o wa bi iyalẹnu [42].Botilẹjẹpe Euryarchaeota nigbagbogbo ni nkan ṣe pẹlu awọn ipo to gaju, o ti mọ ni bayi pe mejeeji Euryarchaeota ati Crenarcheota wa laarin awọn prokaryotes ti o wọpọ julọ ni agbegbe cryogenic okun [43, 44].Iwaju awọn microorganisms methanogenic ninu awọn ẹran ara kii ṣe iyalẹnu, fun awọn ijabọ aipẹ ti awọn n jo methane lọpọlọpọ lati awọn n jo isalẹ lori Plateau Kerguelen [45] ati iṣelọpọ methane microbial ti o ṣee ṣe akiyesi ni eti okun ti Kerguelen Islands [46].
Ifarabalẹ wa lẹhinna yipada si awọn kika lati awọn ọlọjẹ DNA.Si ti o dara julọ ti imọ wa, eyi ni ikẹkọ akọkọ ti ibi-afẹde ti akoonu ọlọjẹ ti awọn ẹfọ.Gẹgẹbi a ti ṣe yẹ, a ri awọn ajẹkù DNA ti awọn bacteriophages (Caudovirales) (Fig. 6b).Bibẹẹkọ, DNA gbogun ti o wọpọ julọ wa lati inu phylum ti awọn nucleocytoviruses, ti a tun mọ ni ọlọjẹ cytoplasmic nla DNA (NCLDV), eyiti o ni jiini ti o tobi julọ ti eyikeyi ọlọjẹ.Laarin phylum yii, ọpọlọpọ awọn ilana DNA jẹ ti awọn idile Mimimidoviridae (58%) ati Poxviridae (21%), ti awọn ogun adayeba pẹlu awọn vertebrates ati arthropods, lakoko ti ipin diẹ ti awọn ilana DNA wọnyi jẹ ti awọn ewe virological ti a mọ.Ṣe akoran awọn ewe eukaryotic omi okun.Awọn ilana naa tun gba lati ọlọjẹ Pandora, ọlọjẹ omiran pẹlu iwọn jiini ti o tobi julọ ti eyikeyi gbogbo gbogun ti a mọ.O yanilenu, ibiti awọn ọmọ-ogun ti a mọ pe o ni akoran pẹlu ọlọjẹ naa, gẹgẹbi ipinnu nipasẹ ilana-tẹle hemolymph ccfDNA, jẹ eyiti o tobi pupọ (Ọya S3, Alaye Afikun).O pẹlu awọn ọlọjẹ ti o ni akoran awọn kokoro bii Baculoviridae ati Iridoviridae, ati awọn ọlọjẹ ti o ni akoran amoeba, algae ati vertebrates.A tun rii awọn ilana ti o baamu Pithovirus sibericum genome.Pitoviruses (ti a tun mọ ni “awọn ọlọjẹ Zombie”) ni a kọkọ ya sọtọ lati 30,000 ọdun permafrost ni Siberia [47].Nitorinaa, awọn abajade wa ni ibamu pẹlu awọn ijabọ iṣaaju ti n fihan pe kii ṣe gbogbo awọn ẹya ode oni ti awọn ọlọjẹ wọnyi ti parun [48] ati pe awọn ọlọjẹ wọnyi le wa ni awọn ilolupo eda abemi omi ti o wa ni isale jijin.
Nikẹhin, a ṣe idanwo lati rii boya a le rii awọn ajẹkù DNA lati awọn ẹranko multicellular miiran.Apapọ awọn contigs ajeji 482 ni idanimọ nipasẹ BLASTN ati BLASTX pẹlu nt, nr ati awọn ile-ikawe RefSeq (genomic ati protein).Awọn abajade wa fihan pe laarin awọn ajẹkù ajeji ti ccfDNA ti awọn ẹranko multicellular DNA ti awọn egungun egungun bori (Fig. 5).Awọn ajẹkù DNA lati awọn kokoro ati awọn eya miiran tun ti rii.Apa kan ti o tobi ju ti awọn ajẹkù DNA ko ti ṣe idanimọ, o ṣee ṣe nitori aibikita nọmba nla ti awọn eya omi ni awọn apoti isura data genomic ni akawe si awọn eya ori ilẹ [49].
