O ṣeun fun lilo si Nature.com.Ẹya ẹrọ aṣawakiri ti o nlo ni atilẹyin CSS lopin.Fun iriri ti o dara julọ, a ṣeduro pe ki o lo ẹrọ aṣawakiri imudojuiwọn kan (tabi mu Ipo Ibamu ṣiṣẹ ni Internet Explorer).Lakoko, lati rii daju pe atilẹyin tẹsiwaju, a yoo ṣe aaye naa laisi awọn aza ati JavaScript.
iwulo wa fun eto in vitro ti o gbẹkẹle ti o le ṣe ẹda ni deede agbegbe ti ẹkọ-ẹkọ ti ọkan fun idanwo oogun.Wiwa ti o lopin ti awọn eto aṣa ti ara eniyan ti yori si awọn itumọ aiṣedeede ti awọn ipa oogun ọkan ọkan.Nibi, a ti ni idagbasoke awoṣe aṣa ti ara ọkan ọkan (CTCM) ti itanna eletiriki n ṣe awọn ege ọkan ati ki o gba isan ti ẹkọ-ara lakoko systolic ati awọn ipele diastolic ti ọmọ inu ọkan.Lẹhin awọn ọjọ 12 ti aṣa, ọna yii ni ilọsiwaju diẹ si ṣiṣeeṣe ti awọn apakan ọkan, ṣugbọn ko tọju iduroṣinṣin igbekalẹ wọn ni kikun.Nitorinaa, lẹhin ibojuwo moleku kekere, a rii pe afikun ti 100 nM triiodothyronine (T3) ati 1 μM dexamethasone (Dex) si alabọde wa ṣetọju microstructure ti awọn apakan fun awọn ọjọ 12.Ni apapo pẹlu itọju T3/Dex, eto CTCM ṣe itọju awọn profaili transcriptional, ṣiṣeeṣe, iṣẹ ṣiṣe ti iṣelọpọ, ati iduroṣinṣin igbekalẹ ni ipele kanna bi àsopọ ọkan tuntun fun awọn ọjọ 12.Ni afikun, isanraju pupọ ti iṣan inu ọkan ninu aṣa nfa ifihan agbara ọkan ọkan hypertrophic, pese ẹri fun agbara ti CTCM lati farawe awọn ipo hypertrophic ti o fa nipasẹ isan ọkan ọkan.Ni ipari, CTCM le ṣe apẹẹrẹ fisioloji ati pathophysiology ti ọkan ninu aṣa lori awọn akoko pipẹ, ti o mu ki ibojuwo oogun ti o gbẹkẹle.
Ṣaaju iwadii ile-iwosan, awọn eto in vitro ti o gbẹkẹle ni a nilo ti o le ṣe atunṣe ni deede agbegbe ti ẹkọ-ara ti ọkan eniyan.Iru awọn ọna ṣiṣe yẹ ki o farawe isunmọ ẹrọ ti a yipada, oṣuwọn ọkan, ati awọn ohun-ini elekitirojioloji.Awọn awoṣe ẹranko ni a lo nigbagbogbo gẹgẹbi ipilẹ iboju fun ẹkọ ẹkọ ọkan ọkan pẹlu igbẹkẹle to lopin ni afihan awọn ipa ti awọn oogun ninu ọkan eniyan1,2.Nikẹhin, Awoṣe Idanwo Aṣa Tissue Cardiac Tissue (CTCM) jẹ awoṣe ti o ni itara pupọ ati ni pato fun ọpọlọpọ awọn itọju ailera ati awọn ilowosi oogun, ti o ṣe atunṣe ni deede fisioloji ati pathophysiology ti ọkan eniyan3.Aisi iru eto bẹ ṣe opin wiwa awọn itọju titun fun ikuna ọkan4,5 ati pe o ti yori si cardiotoxicity oogun gẹgẹbi idi pataki fun ijade ọja naa6.
Ni ọdun mẹwa sẹhin, awọn oogun mẹjọ ti kii ṣe ẹjẹ inu ọkan ti yọkuro lati lilo ile-iwosan nitori wọn fa gigun aarin QT ti o yori si arrhythmias ventricular ati iku ojiji7.Nitorinaa, iwulo ti n pọ si fun awọn ilana ibojuwo iṣaju iṣaju igbẹkẹle lati ṣe ayẹwo ipa inu ọkan ati majele.Lilo aipẹ ti eniyan-induced pluripotent stem cell-ti ari cardiomyocytes (hiPS-CM) ni iṣayẹwo oogun ati idanwo majele n pese ojuutu apa kan si iṣoro yii.Bibẹẹkọ, iseda ti ko dagba ti awọn hiPS-CMs ati aisi idiju multicellular ti àsopọ ọkan ọkan jẹ awọn idiwọn pataki ti ọna yii.Awọn ijinlẹ aipẹ ti fihan pe aropin yii le bori ni apakan nipasẹ lilo hiPS-CM ni kutukutu lati ṣe agbekalẹ awọn hydrogels ti ara ọkan ni kete lẹhin ibẹrẹ ti awọn ihamọ lairotẹlẹ ati ni diėdiẹ jijẹ itanna eletiriki lori akoko.Bibẹẹkọ, awọn microtissues hiPS-CM wọnyi ko ni elekitirofisioloji ti o dagba ati awọn ohun-ini adehun ti myocardium agba.Ni afikun, àsopọ ọkan ọkan eniyan ni eto ti o ni idiju diẹ sii, ti o ni idapọ oriṣiriṣi oriṣiriṣi ti awọn oriṣi sẹẹli, pẹlu awọn sẹẹli endothelial, awọn neurons, ati awọn fibroblasts stromal, ti o ni asopọ nipasẹ awọn eto kan pato ti awọn ọlọjẹ matrix extracellular.Ibaṣepọ yii ti awọn eniyan ti kii-cardiomyocyte11,12,13 ninu ọkan ti ogbo mammalian agbalagba jẹ idena nla lati ṣe awoṣe ti ara inu ọkan nipa lilo awọn iru sẹẹli kọọkan.Awọn idiwọn pataki wọnyi tẹnumọ pataki ti awọn ọna idagbasoke fun dida awọn àsopọ myocardial ti ko tọ labẹ ẹkọ nipa ẹkọ iṣe-ara ati awọn ipo aisan.
Awọn apakan tinrin (300 µm) ti ọkan eniyan ti fihan lati jẹ awoṣe ti o ni ileri ti myocardium eniyan ti ko tọ.Ọna yii n pese iraye si eto multicellular 3D pipe ti o jọra si àsopọ ọkan eniyan.Bibẹẹkọ, titi di ọdun 2019, lilo awọn apakan ọkan ti aṣa ni opin nipasẹ iwalaaye aṣa kukuru (wakti 24).Eyi jẹ nitori awọn nọmba kan ti awọn okunfa pẹlu aini isan-ẹrọ ti ara-ara, wiwo omi-afẹfẹ, ati lilo awọn media ti o rọrun ti ko ṣe atilẹyin awọn iwulo ti àsopọ ọkan ọkan.Ni ọdun 2019, ọpọlọpọ awọn ẹgbẹ iwadii ṣe afihan pe iṣakojọpọ awọn ifosiwewe ẹrọ sinu awọn eto aṣa ti ara ọkan le fa igbesi aye aṣa pọ si, mu ikosile ọkan ọkan dara si, ati mimic pathology heart.Awọn ijinlẹ meji ti o yangan 17 ati 18 fihan pe ikojọpọ ẹrọ uniaxial ni ipa rere lori phenotype ọkan ọkan lakoko aṣa.Bibẹẹkọ, awọn ijinlẹ wọnyi ko lo ikojọpọ physico-mechanical onisẹpo mẹta ti o ni agbara ti ọmọ inu ọkan, nitori awọn apakan ọkan ti kojọpọ pẹlu boya awọn ipa tensile isometric 17 tabi ikojọpọ auxotonic laini 18.Awọn ọna wọnyi ti nina isan ara yorisi ni idinku ti ọpọlọpọ awọn Jiini ọkan ọkan tabi iloju pupọ ti awọn Jiini ti o ni nkan ṣe pẹlu awọn idahun isan isan ajeji.Ni pataki, Pitoulis et al.19 ni idagbasoke iwẹ aṣa bibẹ ọkan ti o ni agbara fun atunkọ ọmọ inu ọkan nipa lilo awọn esi transducer agbara ati awọn awakọ ẹdọfu.Botilẹjẹpe eto yii ngbanilaaye fun deede deede diẹ sii ni awoṣe iwọn ọkan ọkan ọkan, idiju ati iwọn kekere ti ọna ṣe opin ohun elo ti eto yii.Ile-iyẹwu wa laipẹ ṣe idagbasoke eto aṣa irọrun kan nipa lilo imudara itanna ati alabọde iṣapeye lati ṣetọju ṣiṣeeṣe ti awọn apakan ti porcine ati àsopọ ọkan eniyan fun awọn ọjọ 620,21.
Ninu iwe afọwọkọ ti o wa lọwọlọwọ, a ṣapejuwe awoṣe aṣa ti ara ọkan ọkan (CTCM) ni lilo awọn apakan ti ọkan inu ọkan ti o ni ẹiyẹ ti o ṣafikun awọn ifẹnukonu apanilẹrin lati tun ṣe atunṣe ẹkọ-ẹkọ ọkan ọkan onisẹpo mẹta ati ipalọlọ pathophysiological lakoko iyipo ọkan ọkan.CTCM yii le mu deede ti asọtẹlẹ oogun iṣoogun ti iṣaaju si ipele ti ko ni aṣeyọri, eto ogun ti o munadoko ti ọkan ninu ọran mammalian fun idanwo ajesara ti iṣaju.
Awọn ifihan agbara ẹrọ hemodynamic ṣe ipa pataki ni mimu iṣẹ cardiomyocyte ninu vitro 22,23,24.Ninu iwe afọwọkọ ti o wa lọwọlọwọ, a ti ṣe agbekalẹ CTCM kan (Ọpọlọpọ 1a) ti o le ṣe afiwe agbegbe ti ọkan inu ọkan ti agbalagba nipa jijẹ itanna mejeeji ati imudara ẹrọ ni awọn igbohunsafẹfẹ ẹkọ iṣe-ara (1.2 Hz, 72 lu fun iṣẹju kan).Lati yago fun isan iṣan ti o pọ ju lakoko diastole, ẹrọ titẹ sita 3D kan ti lo lati mu iwọn tissu pọ si nipasẹ 25% (Fig. 1b).Pacing itanna ti o fa nipasẹ eto C-PACE ni akoko lati bẹrẹ 100 ms ṣaaju ki o to systole nipa lilo eto imudani data lati ṣe ẹda ni kikun eto ọkan ọkan.Eto asa tissu naa nlo olupilẹṣẹ pneumatic ti siseto (LB Engineering, Germany) lati faagun cyclically awo awọ silikoni ti o rọ lati fa imugboroosi ti awọn ege ọkan ni iyẹwu oke.Eto naa ti sopọ si laini afẹfẹ ita nipasẹ transducer titẹ, eyiti o jẹ ki o ṣee ṣe lati ṣatunṣe deede titẹ (± 1 mmHg) ati akoko (± 1 ms) (Fig. 1c).
So apakan àsopọ pọ si oruka atilẹyin 7 mm, ti o han ni buluu, inu iyẹwu aṣa ti ẹrọ naa.Iyẹwu aṣa ti ya sọtọ lati iyẹwu afẹfẹ nipasẹ awọ awo silikoni rọ tinrin.Gbe gasiketi laarin iyẹwu kọọkan lati yago fun awọn n jo.Ideri ẹrọ naa ni awọn amọna graphite ti o pese iwuri itanna.b Sikematiki oniduro ti awọn ti o tobi àsopọ ẹrọ, guide oruka ati support oruka.Awọn apakan ara (brown) ti wa ni gbe sori ẹrọ ti o tobijulo pẹlu oruka itọsọna ti a gbe sinu yara lori eti ita ti ẹrọ naa.Lilo itọsọna naa, farabalẹ gbe oruka atilẹyin ti a bo pẹlu alemora akiriliki tissu lori apakan ti àsopọ ọkan ọkan.c Aworan ti o nfihan akoko imudara itanna bi iṣẹ ti titẹ iyẹwu afẹfẹ ti iṣakoso nipasẹ ẹrọ amuṣiṣẹ pneumatic ti eto (PPD).Ẹrọ imudani data kan ni a lo lati mu imuṣiṣẹpọ imorusi itanna nipa lilo awọn sensọ titẹ.Nigbati titẹ ninu iyẹwu aṣa ba de opin ti a ṣeto, a firanṣẹ ifihan agbara pulse kan si C-PACE-EM lati ṣe okunfa itanna.d Aworan ti awọn CTCM mẹrin ti a gbe sori selifu incubator.Awọn ẹrọ mẹrin ni a ti sopọ si PPD kan nipasẹ Circuit pneumatic, ati awọn sensosi titẹ ni a fi sii sinu àtọwọdá hemostatic lati ṣe atẹle titẹ ninu Circuit pneumatic.Ẹrọ kọọkan ni awọn apakan tissu mẹfa.
Lilo olupilẹṣẹ pneumatic kan, a ni anfani lati ṣakoso awọn ohun elo CTCM 4, ọkọọkan eyiti o le mu awọn apakan tissu 6 (Fig. 1d).Ni CTCM, titẹ afẹfẹ ninu iyẹwu afẹfẹ ti yipada si titẹ amuṣiṣẹpọ ninu iyẹwu ito ati ki o fa imugboroja ti ẹkọ iṣe-ara ti bibẹ ọkan (Aworan 2a ati Fiimu Afikun 1).Iṣiro ti isan isan ni 80 mm Hg.Aworan.fihan nínàá ti awọn apakan àsopọ nipasẹ 25% (Fig. 2b).Na ni ogorun yi ti han lati badọgba lati fisioloji sarcomere ipari ti 2.2-2.3 µm fun deede okan ọkan contractility17,19,25.A ṣe ayẹwo iṣipopada tissue nipa lilo awọn eto kamẹra aṣa (Eya Afikun 1).Iwọn titobi ati iyara ti iṣipopada tissu (Fig. 2c, d) ni ibamu si isan lakoko akoko ọkan ọkan ati akoko lakoko systole ati diastole (Fig. 2b).Na ati iyara ti iṣan ọkan ọkan lakoko ihamọ ati isinmi duro nigbagbogbo fun awọn ọjọ 12 ni aṣa (Fig. 2f).Lati ṣe iṣiro ipa ti imudara itanna lori ifunmọ lakoko aṣa, a ṣe agbekalẹ ọna kan fun ṣiṣe ipinnu idibajẹ ti nṣiṣe lọwọ nipa lilo algorithm shading (Afikun 2a,b) ati pe o ni anfani lati ṣe iyatọ laarin awọn abuku pẹlu ati laisi imudara itanna.Kanna apakan ti okan (Fig. 2f).Ni agbegbe gbigbe ti gige (R6-9), foliteji lakoko imudara itanna jẹ 20% ti o ga ju ni isansa ti imudara itanna, eyiti o tọka ilowosi ti imudara itanna si iṣẹ adehun.
Awọn itọpa aṣoju ti titẹ iyẹwu afẹfẹ, titẹ iyẹwu ito, ati awọn wiwọn gbigbe tissu jẹri pe titẹ iyẹwu yipada titẹ iyẹwu ito, nfa gbigbe ti o baamu ti bibẹ àsopọ.b Awọn itọpa Aṣoju ti isan ogorun (buluu) ti awọn apakan tissu ti o baamu si isan ogorun (osan).c Iwọn wiwọn ti bibẹ ọkan ọkan wa ni ibamu pẹlu iwọn iyara išipopada.De Quantification of cycle time (n = 19 ege fun ẹgbẹ kan, lati oriṣiriṣi elede), akoko ihamọ (n = 19 ege fun ẹgbẹ), akoko isinmi (n = 19 ege fun ẹgbẹ kan, lati oriṣiriṣi elede), gbigbe ara (n = 25).awọn ege) / ẹgbẹ lati oriṣiriṣi elede), iyara systolic ti o ga julọ (n = 24 (D0), 25 (D12) awọn ege / ẹgbẹ lati oriṣiriṣi elede) ati iye isinmi ti o ga julọ (n = 24 (D0), 25 (D12) awọn ege / ẹgbẹ lati oriṣiriṣi elede).Idanwo t-T ọmọ ile-iwe ti o ni iru meji fihan ko si iyatọ pataki ni eyikeyi paramita.f Awọn itọpa iṣiro igara Aṣoju ti awọn apakan tissu pẹlu (pupa) ati laisi (buluu) imudara itanna, awọn agbegbe agbegbe mẹwa ti awọn apakan tissu lati apakan kanna.Awọn panẹli isalẹ ṣe afihan iwọn ti iyatọ ipin ninu igara ni awọn apakan tissu pẹlu ati laisi imudara itanna ni awọn agbegbe mẹwa lati awọn apakan oriṣiriṣi. (n = 8 ege/ẹgbẹ lati oriṣiriṣi elede, T-igbeyewo Ọmọ-iwe-meji ni a ṣe; ****p <0.0001, ** p <0.01, *p <0.05). (n = 8 ege/ẹgbẹ lati oriṣiriṣi elede, T-igbeyewo Ọmọ-iwe-meji ni a ṣe; ****p <0.0001, ** p <0.01, *p <0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01). (n = 8 abala/ẹgbẹ lati oriṣiriṣi elede, t-igbeyewo ọmọ-iwe-meji; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). （n = 8 （n = 8 (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; **** p <0,0001, ** p <0,01, *p <0,05). (n = 8 abala/ẹgbẹ, lati oriṣiriṣi elede, t-idanwo ọmọ ile-iwe oni-meji; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).Awọn ọpa aṣiṣe jẹ aṣoju iyatọ ± boṣewa.
Ninu eto aṣa biomimetic ọkan aimi tẹlẹ wa [20, 21], a ṣetọju ṣiṣeeṣe, iṣẹ, ati iduroṣinṣin igbekalẹ ti awọn ege ọkan fun awọn ọjọ 6 nipa lilo imudara itanna ati imudara akojọpọ alabọde.Sibẹsibẹ, lẹhin awọn ọjọ 10, awọn isiro wọnyi lọ silẹ ni didasilẹ.A yoo tọka si awọn apakan ti o gbin ni eto aṣa aṣa biomimetic aimi tẹlẹ wa 20, awọn ipo iṣakoso 21 (Ctrl) ati pe a yoo lo alabọde iṣapeye wa tẹlẹ bi awọn ipo MC ati aṣa labẹ ẹrọ ati imudara itanna nigbakanna (CTCM).ti a npe ni .Ni akọkọ, a pinnu pe imudara ẹrọ laisi itanna eletiriki ko to lati ṣetọju ṣiṣeeṣe iṣan fun awọn ọjọ 6 (Afikun 3a,b).O yanilenu, pẹlu ifihan ti physio-mechanical ati itanna imoriya nipa lilo STCM, ṣiṣeeṣe ti 12-ọjọ okan ruju wa kanna bi ni alabapade ọkàn ruju labẹ MS ipo, sugbon ko labẹ Ctrl ipo, bi han nipa MTT onínọmbà (Fig. 1).3a).Eyi ni imọran pe imudara ẹrọ ati kikopa ti iwọn ọkan ọkan le jẹ ki awọn apakan tissu le ṣee ṣe fun igba meji niwọn igba ti a royin ninu eto aṣa aimi iṣaaju wa.Sibẹsibẹ, igbelewọn ti iduroṣinṣin igbekalẹ ti awọn apakan tissu nipasẹ imunolabeling ti troponin T ọkan ati connexin 43 fihan pe ikosile connexin 43 jẹ pataki ti o ga julọ ni awọn tissu MC ni ọjọ 12 ju awọn iṣakoso lọ ni ọjọ kanna.Sibẹsibẹ, ikosile connexin 43 aṣọ ati iṣeto Z-disiki ko ni itọju ni kikun (Fig. 3b).A lo ilana itetisi atọwọda (AI) lati ṣe iwọn iduroṣinṣin igbekalẹ tissu26, opo gigun ti ẹkọ ti o da lori aworan ti o da lori troponin-T ati abawọn connexin43 lati ṣe iwọn iduroṣinṣin igbekalẹ ati fifẹ ti awọn ege ọkan ni awọn ofin ti agbara agbegbe.Ọna yii nlo Nẹtiwọọki Neural Convolutional (CNN) ati ilana eto ẹkọ ti o jinlẹ lati ṣe iwọn igbẹkẹle igbekalẹ ti àsopọ ọkan ọkan ni adaṣe ati aiṣedeede, bi a ti ṣalaye ninu itọkasi.26. Asopọ MC ṣe afihan ibajọra igbekalẹ ilọsiwaju si ọjọ 0 ni akawe si awọn apakan iṣakoso aimi.Ni afikun, Masson's trichrome idoti ṣe afihan ipin kekere ti fibrosis labẹ awọn ipo MS ni akawe si awọn ipo iṣakoso ni ọjọ 12 ti aṣa (Fig. 3c).Lakoko ti CTCM pọ si ṣiṣeeṣe ti awọn apakan ti ara ọkan ni ọjọ 12 si ipele ti o jọra ti ti ara ọkan titun, ko ṣe ilọsiwaju ni pataki iduroṣinṣin igbekalẹ ti awọn apakan ọkan.