Ninu iwe ti o wa lọwọlọwọ, a lo imọran LB si awọn ẹran ara, ni jiyàn pe hemolymph ccfDNA shot lesese le pese oye sinu akopọ ti awọn ilolupo eda abemi omi okun.Ni pato, a rii pe 1) hemolymph mussel ni awọn ifọkansi ti o ga julọ (awọn ipele microgram) ti o tobi pupọ (~ 1-5 kb) awọn ajẹkù DNA ti n kaakiri;2) Awọn ajẹkù DNA wọnyi jẹ ominira ati ti kii ṣe ominira 3) Lara awọn orisun ajeji ti awọn ajẹkù DNA wọnyi, a ri kokoro-arun, archaeal ati DNA viral, bakannaa DNA ti awọn ẹranko multicellular miiran;4) Ikojọpọ ti awọn ajẹkù ccfDNA ajeji wọnyi ni hemolymph waye ni iyara ati ṣe alabapin si iṣẹ ṣiṣe sisẹ inu ti awọn mussels.Ni ipari, iwadi wa ṣe afihan pe ero ti LB, eyiti o ti lo ni pataki ni aaye ti biomedicine, ṣe koodu orisun ọlọrọ ṣugbọn ti a ko ṣe iwadii ti o le ṣee lo lati ni oye ibaraenisepo laarin awọn eya sentinel ati agbegbe wọn daradara.
Ni afikun si awọn primates, ipinya ccfDNA ti jẹ ijabọ ninu awọn ẹran-ọsin, pẹlu eku, awọn aja, awọn ologbo, ati awọn ẹṣin [50, 51, 52].Bibẹẹkọ, si imọ wa, ikẹkọọ wa ni akọkọ lati jabo wiwa ati tito lẹsẹsẹ ti ccfDNA ninu iru omi okun pẹlu eto kaakiri ṣiṣi.Ẹya anatomical yii ati agbara sisẹ ti awọn ẹran le, o kere ju ni apakan, ṣe alaye awọn abuda iwọn ti o yatọ ti awọn ajẹku DNA ti n kaakiri ni akawe si awọn eya miiran.Ninu eniyan, pupọ julọ awọn ajẹkù DNA ti n kaakiri ninu ẹjẹ jẹ awọn ajẹkù kekere ti o wa ni iwọn lati 150 si 200 bp.pẹlu o pọju tente 167 bp [34, 53].Apa kekere ṣugbọn pataki ti awọn ajẹkù DNA wa laarin 300 ati 500 bp ni iwọn, ati pe nipa 5% gun ju 900 bp.[54].Idi fun pinpin iwọn yii ni pe orisun akọkọ ti ccfDNA ni pilasima waye bi abajade iku sẹẹli, boya nitori iku sẹẹli tabi nitori negirosisi ti awọn sẹẹli hematopoietic kaakiri ninu awọn eniyan ti o ni ilera tabi nitori apoptosis ti awọn sẹẹli tumo ninu awọn alaisan alakan (ti a mọ ni DNA tumor circulating).ctDNA).Pipin iwọn ti hemolymph ccfDNA ti a rii ninu awọn mussels wa lati 1000 si 5000 bp, ni iyanju pe mussel ccfDNA ni orisun ti o yatọ.Eyi jẹ arosọ ọgbọn kan, niwọn bi awọn mussels ni eto iṣan-ẹjẹ ologbele-ṣii ati gbe ni awọn agbegbe omi inu omi ti o ni awọn ifọkansi giga ti DNA genomic microbial.Ni otitọ, awọn idanwo ile-iyẹwu wa nipa lilo DNA exogenous ti fihan pe awọn mussels ṣajọpọ awọn ajẹkù DNA ni omi okun, o kere ju lẹhin awọn wakati diẹ wọn ti bajẹ lẹhin gbigbe cellular ati / tabi tu silẹ ati / tabi ti o fipamọ sinu ọpọlọpọ awọn ajọ.Fi fun iye awọn sẹẹli (mejeeji prokaryotic ati eukaryotic), lilo awọn apakan intravalvular yoo dinku iye ccfDNA lati awọn orisun ti ara ẹni ati lati awọn orisun ajeji.Ṣiyesi pataki ti ajesara innate bivalve ati nọmba nla ti awọn phagocytes ti n kaakiri, a tun sọ siwaju pe paapaa ccfDNA ajeji ti ni idarato ni titan kaakiri awọn phagocytes ti o ṣajọpọ DNA ajeji lori jijẹ awọn microorganisms ati/tabi idoti cellular.Papọ, awọn abajade wa fihan pe bivalve hemolymph ccfDNA jẹ ibi ipamọ alailẹgbẹ ti alaye molikula ati fikun ipo wọn gẹgẹbi eya sentinel.