Aworan igi kan fihan iyeiwọn ti ṣiṣeeṣe MTT ti awọn ege ọkàn tuntun (D0) tabi aṣa awọn ege ọkan fun awọn ọjọ 12 boya ni aṣa aimi (D12 Ctrl) tabi ni CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) awọn ege / 001 pigs ti o yatọ, ti a ṣe ni ọna ti o yatọ si pigs 0 # 0. si D0 ati ** p <0.01 ni akawe si D12 Ctrl). Aworan igi kan fihan iyeiwọn ti ṣiṣeeṣe MTT ti awọn ege ọkan titun (D0) tabi aṣa awọn ege ọkan fun awọn ọjọ 12 boya ni aṣa aimi (D12 Ctrl) tabi ni CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) awọn ege pigs 0 # 0 kan, ti a ṣe ni ọna kan ti o yatọ si 1 # VA # 0. akawe si D0 ati ** p <0.01 akawe si D12 Ctrl).awọn histogram fihan awọn quantification ti awọn ṣiṣeeṣe ti MTT alabapade ọkàn ruju (D0) tabi asa ti okan ruju fun 12 ọjọ ni boya aimi asa (D12 Iṣakoso) tabi CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Iṣakoso) ) ), 12 (D12 MC) apakan / a VA igbeyewo ti o yatọ si- pigs.####p <0,0001 pо сравнению с D0 и **p <0,01 pо сравнению с D12 Ctrl). ####p <0.0001 ni akawe si D0 ati **p <0.01 ni akawe si D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心心切片(D0)天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 ，12相比，**p <0.01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片 (D12 Ctrl) MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p <0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p.)histogram ti n ṣe afihan iwọn ti ṣiṣeeṣe MTT ni awọn apakan ọkan ọkan (D0) tabi awọn apakan ọkan ti o gbin fun awọn ọjọ 12 ni aṣa aimi (Iṣakoso D12) tabi CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Iṣakoso)))####p <0,0001 pо сравнению с D0, **p <0,01 pо сравнению с D12 Ctrl). ####p <0.0001 ni akawe si D0, **p <0.01 ni akawe si D12 Ctrl).b Troponin-T (alawọ ewe), connexin 43 (pupa) ati DAPI (bulu) ni awọn apakan ọkan ti o ya sọtọ (D0) tabi awọn apakan ọkan ti o gbin labẹ awọn ipo aimi (Ctrl) tabi awọn ipo CTCM (MC) fun awọn ọjọ 12) ti awọn aworan imunofluorescence aṣoju (iwọn òfo = 100 µm). Isọdi oye atọwọdọwọ ti iduroṣinṣin igbekalẹ ti iṣan ọkan (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) awọn ege / ẹgbẹ kọọkan lati oriṣiriṣi ẹlẹdẹ, idanwo ANOVA ọna kan ni a ṣe; ####p <0.0001 ni akawe si D0 ati D****p <0.0101 C Iwọn itetisi atọwọdọwọ ti iduroṣinṣin igbekalẹ iṣan ọkan (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) awọn ege / ẹgbẹ kọọkan lati oriṣiriṣi elede, idanwo ANOVA ọna kan ni a ṣe; ####p <0.0001 ni akawe si D0 ati D****p <0.0101 C Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D15) п от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p <0,0001 p Isọdi ti iduroṣinṣin igbekalẹ ti ara inu ọkan nipasẹ itetisi atọwọda (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) awọn apakan / awọn ẹgbẹ lati oriṣiriṣi elede, idanwo ANOVA ọna kan ti a ṣe; ####p <0.0001 vs. pẹlu D0 ati **** p <1 ni akawe si D0.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) awọn ege / ẹgbẹ kọọkan ti o yatọ si ẹlẹdẹ, ọkan-ọna ANOVA igbeyewo;#0#0p0 <0.0001 与D12 Ctrl 相比）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) awọn ege / ẹgbẹ kọọkan ti awọn ẹlẹdẹ oriṣiriṣi, ọkan-ọna ANOVA igbeyewo;#0#0p 0.0001 与D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D0), 7 (D0) руппу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0. Oríkĕ itetisi lati ṣe iṣiro iyege igbekale ti ara inu ọkan (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) awọn apakan / ẹgbẹ kọọkan ti awọn ẹlẹdẹ oriṣiriṣi, idanwo ANOVA ọkan-ọna; ####p <0.0001 vs .D0 Fun lafiwe ****p <0t 0.00 C. c Awọn aworan aṣoju (osi) ati iwọn (ọtun) fun awọn ege ọkan ti o ni abawọn pẹlu abawọn trichrome Masson's (Scale bare = 500 µm) (n = 10 ege/ẹgbẹ kọọkan lati oriṣiriṣi ẹlẹdẹ, idanwo ANOVA kan-ọna kan ni a ṣe; ####p <0.0001) ni akawe si D0 ati 02p ***t C. c Awọn aworan aṣoju (osi) ati iwọn (ọtun) fun awọn ege ọkan ti o ni abawọn pẹlu abawọn trichrome Masson's (Scale bare = 500 µm) (n = 10 ege / ẹgbẹ kọọkan lati oriṣiriṣi elede, idanwo ANOVA kan-ọna kan ni a ṣe; #### p <0.0001) ni akawe si D0 ati 02p ***t C. c Репрезентативные изображения (слева) сштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторытия; с D0 и ***p <0,001 pо сравнению с D12 Ctrl). c Awọn aworan aṣoju (osi) ati iwọn (ọtun) ti awọn apakan ọkan ti o ni abawọn pẹlu abawọn trichrome Masson (iwọn ti a ko fi silẹ = 500 µm) (n = 10 awọn apakan / ẹgbẹ lati oriṣiriṣi elede, idanwo ANOVA kan-ọna kan ti a ṣe; #### p <0 .0001) ti a fiwe si D0 ati *** 2 C ni akawe si D0 ati *** 2 <0. c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度（（右）（裸尺度（（裸尺度） 5m片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p <0.0001 与D0 相比，***p <0.001 丯 C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 Anova 测试；#0. ***p <0.001 与D12 Ctrl 相比） c Репрезентативные изображения (слева) стая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа. анализа ;### #p <0,0001 по сравнению с D0, ***p <0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Awọn aworan aṣoju (osi) ati titobi (ọtun) ti awọn apakan ọkan ti o ni abawọn pẹlu abawọn trichrome Masson's (òfo = 500 µm) (n = 10 awọn apakan / ẹgbẹ, kọọkan lati ọdọ ẹlẹdẹ ti o yatọ, ti a ṣe ayẹwo nipasẹ ọna-ọna kan ti iyatọ; ### # p <0.0001 ni akawe si D0.0.1 p <0001).Awọn ọpa aṣiṣe jẹ aṣoju iyatọ ± boṣewa.
A pinnu pe nipa fifi awọn ohun elo kekere kun si alabọde aṣa, iduroṣinṣin cardiomyocyte le ni ilọsiwaju ati idagbasoke fibrosis dinku lakoko aṣa CTCM.Nitorinaa a ṣe ayẹwo fun awọn ohun elo kekere ni lilo awọn aṣa iṣakoso aimi20,21 nitori nọmba kekere ti awọn ifosiwewe idamu.Dexamethasone (Dex), triiodothyronine (T3), ati SB431542 (SB) ni a yan fun iboju yii.Awọn moleku kekere wọnyi ti lo ni iṣaaju ni awọn aṣa hiPSC-CM lati fa idagbasoke ti awọn cardiomyocytes nipasẹ jijẹ gigun sarcomere, T-tubules, ati iyara gbigbe.Ni afikun, mejeeji Dex (glucocorticoid) ati SB ni a mọ lati dinku igbona29,30.Nitorinaa, a ṣe idanwo boya ifisi ọkan tabi apapọ awọn ohun elo kekere wọnyi yoo mu iduroṣinṣin igbekalẹ ti awọn apakan ọkan dara si.Fun iṣayẹwo akọkọ, iwọn lilo agbo-ara kọọkan ni a yan da lori awọn ifọkansi ti o wọpọ ni awọn awoṣe aṣa sẹẹli (1 μM Dex27, 100 nM T327, ati 2.5 μM SB31).Lẹhin awọn ọjọ 12 ti aṣa, apapọ ti T3 ati Dex yorisi iduroṣinṣin igbekalẹ cardiomyocyte ti o dara julọ ati atunṣe fibrous ti o kere ju (Awọn eeya afikun 4 ati 5).Ni afikun, lilo ilọpo tabi ilọpo meji awọn ifọkansi wọnyi ti T3 ati Dex ṣe awọn ipa imukuro ni akawe si awọn ifọkansi deede (Eya afikun. 6a,b).
Lẹhin iṣayẹwo akọkọ, a ṣe afiwe ori-si-ori ti awọn ipo aṣa 4 (Nọmba 4a): Konturolu: awọn apakan ọkan ti o gbin ni aṣa aimi ti a ṣalaye tẹlẹ nipa lilo alabọde iṣapeye wa;20.21 TD: T3 ati Konturolu s Fikun Dex on Wednesday;MC: awọn apakan ọkan ti o gbin ni CTCM nipa lilo alabọde iṣapeye wa tẹlẹ;ati MT: CTCM pẹlu T3 ati Dex kun si awọn alabọde.Lẹhin awọn ọjọ 12 ti ogbin, ṣiṣeeṣe ti MS ati MT tissues wa kanna gẹgẹbi ninu awọn awọ tuntun ti a ṣe ayẹwo nipasẹ MTT assay (Fig. 4b).O yanilenu, afikun ti T3 ati Dex si awọn aṣa transwell (TD) ko mu ilọsiwaju pataki ni ṣiṣeeṣe ni akawe si awọn ipo Ctrl, nfihan ipa pataki ti imudara ẹrọ ni mimu ṣiṣeeṣe ti awọn apakan ọkan.
Aworan apẹrẹ idanwo ti n ṣe afihan awọn ipo aṣa mẹrin ti a lo lati ṣe iṣiro awọn ipa ti imudara ẹrọ ati afikun T3/Dex lori alabọde fun awọn ọjọ 12. b Bar aworan atọka fihan quantification ti ṣiṣeeṣe 12 ọjọ post asa ni gbogbo 4 asa awọn ipo (Ctrl, TD, MC, ati MT) akawe si alabapade ọkàn ege (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ati D12 MT), 12 (D12 MC) pigs 12 (D12 #MC) pigs / ẹgbẹ kan ti o yatọ si pigs. 01, ###p <0.001 ni akawe si D0 ati **p <0.01 ni akawe si D12 Ctrl). b Bar aworan atọka fihan quantification ti ṣiṣeeṣe 12 ọjọ post asa ni gbogbo 4 asa awọn ipo (Ctrl, TD, MC, ati MT) akawe si alabapade ọkàn ege (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ati D12 MT), 12 (D12 MC) pigs 12 (D12 #MC) pigs / ẹgbẹ kan ti o yatọ si pigs. 01, ###p <0.001 ni akawe si D0 ati **p <0.01 ni akawe si D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественую оценку жизнеспособности черес ирования (контроль, TD, MC и MT) fun сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD) уппу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0, сравнению с D0 и **1 D00 ). b Awọn aworan igi fihan iyeye ṣiṣeeṣe ni awọn ọjọ 12 lẹhin aṣa ni gbogbo awọn ipo aṣa 4 (Iṣakoso, TD, MC, ati MT) ni akawe si awọn apakan okan titun (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, ati D12 MT), 12 (D12 MC) pipọ 12 (D12 # 0) orisirisi awọn piksẹli 0. 01, ###p <0.001 vs. D0 ati **p <0.01 nipa akawe si D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D0) 12 MT), 来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA控制).b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению сим 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест # ANOVA; ####0P <0, ю с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Histogram ti o nfihan gbogbo awọn ipo aṣa 4 (Iṣakoso, TD, MC ati MT) ni akawe si awọn apakan okan titun (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ati D12 MT), lati oriṣiriṣi awọn ẹlẹdẹ 12 (D12 MC) awọn apakan / ẹgbẹ, ọkan-ọna ANOVA igbeyewo, ##0#0. p <0.01 vs. Iṣakoso D12). c Bar aworan atọka fihan awọn pipo ti glukosi flux 12 ọjọ post asa ni gbogbo 4 asa awọn ipo (Ctrl, TD, MC, ati MT) akawe si alabapade ọkàn ege (D0) (n = 6 ege / ẹgbẹ lati orisirisi elede, ọkan-ọna ANOVA igbeyewo; ###p <0.001, akawe si D0 ati ***2p <0.1). c Bar aworan atọka fihan awọn pipo ti glukosi flux 12 ọjọ post asa ni gbogbo 4 asa awọn ipo (Ctrl, TD, MC, ati MT) akawe si alabapade ọkàn ege (D0) (n = 6 ege / ẹgbẹ lati orisirisi elede, ọkan-ọna ANOVA igbeyewo; ###p <0.001, akawe si D0 ati ***2p <0.1). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12. ирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со сравнению няется тест ANOVA; ###p <0,001 по сравнению с D0 и ***p <0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Histogram ṣe afihan titobi ti ṣiṣan glukosi ni awọn ọjọ 12 lẹhin aṣa labẹ gbogbo awọn ipo aṣa 4 (iṣakoso, TD, MC ati MT) ni akawe si awọn apakan ọkan titun (D0) (n = 6 awọn apakan / ẹgbẹ lati oriṣiriṣi elede, idanwo ANOVA kan-ọna kan ti a ṣe; ###p <0.001 ni akawe si D0 ati *** p <0.021 ni akawe si D0.021). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 玡片(D0) 玡件各的1，各的1通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA . C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜后 后 12相比，***p <0.001 与D12 Ctrl 相比）. c Гистограмма, показывающая куличественную оценку льтивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со сравнению Были проведены тесты ANOVA; ###p <0,001 pо сравнению с D0, ***p <0,001 по сравнению с D12 (контроль). c Histogram ti o nfihan titobi ti ṣiṣan glukosi ni awọn ọjọ 12 lẹhin aṣa fun gbogbo awọn ipo aṣa 4 (iṣakoso, TD, MC, ati MT) ni akawe si awọn apakan ọkan titun (D0) (n = 6 awọn apakan / ẹgbẹ, lati oriṣiriṣi elede, awọn idanwo ANOVA alailẹgbẹ ni a ṣe, ###p <0.001 ni akawe si D0,1 ***1).d Awọn igbero itupalẹ igara ti alabapade (bulu), ọjọ 12 MC (alawọ ewe), ati ọjọ 12 MT (pupa) awọn tissues ni awọn aaye apakan apakan agbegbe mẹwa (n = 4 awọn ege / ẹgbẹ, idanwo ANOVA-ọna kan; ko si iyatọ nla laarin awọn ẹgbẹ).Idite onina ti n ṣe afihan awọn jiini ti o yatọ ni awọn apakan ọkan titun (D0) ni akawe si awọn apakan ọkan ti o gbin labẹ awọn ipo aimi (Ctrl) tabi labẹ awọn ipo MT (MT) fun awọn ọjọ 10-12.f Heatmap ti awọn jiini sarcomere fun awọn apakan ọkan ti o gbin labẹ awọn ipo aṣa kọọkan.Awọn ọpa aṣiṣe jẹ aṣoju iyatọ ± boṣewa.
Igbẹkẹle ti iṣelọpọ agbara lori iyipada lati ifoyina acid fatty si glycolysis jẹ ami iyasọtọ ti iyasọtọ cardiomyocyte.Awọn cardiomyocytes ti ko dagba ni akọkọ lo glucose fun iṣelọpọ ATP ati pe wọn ni mitochondria hypoplastic pẹlu cristae5,32 diẹ.Awọn itupalẹ iṣamulo glukosi fihan pe labẹ awọn ipo MC ati MT, iṣamulo glukosi jẹ iru ti o ni awọn tissu ọjọ 0 (Figure 4c).Sibẹsibẹ, awọn ayẹwo Ctrl ṣe afihan ilosoke pataki ni lilo glukosi ni akawe si àsopọ tuntun.Eyi tọkasi pe apapọ CTCM ati T3/Dex mu ṣiṣeeṣe ṣiṣeeṣe pọ si ati ṣe itọju phenotype ti iṣelọpọ ti awọn apakan ọkan ti o gbin ọjọ mejila.Ni afikun, iṣiro igara fihan pe awọn ipele igara wa kanna bi ninu awọn iṣan ọkan titun fun awọn ọjọ 12 labẹ awọn ipo MT ati MS (Fig. 4d).
Lati ṣe itupalẹ ipa gbogbogbo ti CTCM ati T3/Dex lori ala-ilẹ transcriptional agbaye ti àsopọ ege ọkan ọkan, a ṣe RNAseq lori awọn ege ọkan ọkan lati gbogbo awọn ipo aṣa oriṣiriṣi mẹrin (Data Afikun 1).O yanilenu, awọn apakan MT ṣe afihan ibajọra transcriptional giga si àsopọ ọkan titun, pẹlu 16 nikan ni iyatọ ti o ṣafihan ninu awọn Jiini 13,642.Sibẹsibẹ, bi a ti fihan ni iṣaaju, awọn ege Ctrl ṣe afihan 1229 awọn jiini ti o yatọ si lẹhin 10-12 ọjọ ni aṣa (Fig. 4e).Awọn data wọnyi ni a fi idi rẹ mulẹ nipasẹ qRT-PCR ti ọkan ati awọn jiini fibroblast (Eya afikun. 7a-c).O yanilenu, awọn apakan Ctrl ṣe afihan isọdọtun ti ọkan ati awọn jiini ọmọ sẹẹli ati imuṣiṣẹ ti awọn eto jiini iredodo.Awọn data wọnyi daba pe iyasilẹtọ, eyiti o waye deede lẹhin aṣa-igba pipẹ, ti dinku patapata labẹ awọn ipo MT (Afikun 8a, b).Iwadi iṣọra ti awọn jiini sarcomere fihan pe nikan labẹ awọn ipo MT ni awọn jiini ti n ṣe koodu sarcomere (Fig. 4f) ati ikanni ion (Afikun 9) ti a fipamọ, aabo wọn lati idinku labẹ awọn ipo Ctrl, TD, ati MC.Awọn data wọnyi ṣe afihan pe pẹlu apapọ ti iṣelọpọ ati imudara apanilẹrin (T3/Dex), transcriptome bibẹ ọkan ọkan le wa ni iru si awọn ege ọkan titun lẹhin awọn ọjọ 12 ni aṣa.
Awọn awari transcriptional wọnyi ni atilẹyin nipasẹ otitọ pe iduroṣinṣin igbekalẹ ti cardiomyocytes ninu awọn apakan ọkan ti wa ni ipamọ ti o dara julọ labẹ awọn ipo MT fun awọn ọjọ 12, bi a ti fihan nipasẹ imuduro ati agbegbe connexin 43 (Fig. 5a).Ni afikun, fibrosis ni awọn apakan ọkan labẹ awọn ipo MT ti dinku pupọ ni akawe si Ctrl ati iru si awọn apakan ọkan titun (Fig. 5b).Awọn data wọnyi ṣe afihan pe idapọ ti imudara ẹrọ ati itọju T3/Dex ni imunadoko eto ọkan ọkan ni awọn apakan ọkan ni aṣa.
Awọn aworan imunofluorescence Aṣoju ti troponin-T (alawọ ewe), connexin 43 (pupa), ati DAPI (bulu) ni awọn apakan ọkan ti o ya sọtọ (D0) tabi ti gbin fun awọn ọjọ 12 ni gbogbo awọn ipo aṣa apakan ọkan mẹrin (iwọn iwọn = 100 µm).). Oríkĕ itetisi quantification ti awọn okan àsopọmọra igbekale iyege (n = 7 (D0 ati D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ati D12 MT) ege / ẹgbẹ lati orisirisi elede, ọkan-ọna ANOVA igbeyewo ti wa ni ṣe; ####p <0.0001 <0.0001 akawe si D0 **** 0p <0. rl). Oríkĕ itetisi quantification ti awọn okan àsopọmọra igbekale iyege (n = 7 (D0 ati D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ati D12 MT) ege / ẹgbẹ lati orisirisi elede, ọkan-ọna ANOVA igbeyewo; #### p <0.0001 akawe si D0. rl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 2), 1 (DMC) и D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; #### p <0,0001 по сравнениї, 01 по сравнению с D12 Ctrl). Pipe ti o jẹ ohun iduroṣinṣin igbekale ti àsopọ ọkan (n = 7 (D12 CTRL)对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）和D12智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p <0.0001 与D0 和*p <0.05 相比，或****p <0.0001 与对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl）量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ######### p <0.0001 ) .Isọdi ti iṣedede ti iṣelọpọ ti iṣan ọkan nipa lilo itetisi atọwọda ni awọn elede oriṣiriṣi (n = 7 (D0 ati D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ati D12 MT) awọn apakan / ẹgbẹ) pẹlu idanwo ANOVA kan-ọna kan;#### p <0,0001 pо сравнению с D0 и *p <0,05 tabi ****p <0,0001 pо сравнению с D12 Ctrl). #### p <0.0001 ni akawe si D0 ati *p <0.05 tabi ****p <0.0001 ni akawe si D12 Ctrl). b Awọn aworan aṣoju ati iwọn fun awọn ege ọkan ti o ni abawọn pẹlu abawọn trichrome Masson's (Opa Iwọn = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, ati D12 MC), 9 (D12 MT) awọn ege / ẹgbẹ lati oriṣiriṣi elede, ọkan-ọna ANOVA idanwo ti wa ni ṣe pẹlu <1##0. .001, tabi ****p <0.0001 ni akawe si D12 Ctrl). b Awọn aworan aṣoju ati iwọn fun awọn ege ọkan ti o ni abawọn pẹlu abawọn trichrome Masson's (Opa Iwọn = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, ati D12 MC), 9 (D12 MT) awọn ege / ẹgbẹ lati oriṣiriṣi elede, ọkan-ọna ANOVA idanwo ti wa ni ṣe pẹlu <1##0. .001, tabi ****p <0.0001 ni akawe si D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная ка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ati D12 MC), 9 (D12 MT) 0001 по сравнению с D0 и ***p <0,001 tabi ****p <0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Aṣoju awọn aworan ati awọn pipo ọkàn ruju abariwon pẹlu Masson ká trichrome idoti (iwọn bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ati D12 MC), 9 (D12 MT) ruju / ẹgbẹ lati yatọ si elede, ošišẹ ti ọkan-ọna ANOVA & # # # 00 <1. 1 tabi ****p <0.0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）（n = 10% D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；#*##p <0.0001 与或****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比） b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p <0.0001 0.0001或****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比） b Репрезентативные изображения и количественная оценка ) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ati D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / групппы, один- способ ANOVA; ####p <1 0,001 tabi ****p <0,0001 fun сравнению с D12 Ctrl). b Awọn aworan aṣoju ati iwọn awọn apakan ọkan ti o ni abawọn pẹlu Masson's trichrome (ọpa iwọn = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ati D12 MC), 9 (D12 MT) awọn apakan lati oriṣiriṣi elede / ẹgbẹ, ọna ANOVA kan / ẹgbẹ kan, <0##0p. ****p <0.0001 ni akawe si D12 Ctrl).Awọn ọpa aṣiṣe jẹ aṣoju iyatọ ± boṣewa.
Nikẹhin, agbara CTCM lati farawe hypertrophy ọkan ọkan ni a ṣe ayẹwo nipasẹ jijẹ isan iṣan ọkan ọkan.Ni CTCM, titẹ iyẹwu afẹfẹ ti o ga julọ pọ lati 80 mmHg si 80 mmHg.Aworan.(na deede) to 140 mmHg Art.(Eya. 6a).Eleyi ni ibamu si a 32% ilosoke ninu na (aworan 6b), eyi ti a ti tẹlẹ han bi awọn ti o baamu ogorun isan beere fun okan ruju lati se aseyori kan sarcomere ipari iru si ti ri ni hypertrophy.Na ati iyara ti iṣan ọkan ọkan lakoko ihamọ ati isinmi duro nigbagbogbo lakoko awọn ọjọ mẹfa ti aṣa (Fig. 6c).Asopọ ọkan inu ọkan lati awọn ipo MT ti wa labẹ isan deede (MT (Deede)) tabi awọn ipo apọju (MT (OS)) fun ọjọ mẹfa.Tẹlẹ lẹhin awọn ọjọ mẹrin ni aṣa, hypertrophic biomarker NT-ProBNP ni a gbega pupọ ni alabọde labẹ awọn ipo MT (OS) ti a fiwe si awọn ipo MT (deede) (Fig. 7a).Ni afikun, lẹhin ọjọ mẹfa ti aṣa, iwọn sẹẹli ni MT (OS) (Fig. 7b) pọsi pupọ ni akawe si awọn apakan ti ọkan MT (deede).Ni afikun, NFATC4 iyipada iparun ti pọ si ni pataki ni awọn tissu ti o taju (Fig. 7c).Awọn abajade wọnyi ṣe afihan idagbasoke ilọsiwaju ti iṣatunṣe pathological lẹhin hyperdistension ati atilẹyin imọran pe ẹrọ CTCM le ṣee lo bi ipilẹ kan lati ṣe iwadi awọn ifihan agbara hypertrophy ọkan ti isan.