Awọn data wa fihan pe tito-tẹle ati itupalẹ awọn ajẹkù hemolymph ccfDNA ti kokoro-arun le pese alaye pataki nipa eweko kokoro arun ati awọn kokoro arun ti o wa ninu ilolupo eda abemi omi agbegbe.Awọn ilana ilana itọsẹ shot ti ṣafihan awọn ilana ti kokoro arun commensal A. atra gill ti yoo ti padanu ti o ba ti lo awọn ọna idanimọ 16S rRNA ti aṣa, nitori ni apakan si ojuṣaaju ikawe ikawe kan.Ni otitọ, lilo data LB wa ti a gba lati M. platensis ni Layer mussel kanna ni Kerguelen fihan pe akopọ ti gill-sociated bacterial symbionts jẹ kanna fun awọn eya mussel mejeeji (Fig. S4, Alaye Afikun).Ibajọra ti awọn ẹran meji ti o yatọ ni jiini le ṣe afihan akojọpọ awọn agbegbe kokoro-arun ni otutu, imi-ọjọ, ati awọn idogo folkano ti Kerguelen [55, 56, 57, 58].Awọn ipele ti o ga julọ ti awọn microorganisms ti o dinku imi-ọjọ ni a ti ṣapejuwe daradara nigba ikore awọn ẹfọ lati awọn agbegbe eti okun bioturbated [59], gẹgẹbi eti okun Port-au-France.Oṣeeṣe miiran ni pe o le ni ipa lori awọn irugbin elegede commensal nipasẹ gbigbe petele [60, 61].Iwadi diẹ sii ni a nilo lati pinnu ibamu laarin agbegbe okun, oju ilẹ oju omi, ati akojọpọ awọn kokoro arun symbiotic ninu awọn ẹran.Awọn ijinlẹ wọnyi nlọ lọwọ lọwọlọwọ.
Gigun ati ifọkansi ti hemolymph ccfDNA, irọrun ti ìwẹnumọ rẹ, ati didara ga lati gba itọsẹ ibọn ni iyara jẹ diẹ ninu ọpọlọpọ awọn anfani ti lilo mussel ccfDNA lati ṣe ayẹwo ipinsiyeleyele ni awọn ilolupo eda abemi okun.Ọna yii jẹ doko pataki fun sisọ awọn agbegbe gbogun ti (viromes) ni ilolupo eda ti a fun [62, 63].Ko dabi awọn kokoro arun, archaea, ati awọn eukaryotes, awọn genomes gbogun ti ko ni awọn jiini ti a fipamọ nipa ti ara gẹgẹbi awọn ilana 16S.Awọn abajade wa tọka si pe awọn biopsies olomi lati awọn ẹya afihan gẹgẹbi awọn ẹfọ le ṣee lo lati ṣe idanimọ awọn nọmba ti o tobi pupọ ti awọn ajẹkù ọlọjẹ ccfDNA ti a mọ lati ṣe akoran awọn ọmọ ogun ti o maa n gbe awọn eto ilolupo oju omi okun.Eyi pẹlu awọn ọlọjẹ ti a mọ lati ṣe akoran awọn protozoa, arthropods, kokoro, eweko, ati awọn ọlọjẹ kokoro (fun apẹẹrẹ, awọn bacteriophages).Ipinpin ti o jọra ni a rii nigba ti a ṣe ayẹwo hemolymph ccfDNA virome ti awọn mussels buluu (M. platensis) ti a kojọpọ ni Layer mussel kanna ni Kerguelen (Table S2, Alaye Afikun).Itọpasẹ Shotgun ti ccfDNA jẹ nitootọ ọna tuntun ti n ni ipa ninu iwadi ti virome ti eniyan tabi awọn eya miiran [21, 37, 64].