Awọn itọpa aṣoju ti titẹ iyẹwu afẹfẹ, titẹ iyẹwu ito, ati awọn wiwọn gbigbe tissu jẹri pe titẹ iyẹwu yipada titẹ iyẹwu ito, nfa gbigbe ti o baamu ti bibẹ àsopọ.b Aṣoju isan ipin ogorun ati na oṣuwọn ekoro fun deede na (osan) ati overstretched (bulu) ruju.c Aworan aworan ti o nfihan akoko iyipo (n = 19 ege fun ẹgbẹ kan, lati oriṣiriṣi elede), akoko ihamọ (n = 18-19 awọn ege fun ẹgbẹ kan, lati oriṣiriṣi elede), akoko isinmi (n = 19 ege fun ẹgbẹ kan, lati oriṣiriṣi elede)), titobi ti iṣipopada tissu (n = 14 ege / ẹgbẹ, lati oriṣiriṣi elede), 1 systolic pigs ti o yatọ si pilasita, pilasi 1 systolic / pigs grongs. oṣuwọn (n = 14 (D0), 15 (D6) ) awọn apakan / awọn ẹgbẹ) lati oriṣiriṣi elede), t-igbeyewo ọmọ ile-iwe meji-tailed ko fihan iyatọ nla ni eyikeyi paramita, ti o fihan pe awọn paramita wọnyi duro nigbagbogbo lakoko awọn ọjọ 6 ti aṣa pẹlu iwọn apọju.Awọn ọpa aṣiṣe jẹ aṣoju iyatọ ± boṣewa.
a Bar graph quantification quantification of NT-ProBNP fojusi ni asa media lati okan ege gbin labẹ MT deede isan (Norm) tabi overstretching (OS) awọn ipo (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, ati D4 MTOS) ege / Ẹgbẹ lati yatọ si elede, Meji-ọna ANOVA ti wa ni ošišẹ ti deede;). Iwọn iwọn aworan Bar ti ifọkansi NT-ProBNP ni media aṣa lati awọn ege ọkan ti a gbin labẹ isan deede MT (Norm) tabi awọn ipo apọju (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, ati D4 MTOS) awọn ege / ẹgbẹ lati oriṣiriṣi elede, ANOVA ọna meji ni a ṣe afiwe si deede;Histogram pipo ti ifọkansi NT-ProBNP ni alabọde aṣa lati awọn ege ọkan ti a gbin labẹ awọn ipo ti isan MT deede (norm) tabi overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, ati D4) . MTOS) awọn ege / ẹgbẹ lati oriṣiriṣi elede, itupalẹ ifosiwewe meji;**p <0,01 по сравнению с нормальным растяжением). ** p <0.01 ni akawe si isan deede). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) rm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm 和D4 MTOS) . Idiwọn ti ifọkansi NT-ProBNP ni awọn ege ọkan ti o gbin labẹ isan deede MT (Norm) tabi awọn ipo apọju (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) lati oriṣiriṣi ed pẹlu nina deede, p <0.01).histogram Quantification ti awọn ifọkansi NT-ProBNP ni awọn ege ọkan ti o gbin labẹ awọn ipo ti MT isan deede (norm) tabi overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) ati D4 MTOS) awọn ege / ẹgbẹ lati oriṣiriṣi elede, itupalẹ ọna meji ti iyatọ;**p <0,01 по сравнению с нормальным растяжением). ** p <0.01 ni akawe si isan deede). b Awọn aworan aṣoju fun awọn ege ọkan ti o ni abawọn pẹlu troponin-T ati WGA (osi) ati iwọn titobi sẹẹli (ọtun) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) awọn sẹẹli / ẹgbẹ lati awọn ege oriṣiriṣi 10 lati oriṣiriṣi elede, T-igbeyewo T-meji-meji ti a ṣe; 0**** p <10). b Awọn aworan aṣoju fun awọn ege ọkan ti o ni abawọn pẹlu troponin-T ati WGA (osi) ati iwọn titobi sẹẹli (ọtun) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) awọn sẹẹli / ẹgbẹ lati awọn ege oriṣiriṣi 10 lati oriṣiriṣi elede, T-idanwo T-Test T-meji ti a ṣe pẹlu deede; 0**** p <10). b Репрезентативные АЗП к (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу юдента; ****p <0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Awọn aworan aṣoju ti awọn apakan ọkan ti o ni abawọn pẹlu troponin-T ati AZP (osi) ati iwọn titobi sẹẹli (ọtun) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) awọn sẹẹli / ẹgbẹ lati 10 orisirisi awọn apakan lati oriṣiriṣi elede, meji-tailed T-idanwo Ọmọ-iwe ti a ṣe afiwe si 0.0 p. b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表切片的代表） 3）来自不同猪的10 ) . b Awọn aworan aṣoju ti awọn ege ọkan ti o ni abawọn pẹlu calcarein-T ati WGA (osi) ati iwọn sẹẹli (ọtun) (n = 330 (D6 MTOS), 369 lati awọn ege oriṣiriṣi 10 (D6 MTNorm)) Awọn sẹẹli / 组, 两方法有尾学甹法有尾学甹 法有尾学甹法有尾学生？ b Репрезентативные изображения срезов сердца. а) (n = 330 (D6 MTOS),369 (D6 MTNorm) 01 по сравнению с нормальным растяжением). b Awọn aworan aṣoju ti awọn apakan ọkan ti o ni abawọn pẹlu troponin-T ati AZP (osi) ati titobi ti iwọn sẹẹli (ọtun) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) lati awọn ẹya oriṣiriṣi 10 lati oriṣiriṣi elede) Awọn sẹẹli / ẹgbẹ, awọn ami-ami-meji ti awọn ọmọ ile-iwe t;**** p <0.0001 ni akawe si igara deede). c Awọn aworan aṣoju fun ọjọ 0 ati ọjọ 6 MTOS awọn ege ọkan ti ajẹsara ti ajẹsara fun troponin-T ati NFATC4 ati titobi ti iyipada ti NFATC4 si awọn ekuro ti CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) awọn ege / ẹgbẹ lati oriṣiriṣi elede, Awọn ọmọ ile-iwe meji ti a ṣe ni t-5. c Awọn aworan aṣoju fun ọjọ 0 ati ọjọ 6 MTOS awọn ege ọkan ti ajẹsara ti ajẹsara fun troponin-T ati NFATC4 ati titobi ti iyipada ti NFATC4 si awọn ekuro ti CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) awọn ege / ẹgbẹ lati oriṣiriṣi elede, meji-tailed Stu is0. - 5. c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней тьюдента; * p <0,05). c Awọn aworan aṣoju fun awọn apakan ọkan ni 0 ati 6 ọjọ MTOS, ti ajẹsara fun troponin-T ati NFATC4, ati titobi ti NFATC4 translocation ni arin ti awọn sẹẹli cavernous (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) awọn ege / ẹgbẹ lati oriṣiriṣi elede) ṣe awọn t-tailed meji-tailed Stutest;p <0.05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS 心脏切片易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p 0.0. c Awọn aworan aṣoju ti calcanin-T ati NFATC4 immunolabeling 第0天和第6天MTOS awọn ege ọkan ọkan, ati NFATC4 lati oriṣiriṣi NFATC4.学生et 电影；*p <0.05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для ранслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий t-критеридю 0, 5 <0. c Awọn aworan aṣoju ti awọn ege ọkan MTOS ni ọjọ 0 ati 6 fun troponin-T ati NFATC4 imunolabeling ati titobi ti NFATC4 translocation ni arin ti CM lati awọn elede ti o yatọ (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) awọn ege / ẹgbẹ, meji-tailed t -criterion; 5 <pdent).Awọn ifi aṣiṣe duro tumọ ± iyatọ boṣewa.
Iwadi inu ọkan ati ẹjẹ ti o tumọ nilo awọn awoṣe cellular ti o ṣe atunṣe ni deede ayika ọkan ọkan.Ninu iwadi yii, ẹrọ CTCM kan ti ni idagbasoke ati ti a ṣe afihan ti o le mu awọn abala ultrathin ti ọkan ṣiṣẹ.Eto CTCM pẹlu imuṣiṣẹpọ nipa ti ara ati imuṣiṣẹpọ itanna eletiriki ati T3 ati imudara omi Dex.Nigbati awọn apakan ọkan ẹlẹdẹ ti farahan si awọn nkan wọnyi, ṣiṣeeṣe wọn, iduroṣinṣin igbekalẹ, iṣẹ ṣiṣe ti iṣelọpọ, ati ikosile transcription jẹ kanna bii ninu àsopọ ọkan tuntun lẹhin awọn ọjọ 12 ti aṣa.Ni afikun, isanraju pupọ ti àsopọ ọkan ọkan le fa hypertrophy ti ọkan ti o fa nipasẹ hyperextension.Lapapọ, awọn abajade wọnyi ṣe atilẹyin ipa to ṣe pataki ti awọn ipo aṣa ti ẹkọ ẹkọ ẹkọ ẹkọ ẹkọ ẹkọ ẹkọ iṣe-ara ni mimu itọju phenotype ọkan ọkan deede ati pese aaye kan fun ibojuwo oogun.
Ọpọlọpọ awọn okunfa ṣe alabapin si ṣiṣẹda agbegbe ti o dara julọ fun iṣẹ ṣiṣe ati iwalaaye ti cardiomyocytes.Ohun ti o han julọ julọ ninu awọn nkan wọnyi ni ibatan si (1) awọn ibaraenisepo intercellular, (2) imudara eleto mekaniki, (3) awọn ifosiwewe humoral, ati (4) awọn sobusitireti ti iṣelọpọ.Awọn ibaraenisepo sẹẹli-si-ẹyin ti ara nilo awọn nẹtiwọọki onisẹpo mẹta ti ọpọlọpọ awọn iru sẹẹli ti o ni atilẹyin nipasẹ matrix extracellular kan.Iru awọn ibaraenisepo cellular ti o nipọn ni o nira lati tun ṣe in vitro nipasẹ aṣa-aṣa ti awọn oriṣi sẹẹli kọọkan, ṣugbọn o le ni irọrun ṣaṣeyọri nipa lilo ẹda organotypic ti awọn apakan ọkan.
Gigun ẹrọ ati imudara itanna ti cardiomyocytes jẹ pataki fun mimu phenotype ọkan ọkan phenotype33,34,35.Lakoko ti imudara ẹrọ ti jẹ lilo pupọ fun hiPSC-CM kondisona ati maturation, ọpọlọpọ awọn ijinlẹ didara ti gbiyanju igbiyanju ẹrọ laipẹ ti awọn ege ọkan ninu aṣa nipa lilo ikojọpọ uniaxial.Awọn ijinlẹ wọnyi fihan pe ikojọpọ ẹrọ uniaxial 2D ni ipa rere lori phenotype ti ọkan lakoko aṣa.Ninu awọn ẹkọ wọnyi, awọn apakan ti ọkan ni a ti kojọpọ pẹlu awọn ipa fifẹ isometric17, iṣakojọpọ auxotonic laini18, tabi yiyi ọkan ọkan ti tun ṣe nipa lilo esi transducer agbara ati awọn awakọ ẹdọfu.Bibẹẹkọ, awọn ọna wọnyi lo isan isan ti ara uniaxial laisi iṣapeye ayika, ti o yọrisi idinku ti ọpọlọpọ awọn jiini ọkan tabi ilọju pupọ ti awọn Jiini ti o ni nkan ṣe pẹlu awọn idahun isan isan ajeji.CTCM ti a ṣapejuwe nibi n pese itunsi elekitironika 3D kan ti o ṣafarawe yiyipo ọkan ọkan ti ara ni awọn ofin ti akoko yipo ati isan ti ẹkọ iṣe-ara (na 25%, 40% systole, 60% diastole, ati 72 lu fun iṣẹju kan).Botilẹjẹpe imudara ẹrọ onisẹpo mẹta yii nikan ko to lati ṣetọju iṣotitọ àsopọ, apapo ti humoral ati imudara ẹrọ nipa lilo T3 / Dex ni a nilo lati ṣetọju ṣiṣeeṣe ti ara, iṣẹ, ati iduroṣinṣin deede.
Awọn ifosiwewe apanilẹrin ṣe ipa pataki ni iyipada phenotype ti ọkan agbalagba.Eyi ni afihan ni awọn ẹkọ HiPS-CM ninu eyiti a ṣafikun T3 ati Dex si media aṣa lati mu ilọsiwaju sẹẹli pọ si.T3 le ni ipa lori gbigbe awọn amino acids, awọn suga ati kalisiomu kọja awọn membran sẹẹli36.Ni afikun, T3 nse igbelaruge MHC-α ikosile ati MHC-β downregulation, igbega awọn Ibiyi ti sare twitch myofibrils ni ogbo cardiomyocytes akawe si fa fifalẹ twitch myofibrils ni oyun CM.Aipe T3 ninu awọn alaisan hypothyroid ni abajade isonu ti awọn ẹgbẹ myofibrillar ati idinku ti idagbasoke ohun orin37.Dex n ṣiṣẹ lori awọn olugba glucocorticoid ati pe o ti han lati mu ifunmọ myocardial pọ si ni awọn ọkan perfused ti o ya sọtọ;38 ilọsiwaju yii ni a ro pe o ni ibatan si ipa lori titẹsi-iwakọ idogo kalisiomu (SOCE) 39,40.Ni afikun, Dex sopọ mọ awọn olugba rẹ, nfa idahun intracellular gbooro ti o dinku iṣẹ ajẹsara ati igbona30.
Awọn abajade wa tọka pe imudara ẹrọ ti ara (MS) ṣe ilọsiwaju iṣẹ aṣa gbogbogbo ni akawe si Ctrl, ṣugbọn kuna lati ṣetọju ṣiṣeeṣe, iduroṣinṣin igbekalẹ, ati ikosile ọkan ọkan ni awọn ọjọ 12 ni aṣa.Ti a ṣe afiwe si Ctrl, afikun ti T3 ati Dex si awọn aṣa CTCM (MT) ni ilọsiwaju ṣiṣeeṣe ati ṣetọju awọn profaili transcription ti o jọra, iduroṣinṣin igbekalẹ, ati iṣẹ iṣelọpọ ti ara tuntun fun awọn ọjọ 12.Ni afikun, nipa ṣiṣakoso iwọn isan isan ara, a ṣẹda awoṣe hypertrophy ọkan ọkan ti o ni hyperextension nipa lilo STCM, ti n ṣe afihan iyipada ti eto STCM.O yẹ ki o ṣe akiyesi pe bi o tilẹ jẹ pe atunṣe ọkan ati fibrosis maa n kan awọn ẹya ara ti o niiṣe ti awọn sẹẹli ti n ṣaakiri le pese awọn cytokines ti o yẹ gẹgẹbi phagocytosis ati awọn atunṣe atunṣe miiran, awọn apakan ti okan le tun ṣe ilana ilana fibrotic ni idahun si wahala ati ibalokanjẹ.sinu myofibroblasts.Eyi ti ni iṣiro tẹlẹ ninu awoṣe bibẹ ọkan ọkan.O yẹ ki o ṣe akiyesi pe awọn paramita CTCM le ṣe iyipada nipasẹ iyipada titẹ / titobi itanna ati igbohunsafẹfẹ lati ṣedasilẹ ọpọlọpọ awọn ipo bii tachycardia, bradycardia, ati atilẹyin iṣọn-ẹda ẹrọ (ọkan ti a ko gbejade ẹrọ).Eyi jẹ ki eto naa jẹ agbejade alabọde fun idanwo oogun.Agbara ti CTCM lati ṣe apẹẹrẹ hypertrophy ọkan ti o ni idawọle pupọju ṣe ọna fun idanwo eto yii fun itọju ara ẹni.Ni ipari, iwadi ti o wa lọwọlọwọ ṣe afihan pe isanra ẹrọ ati imudara apanilẹrin jẹ pataki fun mimu aṣa ti awọn apakan ti ara ọkan ọkan.
Botilẹjẹpe data ti a gbekalẹ nibi daba pe CTCM jẹ pẹpẹ ti o ni ileri pupọ fun ṣiṣe awoṣe myocardium ti ko tọ, ọna aṣa yii ni awọn idiwọn diẹ.Ifilelẹ akọkọ ti aṣa CTCM ni pe o fa awọn aapọn imọ-ẹrọ ti o tẹsiwaju lori awọn ege naa, eyiti o ṣe idiwọ agbara lati ṣe atẹle ni itara lati ṣe abojuto awọn ihamọ bibẹ ọkan ọkan lakoko iyipo kọọkan.Ni afikun, nitori iwọn kekere ti awọn apakan ọkan ọkan (7 mm), agbara lati ṣe iṣiro iṣẹ systolic ni ita awọn eto aṣa nipa lilo awọn sensọ agbara ibile ti ni opin.Ninu iwe afọwọkọ ti o wa lọwọlọwọ, a bori aropin yii ni apakan nipa ṣiṣe iṣiro foliteji opitika bi itọkasi iṣẹ adehun.Bibẹẹkọ, aropin yii yoo nilo iṣẹ siwaju ati pe o le ni idojukọ ni ọjọ iwaju nipasẹ iṣafihan awọn ọna fun ibojuwo opiti ti iṣẹ ti awọn ege ọkan ninu aṣa, gẹgẹbi aworan agbaye nipa lilo kalisiomu ati awọn awọ ifamọ foliteji.Idiwọn miiran ti CTCM ni pe awoṣe ti n ṣiṣẹ ko ṣe afọwọyi aapọn ti ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ-ẹkọ.Ni CTCM, a ti fa titẹ ni awọn itọnisọna idakeji lati tun ṣe 25% isan ti ẹkọ iṣe-ara ni diastole (na ni kikun) ati systole (ipari ti ihamọ lakoko imudara itanna) ni awọn iṣan ti o tobi pupọ.Idiwọn yii yẹ ki o yọkuro ni awọn apẹrẹ CTCM iwaju nipasẹ titẹ to peye lori àsopọ ọkan ọkan lati ẹgbẹ mejeeji ati nipa lilo awọn ibatan iwọn-iwọn titẹ gangan ti o waye ni awọn iyẹwu ti ọkan.
Atunse ti o ni ifasilẹ pupọ ti a royin ninu iwe afọwọkọ yii ni opin si ṣiṣe awọn ifihan agbara hypertrophic hyperstretch.Nitorinaa, awoṣe yii le ṣe iranlọwọ ninu iwadi ti ifihan ifihan hypertrophic ti o fa isan laisi iwulo fun humoral tabi awọn nkan aiṣan (eyiti ko si ninu eto yii).Awọn ilọsiwaju siwaju sii ni a nilo lati mu isodipupo ti CTCM pọ si, fun apẹẹrẹ, iṣakojọpọ pẹlu awọn sẹẹli ajẹsara, awọn nkan apanilẹrin pilasima kaakiri, ati innervation nigbati iṣọpọ pẹlu awọn sẹẹli neuronal yoo mu awọn iṣeeṣe ti awoṣe arun pẹlu CTCM dara si.
Awọn ẹlẹdẹ mẹtala ni a lo ninu iwadi yii.Gbogbo awọn ilana ẹranko ni a ṣe ni ibamu pẹlu awọn itọnisọna igbekalẹ ati pe Ile-ẹkọ giga ti Ile-ẹkọ giga ti Ile-ẹkọ Ẹranko Louisville ti fọwọsi ati Igbimọ Lilo.A ti di aortic arch ati ọkan ti kun pẹlu 1 L ti cardioplegia ti ko ni ifo (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparin, pH to 7.4); Awọn ọkan ti wa ni ipamọ ni yinyin-tutu cardioplegic ojutu titi ti a gbe lọ si laabu lori yinyin ti o jẹ igbagbogbo <10 min. Awọn ọkan ti wa ni ipamọ ni yinyin-tutu cardioplegic ojutu titi ti a gbe lọ si laabu lori yinyin ti o jẹ igbagbogbo <10 min. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортиртировки в лабораторию на льду, что обыch Awọn ọkan ti wa ni ipamọ ni yinyin-tutu cardioplegic ojutu titi gbigbe si yàrá lori yinyin, eyi ti o maa n gba <10 min.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 мин. Jeki awọn ọkan lori yinyin cardioplegia titi gbigbe si yàrá lori yinyin, nigbagbogbo <10 min.
Ẹrọ CTCM naa ni idagbasoke ni sọfitiwia iranlọwọ-iranlọwọ kọnputa (CAD) SolidWorks.Awọn iyẹwu aṣa, awọn pipin ati awọn iyẹwu afẹfẹ jẹ ti ṣiṣu CNC ko o akiriliki.Iwọn afẹyinti 7mm ti iwọn ila opin jẹ ti polyethylene iwuwo giga (HDPE) ni aarin ati pe o ni iho o-oruka lati gba iwọn o-silikoni ti a lo lati di media labẹ.Membrane siliki tinrin ṣe iyapa iyẹwu aṣa lati awo iyapa.Ara ilu silikoni ti ge lesa lati 0.02 ″ dì silikoni ti o nipọn ati pe o ni lile ti 35A.Isalẹ ati awọn gasiketi silikoni oke jẹ ge lesa lati 1/16 ″ dì silikoni ti o nipọn ati ni lile ti 50A.316L irin alagbara, irin skru ati apakan eso ti wa ni lilo fun fasting awọn Àkọsílẹ ati ṣiṣẹda ohun airtight asiwaju.
Igbimọ Circuit titẹ ti a ti sọtọ (PCB) jẹ apẹrẹ lati ṣepọ pẹlu eto C-PACE-EM.Awọn sockets ẹrọ asopo ẹrọ Swiss lori PCB ti wa ni asopọ si awọn amọna graphite nipasẹ awọn okun onirin fadaka-palara idẹ ati awọn skru 0-60 idẹ ti a ti sọ sinu awọn amọna.Awọn tejede Circuit ọkọ ti wa ni gbe ninu awọn ideri ti awọn 3D itẹwe.
Ẹrọ CTCM jẹ iṣakoso nipasẹ ẹrọ amuṣiṣẹ pneumatic ti eto (PPD) ti o ṣẹda titẹ iṣọn-ẹjẹ iṣakoso ti o jọra si iyipo ọkan ọkan.Bi titẹ inu yara afẹfẹ ti n pọ si, awọ-ara silikoni ti o rọ ti npọ si oke, ti o fi agbara mu alabọde labẹ aaye ti ara.Agbegbe ti ara yoo jẹ ki o na nipasẹ itusilẹ omi yii, ti n ṣe apẹẹrẹ imugboroja ti ẹkọ-ẹkọ ti ọkan lakoko diastole.Ni tente oke ti isinmi, imudara itanna ni a lo nipasẹ awọn amọna graphite, eyiti o dinku titẹ ninu iyẹwu afẹfẹ ati fa ihamọ ti awọn apakan ara.Inu paipu ni a hemostatic àtọwọdá pẹlu kan titẹ sensọ lati ri awọn titẹ ninu awọn air eto.Iwọn titẹ ti sensọ titẹ ni a lo si olugba data ti o sopọ si kọnputa agbeka.Eyi ngbanilaaye ibojuwo lemọlemọfún ti titẹ inu iyẹwu gaasi naa.Nigbati titẹ iyẹwu ti o pọ julọ ti de (boṣewa 80 mmHg, 140 mmHg OS), ẹrọ imudani data ti paṣẹ lati fi ami kan ranṣẹ si eto C-PACE-EM lati ṣe ifihan ifihan foliteji biphasic fun 2 ms, ṣeto si 4 V.
Awọn apakan ọkan ti a gba ati awọn ipo aṣa ni awọn kanga 6 ni a ṣe gẹgẹbi atẹle: Gbigbe awọn ọkàn ti a ti ikore lati inu ọkọ gbigbe si atẹ ti o ni tutu (4 ° C.) cardioplegia.Abala ventricle osi ti ya sọtọ pẹlu abẹfẹlẹ ti o ni ifo ati ge si awọn ege ti 1-2 cm3.Awọn bulọọki àsopọ wọnyi ni a so mọ awọn atilẹyin tissu pẹlu alemora àsopọ ati gbe sinu iwẹ microtome titaniji ti o ni ojutu Tyrode ati atẹgun nigbagbogbo (3 g/L 2,3-butanedione monooxime (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g) .), 6 mM KCl (0.140M 1 g.M), 1 g, 0.1447 g. S (2.38 g), 1 mM MgCl2 (1 milimita 1 M ojutu), 1.8 mM CaCl2 (1.8 milimita 1 M ojutu), to 1 L ddH2O).A ṣeto microtome gbigbọn lati ge awọn ege nipọn 300 µm ni igbohunsafẹfẹ 80 Hz, titobi gbigbọn petele kan ti 2 mm, ati oṣuwọn ilosiwaju ti 0.03 mm/s.Awọn iwẹ tissu ti yika nipasẹ yinyin lati jẹ ki ojutu naa dara ati pe a tọju iwọn otutu ni 4°C.Gbigbe awọn apakan àsopọ lati ibi iwẹ microtome si iwẹ abeabo ti o ni awọn ojutu Tyrode ti o ni atẹgun nigbagbogbo lori yinyin titi ti awọn apakan ti o to ni yoo gba fun awo aṣa kan.Fun awọn aṣa transwell, awọn apakan tissu ni a so mọ awọn atilẹyin polyurethane 6 mm jakejado ati gbe sinu 6 milimita ti alabọde iṣapeye (alabọde 199, afikun 1x ITS, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkaline ati 2X antifungal antifungal).Imudara itanna (10 V, igbohunsafẹfẹ 1.2 Hz) ni a lo si awọn apakan iṣan nipasẹ C-Pace.Fun awọn ipo TD, T3 tuntun ati Dex ni a ṣafikun ni 100 nM ati 1 μM ni iyipada alabọde kọọkan.Alabọde naa ti kun pẹlu atẹgun ṣaaju ki o to rọpo ni igba mẹta ni ọjọ kan.A gbin awọn apakan ara ni incubator ni 37°C ati 5% CO2.