Ọna yii jẹ iwulo paapaa fun kikọ ẹkọ awọn ọlọjẹ DNA ti o ni ilopo meji, nitori ko si jiini kan ti o tọju laarin gbogbo awọn ọlọjẹ DNA ti o ni okun meji, ti o nsoju oniruuru pupọ julọ ati kilasi awọn ọlọjẹ ni Baltimore [65].Botilẹjẹpe pupọ julọ awọn ọlọjẹ wọnyi ko ni ipin ati pe o le pẹlu awọn ọlọjẹ lati apakan ti a ko mọ patapata ti agbaye gbogun [66], a rii pe awọn viromes ati awọn sakani ogun ti awọn mussels A. atra ati M. platensis ṣubu laarin awọn eya meji.bakanna (wo nọmba S3, alaye afikun).Ijọra yii kii ṣe iyalẹnu, nitori o le ṣe afihan aini yiyan ni gbigba DNA ti o wa ni agbegbe.Awọn ẹkọ-ọjọ iwaju nipa lilo RNA mimọ ni a nilo lọwọlọwọ lati ṣe afihan virome RNA.
Ninu iwadi wa, a lo opo gigun ti epo lile ti a ṣe deede lati iṣẹ ti Kowarski ati awọn ẹlẹgbẹ [37], ti o lo piparẹ-igbesẹ meji ti awọn iwe kika ati awọn contigs ṣaaju ati lẹhin apejọ ti ccfDNA abinibi, ti o fa ipin giga ti awọn kika ti ko ni aworan.Nitoribẹẹ, a ko le ṣe akoso jade pe diẹ ninu awọn kika ti ko ni aworan le tun ni ipilẹṣẹ tiwọn, nipataki nitori a ko ni genome itọkasi fun eya mussel yii.A tun lo opo gigun ti epo nitori a ṣe aniyan nipa awọn chimeras laarin ara ẹni ati awọn kika ti kii ṣe ti ara ẹni ati awọn ipari kika ti o ṣe ipilẹṣẹ nipasẹ Illumina MiSeq PE75.Idi miiran fun pupọ julọ ti awọn kika kika ti ko ni iyasọtọ ni pe pupọ ninu awọn microbes omi okun, paapaa ni awọn agbegbe jijin gẹgẹbi Kerguelen, ko ti ṣe alaye.A lo Illumina MiSeq PE75, ti a ro pe awọn ipari ajẹkù ccfDNA ti o jọra si ccfDNA eniyan.Fun awọn iwadii iwaju, fun awọn abajade wa ti n fihan pe hemolymph ccfDNA ni kika to gun ju awọn eniyan ati/tabi awọn ẹran-ọsin lọ, a ṣeduro lilo pẹpẹ itọsẹ ti o dara julọ fun awọn ajẹkù ccfDNA gigun.Iwa yii yoo jẹ ki o rọrun pupọ lati ṣe idanimọ awọn itọkasi diẹ sii fun itupalẹ jinlẹ.Ngba pipe ti ko si lọwọlọwọ A. atra tito-jiini jiini yoo tun dẹrọ pupọ si iyasoto ti ccfDNA lati awọn orisun ti ara ẹni ati ti ara ẹni.Fun pe iwadi wa ti dojukọ lori iṣeeṣe ti lilo imọran ti biopsy olomi si awọn ẹran, a nireti pe bi a ti lo ero yii ni iwadii ọjọ iwaju, awọn irinṣẹ tuntun ati awọn opo gigun ti epo yoo ni idagbasoke lati mu agbara ti ọna yii pọ si lati ṣe iwadi awọn oniruuru microbial ti awọn mussels.tona ilolupo.
Gẹgẹbi biomarker ile-iwosan ti kii ṣe invasive, awọn ipele pilasima eniyan ti o ga ti ccfDNA ni nkan ṣe pẹlu ọpọlọpọ awọn arun, ibajẹ ara, ati awọn ipo aapọn [67,68,69].Ilọsoke yii ni nkan ṣe pẹlu itusilẹ ti awọn ajẹkù DNA ti ipilẹṣẹ tirẹ lẹhin ibajẹ àsopọ.A koju ọran yii nipa lilo aapọn igbona nla, ninu eyiti a ti farahan awọn ẹran ni ṣoki si iwọn otutu ti 30 °C.A ṣe itupalẹ yii lori awọn oriṣiriṣi oriṣiriṣi mẹta ti mussels ni awọn adanwo ominira mẹta.Sibẹsibẹ, a ko rii iyipada eyikeyi ninu awọn ipele ccfDNA lẹhin aapọn ooru nla (wo Nọmba S5, alaye afikun).Awari yii le ṣe alaye, o kere ju ni apakan, otitọ pe awọn mussels ni eto iṣọn-ẹjẹ ologbele-ṣii kan ati pe o ṣajọpọ iye nla ti DNA ajeji nitori iṣẹ ṣiṣe sisẹ giga wọn.Ni ida keji, awọn ẹran, bii ọpọlọpọ awọn invertebrates, le jẹ sooro diẹ sii si ibajẹ tissu ti o fa wahala, nitorinaa diwọn idasilẹ ti ccfDNA ni hemolymph wọn [70, 71].
Titi di oni, itupalẹ DNA ti ipinsiyeleyele ninu awọn eto ilolupo inu omi ti dojukọ pataki lori DNA (eDNA) metabarcoding ayika.Sibẹsibẹ, ọna yii nigbagbogbo ni opin ni itupalẹ ipinsiyeleyele nigba ti a lo awọn alakoko.Lilo itọsẹ ibọn kekere yika awọn aropin ti PCR ati yiyan aiṣedeede ti awọn ipilẹ alakoko.Nitorinaa, ni ọna kan, ọna wa sunmọ ọna itọsẹ eDNA Shotgun ti o ga julọ ti a lo laipẹ, eyiti o ni anfani lati ṣe lẹsẹsẹ DNA ti a pin taara ati ṣe itupalẹ fere gbogbo awọn ohun alumọni [72, 73].Sibẹsibẹ, awọn nọmba pataki kan wa ti o ṣe iyatọ LB si awọn ọna eDNA boṣewa.Nitoribẹẹ, iyatọ akọkọ laarin eDNA ati LB ni lilo awọn agbalejo àlẹmọ adayeba.Lilo awọn eya omi bi awọn kanrinkan ati awọn bivalves (Dresseina spp.) gẹgẹbi àlẹmọ adayeba fun kikọ eDNA ni a ti royin [74, 75].Sibẹsibẹ, iwadi Dreissena lo awọn biopsies ti ara lati eyiti a ti yọ DNA jade.Onínọmbà ti ccfDNA lati LB ko nilo biopsy tissu, amọja ati ohun elo ti o gbowolori nigbakan ati awọn eekaderi ti o ni nkan ṣe pẹlu eDNA tabi biopsy tissu.Ni otitọ, a ṣe ijabọ laipẹ pe ccfDNA lati LB le wa ni ipamọ ati itupalẹ pẹlu atilẹyin FTA laisi mimu pq tutu kan, eyiti o jẹ ipenija nla fun iwadii ni awọn agbegbe jijin [76].Iyọkuro ti ccfDNA lati inu awọn biopsies olomi tun rọrun ati pese DNA ti o ga julọ fun tito ibọn ibọn ati itupalẹ PCR.Eyi jẹ anfani nla ti a fun diẹ ninu awọn idiwọn imọ-ẹrọ ti o ni nkan ṣe pẹlu itupalẹ eDNA [77].Irọrun ati idiyele kekere ti ọna iṣapẹẹrẹ tun dara julọ fun awọn eto ibojuwo igba pipẹ.Ni afikun si agbara sisẹ giga wọn, ẹya miiran ti a mọ daradara ti awọn bivalves ni akopọ mucopolysaccharide kemikali ti mucus wọn, eyiti o ṣe agbega gbigba awọn ọlọjẹ [78, 79].Eyi jẹ ki awọn bivalves jẹ àlẹmọ adayeba ti o peye fun jijuwe ipinsiyeleyele