Fun awọn aṣa CTCM, awọn apakan tissu ni a gbe sori ẹrọ itẹwe 3D ti aṣa ni satelaiti Petri ti o ni ojutu Tyrode ti a ti yipada.Ẹrọ naa jẹ apẹrẹ lati mu iwọn bibẹ ti ọkan pọ si nipasẹ 25% ti agbegbe ti oruka atilẹyin.Eyi ni a ṣe ki awọn apakan ti ọkan ko ba na lẹhin gbigbe lati ojutu Tyrode si alabọde ati lakoko diastole.Lilo lẹ pọ histoacrylic, awọn apakan 300 µm nipọn ti wa titi lori oruka atilẹyin 7 mm ni iwọn ila opin.Lẹhin ti o so awọn apakan tissu pọ si oruka atilẹyin, ge awọn abala àsopọ ti o pọ ju ki o si fi awọn apakan ti o so mọ pada sinu iwẹ ti ojutu Tyrode lori yinyin (4ºC) titi awọn apakan ti o to ti pese sile fun ẹrọ kan.Lapapọ akoko sisẹ fun gbogbo awọn ẹrọ ko yẹ ki o kọja awọn wakati 2.Lẹhin ti awọn apakan 6 tissu ti wa ni asopọ si awọn oruka atilẹyin wọn, ẹrọ CTCM ti pejọ.Iyẹwu aṣa CTCM ti kun pẹlu 21 milimita iṣaaju-atẹsisọpọ.Gbe awọn apakan tissu lọ si iyẹwu aṣa ati farabalẹ yọ eyikeyi awọn nyoju afẹfẹ pẹlu pipette kan.Lẹhinna a ṣe itọsọna apakan tissu sinu iho ati ki o rọra tẹ sinu aaye.Ni ipari, gbe fila elekiturodu sori ẹrọ naa ki o gbe ẹrọ naa si incubator.Lẹhinna so CTCM pọ si tube afẹfẹ ati eto C-PACE-EM.Awọn pneumatic actuator ṣi ati awọn air àtọwọdá ṣi awọn CTCM.Eto C-PACE-EM ni a tunto lati fi 4V jiṣẹ ni 1.2 Hz lakoko pacing biphasic fun 2 ms.Alabọde naa yipada lẹmeji ọjọ kan ati pe a yipada awọn amọna lẹẹkan lojumọ lati yago fun ikojọpọ lẹẹdi lori awọn amọna.Ti o ba jẹ dandan, awọn abala tissu le yọkuro kuro ninu awọn kanga aṣa wọn lati yọkuro eyikeyi awọn nyoju afẹfẹ ti o le ti ṣubu labẹ wọn.Fun awọn ipo itọju MT, T3/Dex ni a fi kun titun pẹlu iyipada alabọde kọọkan pẹlu 100 nM T3 ati 1 μM Dex.Awọn ẹrọ CTCM ni a gbin ni incubator ni 37°C ati 5% CO2.
Lati gba awọn itọpa gigun ti awọn ege ọkan, eto kamẹra pataki kan ti ni idagbasoke.Kamẹra SLR kan (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Japan) ni a lo pẹlu Navitar Zoom 7000 18-108mm macro lẹnsi (Navitar, San Francisco, CA).Iworan ni a ṣe ni iwọn otutu yara lẹhin ti o rọpo alabọde pẹlu alabọde tuntun.Kamẹra wa ni ipo ni igun 51° ati fidio ti wa ni igbasilẹ ni awọn fireemu 30 fun iṣẹju kan.Ni akọkọ, sọfitiwia orisun ṣiṣi (MUSCLEMOTION43) ni a lo pẹlu Aworan-J lati ṣe iwọn iṣipopada awọn ege ọkan.A ṣẹda iboju-boju ni lilo MATLAB (MathWorks, Natick, MA, AMẸRIKA) lati ṣalaye awọn agbegbe ti iwulo fun lilu awọn ege ọkan lati yago fun ariwo.Awọn iboju iparada ti a pin pẹlu ọwọ ni a lo si gbogbo awọn aworan ni ọna fireemu kan lẹhinna kọja si plug-in MUSCLEMOTION.Išipopada iṣan nlo apapọ kikankikan ti awọn piksẹli ni fireemu kọọkan lati ṣe iwọn iṣipopada rẹ ni ibatan si fireemu itọkasi.Awọn data ti gbasilẹ, filtered ati lo lati ṣe iwọn akoko gigun ati ṣe ayẹwo isan isan ara lakoko ọmọ ọkan ọkan.Fidio ti o gbasilẹ ti ni ilọsiwaju lẹhin-lilo àlẹmọ oni-nọmba odo-ipese akọkọ-akọkọ.Lati ṣe iwọn isan isan (oke-si-tente), iṣayẹwo tente-si-tente ni a ṣe lati ṣe iyatọ laarin awọn oke ati awọn ọpọn ninu ifihan agbara ti o gbasilẹ.Ni afikun, detrending ni a ṣe ni lilo ilopọ aṣẹ 6th lati yọkuro fiseete ifihan agbara.A ṣe agbekalẹ koodu eto ni MATLAB lati pinnu iṣipopada àsopọ agbaye, akoko yipo, akoko isinmi, ati akoko ihamọ (koodu Eto Afikun 44).
Fun itupalẹ igara, ni lilo awọn fidio kanna ti a ṣẹda fun iṣiro isanwo ẹrọ, a kọkọ ṣe itopase awọn aworan meji ti o nsoju awọn oke išipopada (awọn aaye ti o ga julọ (oke) ati isalẹ (isalẹ) awọn aaye gbigbe) ni ibamu si sọfitiwia MUSCLEMOTION.Lẹhinna a pin si awọn agbegbe ti ara ati lo ọna kan ti algorithm shading si tisura ti a pin (Afikun Apọju. 2a).Lẹyin naa ni a ti pin àsopọ ti a pin si awọn abẹlẹ mẹwa, ati pe aapọn ti o wa lori oju kọọkan ni a ṣe iṣiro nipa lilo idogba wọnyi: Strain = (Sup-Sdown)/Sdown, nibiti Sup ati Sdown jẹ awọn aaye ti apẹrẹ lati oke ati awọn ojiji isalẹ ti fabric, lẹsẹsẹ (Figure Afikun. .2b).
Awọn apakan ọkan ti wa titi ni 4% paraformaldehyde fun awọn wakati 48.Awọn ara ti o wa titi ti gbẹ ni 10% ati 20% sucrose fun wakati kan, lẹhinna ni 30% sucrose ni alẹ kan.Awọn apakan naa lẹhinna ni ifibọ sinu idapọ iwọn otutu gige to dara julọ (ogba OCT) ati ni diėdiẹ di aotoju ninu iwẹ isopentane/gbẹ yinyin.Tọju awọn bulọọki ifisinu Oct ni -80 °C titi ipinya.Awọn ifaworanhan ti pese sile bi awọn apakan pẹlu sisanra ti 8 μm.
Lati yọ OCT kuro ni awọn apakan ọkan, gbona awọn kikọja lori bulọọki alapapo ni 95 °C fun iṣẹju 5.Ṣafikun milimita 1 milimita PBS si ifaworanhan kọọkan ati incubate fun ọgbọn išẹju 30 ni iwọn otutu yara, lẹhinna ṣaju awọn apakan nipa tito 0.1% Triton-X ni PBS fun awọn iṣẹju 15 ni iwọn otutu yara.Lati yago fun awọn aporo-ara ti kii ṣe pato lati dipọ si apẹẹrẹ, ṣafikun milimita 1 ti 3% ojutu BSA si awọn ifaworanhan ati incubate fun wakati kan ni iwọn otutu yara.BSA ti yọ kuro lẹhinna a ti fọ awọn ifaworanhan pẹlu PBS.Samisi ayẹwo kọọkan pẹlu ikọwe kan.Awọn egboogi alakọbẹrẹ (ti fomi 1:200 ni 1% BSA) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) ati troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) ni a fi kun ju iṣẹju 90 lọ, lẹhinna awọn oogun apa keji ti BSA ni a fi kun si awọn iṣẹju 90, lẹhinna awọn oogun apakokoro 1% ti BSA. 488 (Thermo Scientific; #A16079), lodi si ehoro Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) fun afikun 90 iṣẹju Fo 3 igba pẹlu PBS Lati ṣe iyatọ ibi-afẹde lati abẹlẹ, a lo nikan antibody secondary nikan bi iṣakoso. Nikẹhin, DAPI iparun ti a fi kun ati awọn slidess ti a fi sinu apo-iṣiro ti o niiṣe pẹlu Laboratoel. nification) ati Keyence maikirosikopu pẹlu 40x magnification.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) ni 5 μg/ml ni PBS ni a lo fun idoti WGA ati lo si awọn apakan ti o wa titi fun awọn iṣẹju 30 ni iwọn otutu yara.Lẹhinna a fọ ​​awọn ifaworanhan pẹlu PBS ati dudu dudu ti Sudan ti a ṣafikun si ifaworanhan kọọkan ati ki o ṣabọ fun ọgbọn išẹju 30.Lẹhinna wẹ awọn ifaworanhan pẹlu PBS ati pe a ṣafikun alabọde ifisinu vectashield.Awọn ifaworanhan ti wa ni wiwo lori maikirosikopu Keyence kan ni titobi 40x.
OCT ti yọ kuro ninu awọn ayẹwo bi a ti salaye loke.Lẹhin yiyọ Oct, immerse awọn kikọja ni Bouin ká ojutu moju.Lẹhinna a fọ ​​awọn ifaworanhan pẹlu omi distilled fun wakati kan ati lẹhinna gbe sinu ojutu Bibrich aloe acid fuchsin fun iṣẹju mẹwa 10.Lẹhinna a fọ ​​awọn ifaworanhan pẹlu omi distilled ati gbe sinu ojutu 5% phosphomolybdenum/5% phosphotungstic acid fun iṣẹju mẹwa 10.Laisi fifẹ, gbe awọn kikọja taara sinu ojutu buluu aniline fun iṣẹju 15.Lẹhinna a fọ ​​awọn ifaworanhan pẹlu omi distilled ati gbe sinu ojutu 1% acetic acid fun awọn iṣẹju 2.Awọn ifaworanhan ti gbẹ ni 200 N ethanol ati gbe lọ si xylene.Awọn ifaworanhan ti o ni abawọn ni a wo ni lilo maikirosikopu Keyence kan pẹlu ibi-afẹde 10x kan.Iwọn agbegbe Fibrosis jẹ iwọn nipa lilo sọfitiwia Oluyanju Keyence.
CyQUANT™ MTT Iṣaṣeṣeṣeṣeṣeṣeṣe sẹẹli (Invitrogen, Carlsbad, CA), nọmba katalogi V13154, ni ibamu si ilana ti olupese pẹlu diẹ ninu awọn iyipada.Ni pataki, punch abẹ kan pẹlu iwọn ila opin kan ti 6 mm ni a lo lati rii daju iwọn awọ ara aṣọ nigba itupalẹ MTT.Awọn ara ti a ṣe ni ẹyọkan sinu awọn kanga ti awo kanga 12 kan ti o ni sobusitireti MTT ninu ni ibamu si ilana ti olupese.Awọn apakan ti wa ni idabobo ni 37 ° C. fun awọn wakati 3 ati awọn ohun elo ti o wa laaye ti n ṣe metabolizes sobusitireti MTT lati ṣe apẹrẹ eleyi ti formazan.Rọpo ojutu MTT pẹlu 1 milimita DMSO ati incubate ni 37 °C fun awọn iṣẹju 15 lati yọ formazan eleyi ti lati awọn apakan ọkan.Awọn ayẹwo ni a ti fomi 1:10 ni DMSO ni 96-daradara awọn abọ isalẹ ti o han kedere ati kikankikan awọ eleyi ti wọn ni 570 nm nipa lilo oluka awo Cytation (BioTek).Awọn kika ni a ṣe deede si iwuwo ti bibẹ ọkan ti ọkan.