ati ipa ti iyipada oju-ọjọ ni ilolupo ilolupo ti omi ti a fun.Botilẹjẹpe wiwa awọn ajẹkù DNA ti o gba ogun ni a le rii bi aropin ti ọna ti a fiwe si eDNA, idiyele ti o nii ṣe pẹlu nini iru ccfDNA abinibi ti a fiwewe si eDNA jẹ oye nigbakanna fun iye alaye ti o pọju ti o wa fun awọn ẹkọ ilera.aiṣedeede ogun.Eyi pẹlu wiwa awọn ilana ti gbogun ti a ṣepọ sinu genome ti agbalejo.Eyi ṣe pataki fun awọn ẹran-ọsin, fun wiwa awọn retroviruses leukemic ti a tan kaakiri ni ita ni awọn bivalves [80, 81].Anfani miiran ti LB lori eDNA ni pe o lo iṣẹ ṣiṣe phagocytic ti awọn sẹẹli ẹjẹ kaakiri ninu hemolymph, eyiti o fa awọn microorganisms (ati awọn genomes wọn).Phagocytosis jẹ iṣẹ akọkọ ti awọn sẹẹli ẹjẹ ni bivalves [82].Nikẹhin, ọna naa gba anfani ti agbara sisẹ giga ti awọn mussels (apapọ 1.5 l / h ti omi okun) ati sisanwo ọjọ meji, eyiti o mu ki idapọpọ awọn ipele oriṣiriṣi ti omi okun pọ si, gbigba gbigba ti eDNA heterologous.[83, 84].Nitorinaa, itupalẹ mussel ccfDNA jẹ ọna ti o nifẹ ti a fun ni ijẹẹmu, eto-ọrọ, ati awọn ipa ayika ti awọn ẹran.Iru si igbekale ti LB ti a gba lati ọdọ eniyan, ọna yii tun ṣii o ṣeeṣe ti wiwọn jiini ati awọn iyipada epigenetic ni DNA ogun ni idahun si awọn nkan ti o yatọ.Fun apẹẹrẹ, awọn imọ-ẹrọ titele iran-kẹta ni a le ni ifojusọna lati ṣe itupalẹ jiini-jakejado methylation ni ccfDNA abinibi nipa lilo ilana atẹle nanopore.Ilana yii yẹ ki o ni irọrun nipasẹ otitọ pe ipari ti awọn ajẹkù mussel ccfDNA ni ibamu pẹlu awọn iru ẹrọ ti n ka kika gigun ti o fun laaye itupalẹ DNA methylation ti o gbooro lati inu ilana ṣiṣe kan laisi iwulo fun awọn iyipada kemikali.85,86] Eyi jẹ iṣeeṣe ti o nifẹ, bi o ti fihan pe awọn ilana methylation DNA ṣe afihan idahun si ọpọlọpọ awọn aapọn ayika.Nitorina, o le pese oye ti o niyelori si awọn ilana ti o wa ni ipilẹ ti o nṣakoso esi lẹhin ifihan si iyipada oju-ọjọ tabi awọn idoti [87].Sibẹsibẹ, lilo LB kii ṣe laisi awọn idiwọn.Tialesealaini lati sọ, eyi nilo wiwa ti awọn eya atọka ninu ilolupo.Gẹgẹbi a ti sọ loke, lilo LB lati ṣe ayẹwo ipinsiyeleyele ti ilolupo eda ti a fun tun nilo opo gigun ti bioinformatics ti o lagbara ti o ṣe akiyesi ifarahan awọn ajẹku DNA lati orisun.Iṣoro pataki miiran ni wiwa awọn genomes itọkasi fun awọn eya omi okun.A nireti pe awọn ipilẹṣẹ bii Project Mammal Genomes Marine ati iṣẹ akanṣe Fish10k ti a ti ṣeto laipẹ [88] yoo dẹrọ iru itupalẹ ni ọjọ iwaju.Ohun elo ti imọran LB si awọn ohun alumọni ifunni omi-omi tun ni ibamu pẹlu awọn ilọsiwaju tuntun ni imọ-ẹrọ atẹle, ti o jẹ ki o baamu daradara fun idagbasoke awọn alamọdaju olona-ohm lati pese alaye pataki nipa ilera ti awọn ibugbe omi oju omi ni idahun si aapọn ayika.
Awọn data itọsẹ genome ti wa ni ifipamọ sinu Ilana kika NCBI Titele https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 labẹ Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Ipa ti iyipada oju-ọjọ lori igbesi aye omi ati awọn ilolupo.Cole Biology.Ọdun 2009;19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al.Wo awọn ipa apapọ ti iyipada oju-ọjọ ati awọn aapọn agbegbe miiran lori agbegbe okun.gbogboogbo ijinle sayensi ayika.2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al.).Imọ ti akọkọ ti Oṣù.Ọdun 2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Dinku ifarada ooru labẹ awọn ipo aapọn ooru ti atunwi ṣe alaye iku igba ooru ti o ga ti awọn ẹran buluu.Iroyin ijinle sayensi 2019;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al.Awọn ayipada aipẹ ni igbohunsafẹfẹ, awọn okunfa ati iye ti iku ẹranko.Proc Natl Acad Sci USA.2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al.Pupọ awọn aarun-ara ti kii ṣe pato-pato le ti fa iku iku ti Pinna nobilis.Igbesi aye.Ọdun 2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM.Ipa ti o pọju iyipada oju-ọjọ lori awọn arun zoonotic Arctic.Int J Circumpolar ilera.Ọdun 2005;64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al.Awọn mussels buluu (Mytilus edulis spp.) Gẹgẹbi awọn ohun alumọni ifihan agbara ni ibojuwo idoti eti okun: atunyẹwo.Mar Environ Res 2017;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Iṣọkan biopsy olomi ni itọju alakan.Nat Rev Mọ Oncol.Ọdun 2017;14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al.Omi biopsy maturation: Gba DNA tumo lati kaakiri.Nat Rev akàn.Ọdun 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Nucleic acids ni pilasima eniyan.Awọn iṣẹju ipade ti awọn oniranlọwọ Soc Biol.Ọdun 1948;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Ipa tuntun kan fun DNA ti ko ni sẹẹli gẹgẹbi aami molikula fun itọju akàn.Iṣiro ti itupalẹ biomolar.Ọdun 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Liquid biopsy wọ ile-iwosan - awọn ọran imuse ati awọn italaya iwaju.Nat Rev Clin Oncol.Ọdun 2021;18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW ati awọn miiran.DNA ọmọ inu oyun wa ninu pilasima iya ati omi ara.Lancet.Ọdun 1997;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Iwadi ti ilana oyun ati awọn ilolu rẹ nipa lilo RNA extracellular ti n kaakiri ninu ẹjẹ awọn obinrin lakoko oyun.Dopediatrics.Ọdun 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al.Biopsy olomi: DNA ti ko ni sẹẹli ti oluranlọwọ ni a lo lati ṣe awari awọn egbo allogeneic ninu alọmọ kidinrin.Nat Rev Nephrol.Ọdun 2021;17:591–603.
Juan FC, Lo YM Innovations ni prenatal aisan: iya pilasima atelesehin.Anna MD.Ọdun 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al.Wiwa pathogen ni iyara pẹlu tito lẹsẹsẹ metagenomic iran ti nbọ ti awọn omi ara ti o ni akoran.Nat Oogun.2021;27:115-24.