A rọpo media bibẹ ọkan pẹlu media ti o ni 1 μCi/ml [5-3H] -glucose (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) fun idanwo lilo glukosi gẹgẹbi a ti ṣalaye tẹlẹ.Lẹhin awọn wakati mẹrin ti abeabo, ṣafikun 100 µl ti alabọde si tube microcentrifuge ṣiṣi ti o ni 100 µl ti 0.2 N HCl.Lẹhinna a gbe tube naa sinu tube scintillation ti o ni 500 μl ti dH2O lati yọ [3H] 2O fun wakati 72 ni 37°C.Lẹhinna yọ tube microcentrifuge kuro lati inu tube scintillation ki o si fi 10 milimita ti omi scintillation kun.Awọn iṣiro scintillation ni a ṣe ni lilo Tri-Carb 2900TR olomi scintillation atupale (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA).Lilo glukosi lẹhinna ṣe iṣiro ni akiyesi [5-3H] - iṣẹ ṣiṣe kan pato glukosi, iwọntunwọnsi ti ko pe ati lẹhin, fomipo ti [5-3H] - si glukosi ti ko ni aami, ati ṣiṣe counter scintillation.Awọn data ti wa ni deede si iwọn ti awọn apakan ti ọkan.
Lẹhin isokan tissu ni Trizol, RNA ti ya sọtọ lati awọn apakan ọkan nipa lilo Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 ni ibamu si ilana ti olupese.Igbaradi ile-ikawe RNAsec, tito lẹsẹsẹ ati itupalẹ data ni a ṣe bi atẹle:
1 μg ti RNA fun apẹẹrẹ ni a lo bi ohun elo ibẹrẹ fun igbaradi ti ile-ikawe RNA.Awọn ile-ikawe ti o tẹle ni a ṣe ipilẹṣẹ nipa lilo Apo Igbaradi Ile-ikawe NEBNext UltraTM RNA fun Illumina (NEB, AMẸRIKA) ni atẹle awọn iṣeduro ti olupese, ati awọn koodu atọka ni a ṣafikun si awọn ilana abuda fun apẹẹrẹ kọọkan.Ni ṣoki, mRNA jẹ mimọ lati lapapọ RNA nipa lilo awọn ilẹkẹ oofa ti a so mọ pẹlu awọn oligonucleotides poly-T.Pipin ni a ṣe ni lilo awọn cations divalent ni iwọn otutu giga ni NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X).cDNA okun akọkọ jẹ iṣelọpọ ni lilo awọn alakoko hexamer laileto ati M-MuLV yiyipada transcriptase (RNase H-).Okun keji cDNA ti wa ni sisepọ nipa lilo DNA polymerase I ati RNase H. Awọn overhangs ti o ku ti yipada si awọn opin ti o ni idaniloju nipasẹ iṣẹ exonuclease/polymerase.Lẹhin adenylation ti 3 ′ ipari ti ajẹkù DNA, Adapter NEBNext kan pẹlu ọna lupu irun ti wa ni so mọ rẹ lati murasilẹ fun isọpọ.Fun yiyan awọn ajẹkù cDNA ti ipari ti o fẹ 150-200 bp.Awọn ajẹkù ile-ikawe ni a sọ di mimọ nipa lilo eto AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, USA).Lẹhinna, 3 μl USER Enzyme (NEB, USA) pẹlu cDNA ti o yan iwọn ti o ni asopọ pẹlu ohun ti nmu badọgba ni a lo fun awọn iṣẹju 15 ni 37 ° C ati lẹhinna fun awọn iṣẹju 5 ni 95 ° C ṣaaju PCR.PCR lẹhinna ni a ṣe pẹlu lilo Pusion High-Fidelity DNA polymerase, awọn alakoko PCR agbaye, ati awọn alakoko Atọka (X).Nikẹhin, awọn ọja PCR jẹ mimọ (eto AMPure XP) ati didara ile-ikawe ti a ṣe ayẹwo lori eto Agilent Bioanalyzer 2100 kan.Ile-ikawe cDNA lẹhinna ti ṣe lẹsẹsẹ ni lilo atẹle Novaseq kan.Awọn faili aworan aise lati Illumina ni iyipada si awọn kika aise ni lilo Npe Ipilẹ CASAVA.Awọn data aise ti wa ni ipamọ ni awọn faili ọna kika FASTQ(fq) ti o ni awọn ọna kika ati awọn agbara ipilẹ ti o baamu.Yan HISAT2 lati ba awọn ilana ti a yan ni ibamu si genome itọkasi Sscrofa11.1.Ni gbogbogbo, HISAT2 ṣe atilẹyin awọn genomes ti iwọn eyikeyi, pẹlu awọn genomes ti o tobi ju awọn ipilẹ bilionu 4 lọ, ati awọn iye aiyipada ti ṣeto fun awọn paramita pupọ julọ.Awọn kika kika lati inu data RNA Seq le jẹ deede deede ni lilo HISAT2, eto ti o yara julọ ti o wa lọwọlọwọ, pẹlu deede tabi deede to dara julọ ju eyikeyi ọna miiran lọ.
Ọpọlọpọ awọn iwe afọwọkọ taara ṣe afihan ipele ti ikosile pupọ.Awọn ipele ikosile Gene jẹ iṣiro nipasẹ opo ti awọn iwe afọwọkọ (iṣiro-tẹle) ti o ni nkan ṣe pẹlu genome tabi exons.Nọmba awọn kika ni ibamu si awọn ipele ikosile pupọ, gigun pupọ, ati ijinle titele.FPKM (awọn ajẹkù fun ẹgbẹẹgbẹrun awọn orisii ipilẹ ti iwe afọwọkọ ti o tẹle fun awọn orisii ipilẹ miliọnu) ni iṣiro ati awọn idiyele P-ti ikosile iyatọ ti pinnu nipa lilo package DSeq2.Lẹhinna a ṣe iṣiro oṣuwọn wiwa eke (FDR) fun iye P kọọkan nipa lilo ọna Benjamini-Hochberg9 ti o da lori iṣẹ R ti a ṣe sinu “p.adjust”.
RNA ti o ya sọtọ lati awọn apakan ọkan ti yipada si cDNA ni ifọkansi ti 200 ng/μl ni lilo SuperScript IV Vilo Master mix lati Thermo (Thermo, cat. no. 11756050).Pipo RT-PCR ti a ṣe nipa lilo ohun Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-daradara sihin lenu awo (Thermo, o nran. 4483319) ati microamp opitika alemora (Thermo, o nran. 4311971).Adalu ifaseyin jẹ 5 µl Taqman Yara Ilọsiwaju Titunto si idapọ (Thermo, ologbo # 4444557), 0.5 µl Taqman Alakoko ati 3.5 µl H2O adalu fun kanga.Awọn iyipo qPCR boṣewa ni a ṣiṣẹ ati pe awọn iye CT ni iwọn lilo Ohun elo Biosystems Quantstudio 5 ohun elo PCR gidi-akoko ( module 384-daradara; ọja # A28135).Awọn alakoko Taqman ni a ra lati Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss060901m1) mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss0424558) awọn apilẹṣẹ Apilẹṣẹ iye to deede.
Itusilẹ media ti NT-ProBNP ni a ṣe ayẹwo nipa lilo ohun elo NT-ProBNP (ẹlẹdẹ) (Cat. No. MBS2086979, MyBioSource) ni ibamu si ilana ti olupese.Ni soki, 250 µl ti ayẹwo kọọkan ati boṣewa ni a ṣafikun ni ẹda-ẹda si kanga kọọkan.Lẹsẹkẹsẹ lẹhin fifi apẹẹrẹ kun, ṣafikun 50 µl ti Assay Reagent A si kanga kọọkan.Rọra gbọn awo naa ki o si fi edidi di pẹlu sealant.Lẹhinna a ti fi awọn tabulẹti sinu 37 ° C fun wakati kan.Lẹhinna aspirate ojutu naa ki o si wẹ awọn kanga ni igba mẹrin pẹlu 350 µl ti ojutu 1X, fifa omi ojutu fun awọn iṣẹju 1-2 ni igba kọọkan.Lẹhinna ṣafikun 100 µl ti Assay Reagent B fun kanga kan ati di pẹlu edidi awo.Tabulẹti naa jẹ rọra mì ati ki o dabo ni 37°C fun ọgbọn išẹju 30.Ṣe itunnu ojutu naa ki o wẹ awọn kanga ni igba 5 pẹlu 350 µl ti ojutu fifọ 1X.Fi 90 µl ti ojutu sobusitireti si kanga kọọkan ki o di awo naa.Wọ awo ni 37 ° C fun awọn iṣẹju 10-20.Fi ojutu 50 µl Duro si kanga kọọkan.A ṣe iwọn awo naa lẹsẹkẹsẹ nipa lilo oluka awo Cytation (BioTek) ti a ṣeto ni 450 nm.
Awọn itupalẹ agbara ni a ṣe lati yan awọn iwọn ẹgbẹ eyiti yoo pese> 80% agbara lati ṣe awari iyipada pipe 10% ninu paramita pẹlu iwọn aṣiṣe 5% Iru I. Awọn itupalẹ agbara ni a ṣe lati yan awọn iwọn ẹgbẹ eyiti yoo pese> 80% agbara lati ṣe awari iyipada pipe 10% ninu paramita pẹlu iwọn aṣiṣe 5% Iru I. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат > 80% мощности ения параметра с 5% частотой ошибок типа I. A ṣe itupalẹ agbara lati yan awọn iwọn ẹgbẹ ti yoo pese> 80% agbara lati ṣawari iyipada paramita pipe 10% pẹlu iwọn aṣiṣe 5% Iru I.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I变化和5％I型给。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I变化和5％I型给。 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для обнару менения параметров и 5% частоты ошибок типа I. A ṣe itupalẹ agbara lati yan iwọn ẹgbẹ kan ti yoo pese> 80% agbara lati ṣe awari 10% iyipada paramita pipe ati 5% iru I oṣuwọn aṣiṣe.Awọn apakan apakan ni a yan laileto ṣaaju idanwo naa.Gbogbo awọn itupale jẹ afọju ipo ati awọn ayẹwo jẹ iyipada nikan lẹhin gbogbo data ti ṣe itupalẹ.Sọfitiwia GraphPad Prism (San Diego, CA) ni a lo lati ṣe gbogbo awọn itupalẹ iṣiro. Fun gbogbo awọn iṣiro, p-iye ni a kà ni pataki ni awọn iye <0.05. Fun gbogbo awọn iṣiro, p-iye ni a gba ni pataki ni awọn iye <0.05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Fun gbogbo awọn iṣiro, p-iye ni a gba ni pataki ni awọn iye <0.05.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Fun gbogbo awọn iṣiro, p-iye ni a gba ni pataki ni awọn iye <0.05.T-idanwo Ọmọ ile-iwe ti o ni iru meji ni a ṣe lori data pẹlu awọn afiwera 2 nikan.Ọna kan tabi ọna meji ANOVA ni a lo lati pinnu pataki laarin awọn ẹgbẹ pupọ.Nigbati o ba n ṣe awọn idanwo post hoc, atunṣe Tukey ni a lo si akọọlẹ fun awọn afiwera pupọ.Awọn data RNAsec ni awọn idiyele iṣiro pataki nigbati o ba ṣe iṣiro FDR ati p.adjust bi a ti ṣalaye ninu apakan Awọn ọna.
Fun alaye diẹ sii lori apẹrẹ ikẹkọ, wo Afoyemọ Ijabọ Iwadi Iseda ti o sopọ mọ nkan yii.